Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בתכשירי רקמת מעיים שנכרתו או "שקי מעיים" כמודל ex vivo של תפקוד מחסום המעי. מודל זה עשוי לשמש להערכת שלמות מחסום האפיתל ושכבת הג'ל הרירית באתרי מעיים ספציפיים במודלים של מחלות עיכול בבעלי חיים.

תקציר

המכשול אפיתל היא ההגנה מולדת הראשונה של מערכת העיכול באופן סלקטיבי מסדיר תחבורה מן לומן אל תאי הרקמה הבסיסית, הגבלת התחבורה של מולקולות קטנות יותר ברחבי האפיתל וכמעט לחלוטין האוסר תחבורה macromolecular אפיתל. סלקטיביות זו נקבעת ע"י שכבת ג'ל הרירי, אשר מגביל את התחבורה של מולקולות lipophilic ושניהם הקולטנים הפסגה ומכלולי חלבון junctional ההדוקים של האפיתל. במודלי תרבית תאים במבחנה של האפיתל הם נוחים, אבל כמודל, הם חסרים את המורכבות של האינטראקציות בין החיידקים, ג'ל רירי, האפיתל ואת המערכת החיסונית. מצד שני, in vivo הערכה של קליטה או חדירות מעי עשויה להתבצע, אבל אלה מבחנים למדוד כוללת קליטת עיכול, ללא ציון סגולי אתר. Ex vivo מבחני חדירות באמצעות "צקי מעיים"; הם שיטה מהירה ורגישה למדידת טוהר מידות מעיים הכלל או תחבורה השוואתית של מולקולה מסוימת, עם יתרון נוסף של סגוליות אתר מעיים. כאן אנו מתארים את הכנת שקי מעיים ללימודי חדירות והחישוב של חדירות לכאורה _{(אפליקציה} P) של מולקולה על פני מחסום המעי. טכניקה זו ניתן להשתמש כשיטה ספיגת תרופות בהערכת, או לבחון תפקוד מחסום האזורי אפיתל במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול.

מבוא

המכשול אפיתל במעי של מערכת העיכול הוא שטח הפנים הרירית מוערך ב -400 מ ^'2 ב המבוגר אדם. כתוצאה מכך, היא חשופה כל הזמן לאתגר מחיידקים, תרופות בליעה, חומרים מזינים רעלנים חיידקיים. המארח אסור להבדיל רק בין חיידקי commensal נסבלים פתוגנים פוטנציאליים, אבל חייב למנוע מינים אלה והמולקולות המופרשות שלהם לחצות את מחסום האפיתל, ואילו באותו הזמן המאפשר ספיגת מזון בגוף. לכן, את התפקיד של האפיתל במעי הוא לפעול כמחסום סלקטיבי לתכנים luminal ^1. זו המושגת, בין יתר, על ידי מערכת ביטחון אפיתל מולד בבית הרירי, אשר פועלת באמצעות מערכת ביולוגית תגובה המורכבת מנגנוני מכונן מושרים ^2.

אובדן תפקוד המחסום אפיתל היא פתולוגית אופיינית של מספר מחלות מערכת העיכול. בשנת vivoבחינת תפקוד המחסום אפיתל ניתן להעריך באמצעות gavage הפה של מולקולה נותב וניתוח בסרום לאחר ^3. עם זאת, הטכניקה הזו מציעה שום אינדיקציה לגבי האתר של תפקוד מחסום. במבחנה לשעבר vivo הערכת התנגדות transepithelial באמצעות מערכות Transwell ^{3 ו} Ussing תאי ^4,5 בהתאמה, מועסקים בכינויו סמנים פונדקאיים של תפקוד מחסום אפיתל, אך חסרים את פיזיולוגית המחלה התורמת של מודלים של בעלי חיים ^6. בפרוטוקול זה אנו מתארים מודל הכנת vivo לשעבר רקמות המאפשר הערכה ישירה ונקודות של שלמות מעיים אשר עשוי לשמש כדי להעריך תפקוד מחסום רירי בכמה רמות. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להחיל במודלים של בעלי חיים של מחלה, או עלולה להיות מניפולציות פרמקולוגית לאפשר בחקירה מעמיקה של תפקוד מחסום רירי.

פרוטוקול

כל עבודה חיה בפרוטוקול זה מבוצע תוך הקפדה אוניברסיטת ועדת האתיקה Animal ניוקאסל אישרה נהלים.

1. הכנת מכשירים, מדיה ותרבות ומנות

1. טרום חם Media 199 (TC199) או בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תקשורת ל -37 מעלות צלזיוס. טרום oxygenate המדיום ידי מבעבע עם 95% O _2/5% CO _2. בדוק כי מדיום יש pH סופי של 7.3.
2. כן תפר ידי חיתוך שני סעיפים 5 סנטימטרים לכל צק. Loop התפרים לתוך קשר לא סגור.

2. Dissection הכנה של מערכת העיכול

1. משיכת מזון 12 שעות מוצקות לפני המתת החסד. אם תרצה, למקם חיות על תוספי ג'ל מזינים במהלך הזמן הזה.
2. להרדים עכברים על ידי יתר נתרן pentobarbitone ([200 מ"ג / ק"ג], זריקה intraperitoneal) ואחריו נקע בצוואר הרחם בהתאם פרוטו האתיקה של המוסד הרפואיcols ולרסס 70% אתנול על הבטן ובית החזה.
3. בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי באמצע הבטן ולחשוף את הצפק.
4. המשך להפריד ואת להסיר את מערכת העיכול על ידי חיתוך במעי הדק העליון מהקיבה על סוגר השוער וחיתוך המעי גס על סף האנאלי. השתמש במלקחיים כדי להסיר לפדר בעדינות. מניחים את המעיים במדיום מראש חימם, מחומצן.
5. זהה את קטע המעי תוערך עבור חדירות (איור 1) וחותכים את החלק הזה בחינם משאר המעי.
   1. על מנת לשמור על עקביות בין בעלי חיים, למדוד קטעי התריסריון ביחס מְעִי צָם אל הקיבה, ולמדוד קטעי המעי הגס ביחס מעי כדי cecum.
   2. בעת בחירת קטעי רקמה, לציין את נוכחותו של רקמות הלימפה הקשורים ריריות כגון טלאים של Peyer. אלה יכולים להיות מזוהה הנהון קטןules בצד serosal של לומן.
   3. באמצעות מזרק 1 מ"ל, לשטוף את התוכן luminal בעדינות של קטע המעי לתוך צלחת פטרי עם PBS מחומם מראש (37 ° C). תוכן צואתי אלה עשויים להיות מושלכים או לאחסן ב -80 ° C לניתוח בעתיד לפי הצורך.

3. הכנת המעיים Sacs

1. הכן מזרק 1 מ"ל עם נפח 300 μl של המתחם הבדיקה או מולקולה. עבור שלמות הרירית, פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​של FITC-dextran M.Wt. 4,400 ניתן להשתמש. בדיקות החל 4,400-70,000 דה בגודל עשויות לשמש רגישות מוגברת. מאובטח להתאים קטטר וסקולרית חיה קטנה על המזרק.
2. מדוד 5 סנטימטרים מהפתח של קטע המעי ולקשור במגזר סגור היטב עם לולאת תפר בנקודה זו. בעדינות להניח לולאת תפר טרום קשורה סביב פתיחת המעי וכנס קטטר הקהה. משוך את החבל סגור כדי לאבטח את קטע המעיולשחרר את נפח 300 μl מן המזרק לתוך המעי, כדי להבטיח שכל הפתרון מוזרק.
3. בעדינות להסיר את הקטטר ובמקביל משיכת החבל תפר לאבטח סגירת שק מעיים. חותכים את שק מעיים רפויים מהמעי ומקום לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי מלא 20 מ"ל של מדיום מחומצן, שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.

4. מדידה של חדירות

1. צינורות חרוטי מקום המכיל את שקי מעיים באמבט מים חמים מוגדר 37 מעלות צלזיוס. ב 0, 30, 60, 90 ו -120 נקודות זמן דק, לקחת דגימת 100 μl מהצינור והעברת החרוטים לצלחת 96 באר, החלפת הנפח עם 100 μl של תקשורת טריה בכל מקרה לגופו.
2. אחרי המדגם הסופי נלקח, לחתוך צקים פתוחים בנקודת התפר לאורך אורכו של הקטע, חשיפת פני הרירית.
3. מדוד את האורך והרוחב של כל קטע מעי. אם desiאדום, צמד להקפיא את הפלחים ולאחסן ב -80 ° C עבור חלבון או לאנליזה ביוכימית, או לחלופין, חנות בתמיסת ייצוב RNA עבור מבחנים מולקולריים.
4. לבנות עקומת תקן של דילולי יומן עבור מולקולות מתויגות FITC בטווח שבין 1 ל 1 x ¹⁰ -6.
5. דגימות מדוד ותקנים FITC על הקורא צלחת ניאון, עירור FITC / פליטה: 495 ננומטר / 519 ננומטר.

5. חישוב חדירות לכאורה עבור כל שק הפרט מעיים

1. המרת יחידות זמן שני.
2. עבור כל נקודת זמן, לחשב את הריכוז מצטבר, Q
   
   Q _{t =} (C _{* t} V _r) + _(סכום ש _t * V _ים), איפה:
   
   _T Q = ריכוז מצטבר בזמן t
   _{T C} = ריכוז בזמן t
   V _r = נפח בצד המקבל
   _{סכום t} Q = סכום של כל _t Q הקודם
   _S = Vשנדגמו נפח
   
3. מגרש Q לעומת הזמן (T) ו לחשב את השיפוע: δQ / δt
4. חשבתי את החדירות לכאורה _{(אפליקצית} P)
   
   P _{האפליקציה} = (δQ / δt) / (א Co *), איפה:
   
   A = שטח של רקמה
   C ₀ = ריכוז ראשוני

תוצאות

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון שינויים אזוריים בתפקוד מחסום המעי במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול. באמצעות מדידת השטף של חללית paracellular פני הרירית לעבר שטחים שונים של מערכת עיכול ^7, את היושרה של צומת ההדוקים אפיתל ניתן להעריך. בנוסף, על ידי שינוי האופי של חללית paracellular על פי גודלן (איור 2) או הידרופוביות (איור 3), מידת הפרעות אפיתל, או על שלמות שכבת ג'ל הרירית, ניתן למדוד גם. העס...

דיון

הנה, יש לנו מפורטי הבידוד והכנה צקי מעיים להעריך תפקוד מחסום רירי vivo לשעבר. הכנות צק מעיים כבר נוצלו בעיקר במחקר של תרופות, בחינת ספיגת תרופות מועמד מעבר במעי. עם זאת, assay זה מתאים היטב באותה מידה לחקר מחלת מעיים. חדירות מעי עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לאזור והערכת אתר הספציפי של חדירות מאפשרות הבנה טובה יותר של החשיבות האזורית של שלמות רירית במחל עיכול. Assay הוא חזק בתנאים הפיסיולוגיים הנכונים, רקמות מבודדות נשארים קיימא עבור מורטם עד 6 שעות שלאחר. בעקבות המתת חסד,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דקנטל  תפר משי שאינו נספג	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	אין פנול אדום מכיוון שהדבר מפריע לפלואורסצנטיות
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	אין פנול אדום מכיוון שהדבר מפריע לפלואורסצנטיות
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich		שימוש ב-10 מ"מ במדיה
קתר כלי דם של בעלי חיים קטנים: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4,400 מגה-וואט	סיגמא אולדריץ'	FD-4
FITC-Dextran 20,000 מגה-וואט	סיגמא אולדריץ'	FD-20
FITC-Dextran 70,000 מגה-וואט	סיגמא אולדריץ'	FD-70