השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

Summary

פרוטוקול זה משווה את הזיקות היחסיות של שותפים מחייבים ל-GTPases ממשפחת Rho, כולל Rac1. in vivo, חלבונים קושרים Rac1 מתחרים על ממשק מחייב יחיד, שהקונפורמציה שלו מוכתבת על ידי נוקלאוטיד קשור. הנוקלאוטיד חשוב וקשה לשליטה בניסוי, בשל קצב ההידרוליזה הגבוה.

Abstract

בפרוטוקול זה אנו מדגימים שיטה להשוואת התחרות בין חלבונים קושרי GTPase. גישה כזו חשובה לקביעת יכולות הקישור של GTPases משתי סיבות: העובדה שכל האינטראקציות מערבות את אותו פנים של GTPases פירושה שיש לקחת בחשבון אירועי קשירה בהקשר של מתחרים, והעובדה שיש לשלוט גם בנוקלאוטיד הקשור פירושה שגישות קונבנציונליות כגון משקעים חיסוניים אינן מתאימות לביוכימיה של GTPase. הבדיקה מסתמכת על שימוש בחלבונים מטוהרים. Rac1 מטוהר המשותק על חרוזים משמש כחלבון הפיתיון, וניתן לטעון אותו בתמ"ג, גרסה שאינה ניתנת להידרוליזה של GTP או ללא נוקלאוטיד, כך שניתן יהיה לשלוט בשלב האיתות שיש לחקור. חלבוני הקישור שייבדקו מטוהרים מתאי יונקים, כדי לאפשר קיפול נכון, באמצעות תג GFP. השימוש באותו תג על שני החלבונים חשוב מכיוון שהוא לא רק מאפשר טיהור ופליטה מהירים, אלא גם מאפשר זיהוי של שני המתחרים עם אותו נוגדן במהלך הפליטה. המשמעות היא שניתן לקבוע במדויק את הכמויות היחסיות של שני החלבונים הקשורים זה לזה.

Introduction

השלד הציטולוגי של האקטין הקובע את הצורה, הקוטביות ותכונות הנדידה של תאי יונקים מווסת על ידי משפחת Rho של GTPases קטנים. GTPases ממשפחת Rho כוללים RhoA הממריץ התכווצות שלד תאים, Rac1 הממריץ הסתעפות אקטין ובלט ממברנה, ו-Cdc42 בעל השפעות דומות על פילמור אקטין ל-Rac1 וגורם להיווצרות פילופודיה ^1,2. פעילות האיתות של GTPase נקבעת על ידי קשירה של נוקלאוטיד, השולט על ההתכווצות וההרפיה של לולאות מתג I ומתג II המתווכות את אינטראקציות החלבון-חלבון עם הרגולטורים והאפקטורים כאחד. GTPases הקשורים לגואנוסין 5'-טריפוספט (GTP) מפעילים אפקטורים במורד הזרם, בעוד שהצורה הקשורה לגואנוסין 5'-דיפוספט (GDP) אינה פעילה. בתא, מחזורים של הידרוליזה GTP וחילופי נוקלאוטידים מאפשרים תחלופה מהירה של אותות GTPase הנחוצים לדינמיקה של השלד הציטולוגי. תחלופת הנוקלאוטידים מווסתת על ידי שלושה מנגנונים. גורמי חילופי נוקלאוטידים של גואנין (GEFs) מייצבים את ה-GTPase נטול הנוקלאוטידים, מזרזים את חילופי התמ"ג עבור GTP, ובכך מעוררים את פעילות האיתות של GTPase ^3,4. חלבונים המפעילים GTPase (GAPs) מזרזים הידרוליזה של GTP לתמ"ג, ובכך מעכבים את פעילות האיתות GTPase ⁵. מולקולות מבודדות כגון מווסת עיבוי כרומטין 2 (RCC2) ומעכבי דיסוציאציה של נוקלאוטידים גואנין (GDIs) מטשטשים את לולאות המתג ובמקרה של GDIs מסירים את ה-GTPase מהממברנה על ידי אינטראקציה עם זנב הפרניל ^6,7. כל אחד משלושת הסוגים של מולקולות רגולטוריות מקיים אינטראקציה עם לולאות המתגים, וכך גם האפקטורים במורד הזרם וכמה רגולטורי סחר כגון קורונין-1C ⁷. מטרת פרוטוקול זה היא למדוד תחרות על אתר הקישור של מתג I/II בין רגולטורים משוערים ומולקולות איתות במורד הזרם. יש לציין כי מבחני תחרות בודקים קשירה לאתר כריכה משותף, כך שפרוטוקול זה אינו מתאים לבדיקת אינטראקציות עם אתרים אחרים, כגון קשירה של GDI לזנב הפרניל.

העדינות של הבדלי הקונפורמציה בין צורות פעילות ולא פעילות, בשילוב עם האופי הגמיש של הנוקלאוטיד הקשורים, הקשו על חקר אירועי קשירת GTPase. תפקידו של הנוקלאוטיד הקשור פירושו שבדיקות קשירה קונבנציונליות כגון משקעים חיסוניים או תהודה של פלזמון פני השטח אינן מתאימות היטב לחקירה, מכיוון שלא ניתן לשלוט בנוקלאוטיד. מכשול זה מורכב על ידי החפיפה באתרי הקישור של GEFs, GAPs, אפקטורים, מולקולות מבודדות ומולקולות סחר, מה שמקשה על פירוש נתוני הקישור לאינטראקציה בודדת בהקשר של התחרות שתתרחש בתא. משקעים חיסוניים, במיוחד, נפגעים על ידי תחרות בין שותפים מחייבים, שכן בתנאים תאיים מסוימים, שותף מקשר אחד עשוי להיות מזוהה על חשבון כל האחרים, בעוד שבתנאים אחרים, שותף אחר עשוי לשלוט. האופי הדינמי של איתות GTPase חיוני לתפקוד GTPase ויש לקחת אותו בחשבון בעת ניתוח הקשרים בין אינטראקציות הקישור של רגולטורים שונים. ואכן, לאחרונה תיארנו מסלול שהסתמך במידה רבה על כריכה תחרותית. זיהינו את קורונין-1C כמולקולת סחר שנקשרה ללולאות המתג של GDP-Rac1 ⁷. באזורים עם פעילות נמוכה של GEF, הסחר יהיה דומיננטי, וירחיק את Rac1 מאזורים אלה. עם זאת, כאשר Rac1 מועבר לאזורים בתא שבהם פעילות ה-GEF גבוהה, ה-GEF יתחרה ב-coronin-1C, ובכך גם יפעיל את Rac1 וגם ימנע הסרה מתווכת קורונין-1C של Rac1 מאזור זה. המודל הולך רחוק יותר, מכיוון שפעולת ה-GEF מחליפה את התמ"ג ל-GTP, ומסיטה את שיווי המשקל עוד יותר מהקורונין-1C. כתוצאה מכך, ניתן להסביר את פעילות Rac1 לחלוטין במונחים של תחרות וזיקה יחסית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להשוואת הזיקות היחסיות של שותפי קישור שונים עבור GTPases קטנים, תוך שימוש ב-Rac1 כדוגמה. על ידי שימוש בגישת חלבון מטוהר, ניתן להרכיב שרשרת של אירועי איתות על ידי השוואה זוגית, בניסוי שבו ניתן לשלוט מקרוב בנוקלאוטיד הקשור

Protocol

1. טיהור של GTPase מתויג GST

1. תרבות E. זן coli כגון BL21 הפך עם pGEX-Rac1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 220 סל"ד, 500 מיליליטר של תקשורת autoinduction (25 מ"מ Na ₂ HPO _4, 25 מ"מ KH ₂ PO _4, 50 מ"מ NH ₄ Cl, 5 מ"מ Na ₂ SO _4, 2 מ"מ MgSO _4, 2 מ"מ CaCl _2, 0.5% גליצרול, גלוקוז 0.05%, 0.2% לקטוז, 5 גרם Tryptone, תמצית שמרים 2.5 גרם, 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין).
2. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס.
3. Resuspend גלולה חיידקים במגיבים מיצוי חלבון 20 מיליליטר, מעכבי פרוטאז 1x ודגירה של 20 דקות ב RT עם היפוך.
4. להבהיר את lysate ידי צנטריפוגה ב40,000 XG למשך 30 דקות.
5. להוסיף חרוזים מגנטיים 2 מיליליטר גלוטתיון, לשטוף עם פוספט שנאגרו המלוח (PBS: 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 1.8 מ"מ KH ₂ PO _4, 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl).
6. דגירה עבור שעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס.
7. לשטוף חרוזים טעונים חלבון ארבע פעמים עם 10 מיליליטר PBS, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
8. Resuspend חלבון טעון חרוזים ב 2 מיליליטר PBS ולאחסן ב -80 ° C ב 100 aliquots μl עד צורך.

2. ביטוי של חלבונים מחייב GTPase

1. היום לפני הניסוי, פלסמידים transfect קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged גרסאות של כל חלבון קושר GTPase ל- 75 סנטימטר ² בקבוק נפרד של HEK293T כדלקמן. לאימות של טעינת נוקלאוטיד, מתויג GFP transfect TrioD1 ל- 75 סנטימטר ² בקבוק שלישי של HEK293T.
   1. לדלל polyethylamine עד 1 מ"ג / מיליליטר ב 100 μl סטרילי 150 מ"מ NaCl.
   2. להוסיף polyethylamine המדולל 27 μl 223 μl מופחת תקשורת בסרום.
   3. להוסיף פלסמיד דנ"א מיקרוגרם 12 עד 250 μl מופחת תקשורת בסרום.
   4. דגירה צינור אחד עבור 2 דקות ב RT.
   5. מערבבים את polyethylamine וDNA מתערבב בצינור יחיד ומערבולת למשך 2 דקות.
   6. דגירה של 15-20 דקות ב RT.
   7. החלף את המדיה הצמיחה (נשר מדיה השתנה Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, ללא אנטיביוטיקה) על 90% HEK293T מחוברות עם 5 מיליליטר תקשורת צמיחה טרי.
   8. מוסיף את תערובת polyethylamine / DNA המשולב לבקבוק ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

3. טיהור של חלבונים מחייב GTPase

1. יש לשטוף את צלוחיות של תאי transfected בPBS ולנקז בקבוק במשך 5 דקות, aspirating נוזל חופשי.
2. לגרד את תאים ב500 חיץ תמוגה μl (50 מ"מ טריס-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x מעכבי פרוטאז) לצינור microfuge.
3. תאי Lyse על ידי ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. במהלך תמוגה, לשטוף שני המון חרוזים GFP-מלכודת 40 μl שלוש פעמים עם חיץ תמוגה טרי, חרוזים סדימנטציה ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף.
5. להבהיר lysates על ידי צנטריפוגה ב21,000 XG במשך 10 דקות.
6. העברה הבהירה lysate של כל אחד מחלבוני המתחרה להפריד חרוזים GFP-מלכודת שטפו ולאפשר חלבוני GFP-היתוך להיקשר לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס. שמור lysate מתאי ה- GFP-TrioD1 על קרח.
7. לשטוף חרוזים GFP-מלכודת נטענים פעמיים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8), 50 מ"מ NaCl, 0.7% (w / v) Nonidet P-40 ופעמים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl ₂ , סדימנטציה חרוזים ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף.
8. Elute חלבוני GFP-היתוך על ידי הוספת 40 μl 0.2 M גליצין (pH 2.5) וpipetting למעלה ולמטה במשך 30 שניות. מייד חרוזים משקעים ב21,000 XG במשך 60 של ונוזל להעביר צינור microfuge חדש המכיל 4 μl 1 M טריס- HCl (pH 10.4). לעשות את זה מהר כדי לצמצם את הפגיעה בחלבון המטוהר.
9. לנתח 1 μl של כל חלבון מטוהר על ידי כתם מערבי ובדיקה עם נוגדן אנטי GFP להקים תשואה היחסית באמצעות blott כמותייםing מערכת על פי הפרוטוקול של היצרן. לחלופין, לקבוע ריכוזי חלבון על ידי חומצת assay bicinchoninic (BCA), אבל זה מציג שגיאות אם החלבונים לא מגיבים עם assay באופן זהה או יש חלבונים מזהמים.
10. להשוות ריכוז חלבון טוחנת על ידי התוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl _2.

4. טעינת נוקלאוטיד של GTPase

1. להפשיר aliquot אחד חרוזים מגנטיים GST-Rac1, מוכנים בשלב 1.
2. קח 90 μl של חרוזים GST-Rac1 ולשטוף שלוש פעמים עם 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
3. מאגר לשאוב מחרוזים ולהוסיף 100 μl 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA.
4. לדברי האם התמ"ג, GTP או לא טעינת נוקלאוטיד נדרש לניסוי התחרות, להוסיף 12 μl 100 מ"מ תמ"ג, μl 12 10 מ"מ ג.א.anosine 5 '- [γ-thio] אדנוזין (GTPγS) או לא נוקלאוטיד לחרוזי GST-Rac1 60 μl.
5. לבקרות נוקלאוטיד-הטעינה, לפצל את חרוזים שנותרו לשלושה aliquots 10-μl ולהוסיף 2 μl 100 מ"מ תמ"ג, 2 μl 10 מ"מ GTPγS או לא נוקלאוטיד על צינור אחד.
6. דגירה תערובות חרוז למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
7. לייצב Rac1 מאוגד נוקלאוטיד על ידי תוספת של 1 M MgCl _2: 3 μl לתערובת הניסיונית (שלב 4.4), 0.5 μl לכל אחד מתערובות השליטה (שלב 4.5).

5. תחרות המחייבת.

1. הגדרה 6 צינורות microfuge, המכיל:
   200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl ₂
   חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7)
   חלבון 5 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע)
2. על צינור אחד, להוסיף חלבון B 0, 1, 2.5, 5, 10 או 20 μl מחייב Rac1 (חלבון מחייב משתנה). כרכים אלה מניחיםpproximately ריכוזי המניה שווים של חלבונים המחייבים קבועים ומשתנים וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים.
   1. התאם כרכים של חלבונים מחייבים A ו- B אם יש הבדלים גדולים בזיקות המחייבות של שני חלבונים ואת זה צריך להיקבע באופן אמפירי באמצעות החזרות הניסיוניות. מרכיבים את הנפח הכולל של התערובת מחייב 235 μl על ידי תוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl _2.
3. הגדר את צינור microfuge המכיל:
   200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl ₂
   חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7)
   חלבון 10 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע)
4. הגדרת התמ"ג, GTPγS ולא צינורות שליטת נוקלאוטיד:
   200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl ₂
   10 חרוזים Rac1 שליטת μl נטענים בשלב 4.5 עם תוצר, GTPγS או לא נוקלאוטיד והתייצבו בשלב 4.7.
   180 μl Hlysate EK293T GFP-TrioD1, מוכן כמו בשלב 3.6
   4 μl 1 M MgCl ₂
5. דגירה את התערובת לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס.
6. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl _2.
7. Elute מחויב חלבונים בμl 20 הפחתת חיץ מדגם (50 מ"מ טריס-HCl (pH 7), 5% SDS, גליצרול 20%, 0.02 מ"ג / מיליליטר bromophenol, 5% β-mercaptoethanol הכחול).

6. ניתוח של תחרות

1. לפתור 10 μl של החלבון הקשור (שלב 5.6) על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) וכתם מערבי.
2. דגירה הקרום על 4 מעלות CO / N מדולל 1/1000 בנוגדן אנטי-GFP בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, 0.1% Tween-20 לזהות שניהם מחייב חלבוני GTPase מתויגים.
3. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20.
4. דגירה הממברנה במשך 30 דקות ב RT בDyLight שניות נגד ארנב 800 מצומדות-נוגדן ondary, בדילול מלא 1 / 10,000 בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, Tween-20 0.1%.
5. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20.
6. סרוק את הקרום באמצעות מערכת הדמיה אינפרא אדום, שימוש בתוכנה למדידת עוצמת להקה על פי הפרוטוקול של היצרן.
7. עלילה עוצמת הלהקה של כל חלבון נגד נפח של המתחרה משתנה (חלבון B).
8. מחלקים את הנפח של מתחרה משתנה בנקודה שבה הקווים מצטלבים בנפח של מתחרה קבועה (חלבון, 5 μl) כדי לקבוע את יחס המתחרה שבשיווי המשקל מושגת.
9. לאימות מעמד נוקלאוטיד-טעינה, קרומי בדיקה לקינאז מופעל p21 1 (PAK1) (מפעיל) וה- GFP-TrioD1 (GEF), כמתואר בצעדים 6.1-6.6.

Results

פרוטוקול זה נועד לחשב את הזיקות היחסית של שותפים מחייבים Rac1, ללא הצורך לדעת את הריכוז המדויק של המתחרים (איור 1). קביעת ריכוז חלבון מציגה שגיאות וכאשר בוחנת את תחרות בין מולקולות במסלול איתות אינו נחוצה. עם זאת, חשוב לדעת כי יש שני מתחרים באותו ריכוז טוחנת בפתרונות המניות כדי לאפשר יחסים פשוטים שיחושבו בעת הוספת נפחים שונים לassay. יש לי 40 μl של חרוזים GFP-מלכודת יכולת מחייבת של ~ 300 pmol כך מחוברות 75 סנטימטר ² צלוחיות של מאוד לבטא בתאים יהיה להרוות את חרוזים, והתוצאה הוא שההכנות של שני חלבונים מחייבים השונים תהיה דומות לפני ההתאמה (איור 2 א). אם אחד מהחלבונים מבטא בצורה גרועה, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי טיהור חלבון שמן בקבוק אחד או יותר של תאים.

ss = "jove_content"> המחייב של רוב effectors GTPase ורגולטורים תלוי בנוקלאוטיד-הטעינה של GTPase הפיתיון, ולכן חשוב לבדוק אם הטעינה הייתה מוצלחת. טעינה יכולה להיות מאומת על ידי מזרז חלבונים מחייבים ידועים מlysates התא. חלבוני מפעיל, כגון לאגד PAK1 לGTP-Rac1 וניתן זירז בקלות מlysates וזוהו על ידי מערבי סופג ⁸ (איור 2). GEFs להיקשר מעדיף לנוקלאוטיד ללא GTPase לייצב את מצב המעבר. כGEFs הוא של שפע נמוך, בדרך כלל לא פעיל ולעתים קרובות למחוק גרוע, עדיף לביטוי יתר GEF או בר GEF לGTPase ללא נוקלאוטיד מבחן. אנו משתמשים לעתים קרובות ההומולוגיה, הזוגית הראשונה של שלישייה, הביע כהיתוך GFP (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (איור 2), אך כל GEF יעבוד. חלבונים שנקשרים לGTPase טעון התמ"ג הם נדירים יותר. לאחרונה דיווחו RCC2 כחלבון אחד כזה ^7, או תמ"ג טעינה יכולה להיות מאומת פשוט כמו בינדיng ללא GEF ולא מפעיל.

הפלט מהניסוי יהיה כתם מערבי המתאר את שני שותפים מחייבים מתויג GFP חייבים GTPase. על ידי שימוש בנוגדנים חד לזהות שני החלבונים, ניתן לקבוע את הריכוזים שבי כמויות דומות של שני המתחרים לאגד ולכן הזיקות יחסי להסיק. בדוגמא זו תחרות בין תחום המדחף של חלבון Rac1-הסחר, coronin-1C (Rac1 מחייב חלבון), וחלבון Rac1-sequestering, RCC2 (Rac1 מחייב חלבון B), הוא הוכיחו (איור 3 א). על ידי שימוש בנפח קבוע של מדחף coronin-1C (5 μl), והוספת כמויות הולכות וגדל של RCC2, אנו יכולים לראות מGFP למחוק הוא הגיע לשיווי המשקל שב1.25-2.5 μl של RCC2 (כוכבית), הוכחה כי RCC2 יש חזק זיקה לRac1 מ coronin-1C. על ידי מדידת עוצמת להקות באמצעות מערבי סופג כמותי, וזומם ערכים ממוצע לכל competitor, נקודת שיווי המשקל יכולה להיות מחושבת בצורה מדויקת על ידי זיהוי הכרכים שבעקומות מצטלבות (איור 3).

אחד המכשולים האפשריים לassay תחרות מוצלח הוא אם השותפים מחייבים לקשור זה לזה, כמו גם מחייב Rac1. ב+ 3 א B איור אנחנו מדגימים תחרות בין RCC2 ותחום המדחף של coronin-1C, ולא coronin-1C באורך מלא. הסיבה לשימוש בcoronin הקטוע היא שcoronin-1C גם נקשר RCC2 דרך תחום הזנב. כאשר אורך מלא coronin-1C הוא טיטרציה נגד RCC2, כריכה של שני החלבונים מזוהה, עקב היווצרות משולשת מורכבת, ולא תחרות (איור 3 ג). אם תחרות מתרחשת, הכריכה של חלבון אחד תגדל ואילו ירידות האחרות, וסך מחויב GFP-ההיתוך יישאר קבוע. במקרים בהם מורכב משולש יוצר יש צורך לחתוך אחד של החלבון קושר GTPase כך שcompetitors אינטראקציה כבר לא.

איור 1. זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה לקביעת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. אימות של חלבונים מטוהרים. () מטוהרים Rac1 מחייב חלבונים נותחו על ידי כתם מערבי, חיטוט באנטי-GFP כדי לקבוע את התשואה היחסית של שני החלבונים מתויג GFP. סוג זה של השוואה במהלך הניסוי מאפשר הריכוז של שני החלבונים להיות מותאם כך שיתאימו בניסוי המחייב. (ב) GDP, GTPγS ולא GST-Rac1 טעון נוקלאוטיד הודגר עם lysate מHEK293T להביע GFP-TrioD1 ומחויב חלבונים זוהו על ידי קשירת קשר לPAK1 אנדוגני או ביטוי יתר GFP-TrioD1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ניתוח כתם מערבי של חלבון ביחס מחייב. תפוקות דוגמא ממבחנים מחייב תחרות. טעון תמ"ג () Rac1 היה מעורב עם תחום מדחף 5 μl GFP-coronin-1C והגדלת נפחים של ה- GFP-RCC2 היו טיטרציה ב. ב חלבונים קשורים מערבי סופג לGFP, נושאים עם זיהוי ההפרש של שני החלבונים הם נמנעו ואות ה- GFP מדווחת יחס טוחנת בין שני חלבוני האיחוי. כוכביות לציין את יחסי תחרות על eitheצד r של נקודת שיווי המשקל. (ב) בעוצמות בנד של חלבוני היתוך GFP קשורים משלושה ניסויים בלתי תלויים נמדדו על ידי מערבי סופג כמותי, באמצעות נוגדנים משניים fluorophore מצומדות וממוצעים זממו כדי לחשב את הסכום של RCC2 הדרושים כדי להגיע לשיווי משקל. (C ) פלט דוגמא מניסוי שבו חלבוני Rac1 מחייבים להיקשר זה לזה ויוצרים מורכב משולש, ולא מתחרה. Rac1 היה מעורב עם GFP-RCC2 5 μl והגדלת נפחים של ה- GFP-coronin-1C באורך מלא טעון תמ"ג היה טיטרציה ב. הגידול בGFP-coronin-1C כבול ללא אובדן של ה- GFP-RCC2 כבול מציינת היווצרות מורכבת משולשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשוואת הזיקות היחסיות של זוגות של חלבונים קטנים קושרי GTPase. השלבים העיקריים הם הכנת חלבונים מטוהרים קושרי GTPase והעמסת הנוקלאוטידים של ה-GTPase. השימוש בחלבונים קושרי GTPase עם אותו תג GFP, מאפשר לקבוע במדויק את הריכוזים שבהם כמויות דומות של כל מתחרה נקשרות. השימוש ב-GTPase רקומביננטי טעון נוקלאוטידים מאפשר חקירה של תכונות הקישור של GTPase בתנאי פעילות ספציפיים. שלב זה הוא גם הרגיש ביותר מכיוון שנוקלאוטידים גם יעברו הידרוליזה וגם יתנתקו מה-GTPase אם תנאי המגנזיום לא נשמרים במדויק.

בתא, המספר הגדול של חלבונים קושרי GTPase בשילוב עם תחלופת הנוקלאוטידים המהירה מקשים על פירוש מסלולים כאלה. הפשטות של שיטה זו בהשוואת זוגות חלבונים קושרים בלבד ושימוש בתנאי העמסת נוקלאוטידים מבוקרים בקפידה מאפשרת להבהיר מסלולי איתות. עם זאת, החוזק הגדול ביותר של הפרוטוקול הוא גם החולשה הגדולה ביותר מכיוון שהוא פישוט של המצב in vivo . ניתן להשתמש במבחני תחרות כדי לבנות השערה חזקה, אך לאחר מכן יש לבחון זאת בתאים על ידי ניסויי נוקדאון.

ישנן שלוש תכונות שיש לקחת בחשבון בעת בחירת החלבונים קושרי GTPase המתויגים ב-GFP שישמשו בניסוי. ראשית, חלבוני ההיתוך חייבים להתבטא היטב בתאי יונקים, כגון HEK293T, שכן מבחני תחרות דורשים כמות סבירה של חלבון. שנית, חייב להיות אפשרי לטהר את החלבון הרקומביננטי ללא פירוק משמעותי, וכאשר הדבר אינו אפשרי, יש לשקול שיבוט של מקטע קושר GTPase. שלישית, שני החלבונים הקשורים ל-GTPase חייבים להיפתר זה מזה ב-SDS-PAGE כדי לאפשר ניתוח בסעיף 6.

ישנן מספר אזהרות פוטנציאליות לניסוי שצריך לקחת בחשבון, ואולי לטפל בהן:

דנטורציה אפשרית של חלבונים קושרי GTPase מטוהרים במהלך שלב פליטת החומצה או עיכוב סטרי על ידי תג GFP. בידינו, אלה לא היוו בעיה, אך חייבים להיבדק. ניתן לבדוק את החלבונים המטוהרים במבחנים פונקציונליים ¹⁰. קיימות כיום ערכות מסחריות לבדיקת פעילותם של GEFs או GAPs ללא צורך בנוקלאוטידים המסומנים באיזוטופים. חלבונים מבודדים, מטבעם, מגנים על GTPases מפני פעילות GEF או GAP, ולכן יכולים לשמש כמעכבים תחרותיים במבחני GEF או GAP המסחריים, כפי שעשינו בפרסום האחרון שלנו ⁷. המאפיין הרלוונטי של חלבונים המעבירים GTPase הוא היכולת לקשור את ה-GTPase, וניתן לבדוק זאת בקלות בבדיקה נפתחת. גישה חלופית לבדיקת תקינות החלבון הרלוונטית לכל חלבוני הקישור היא טיטראט חלבון שנפלט מחרוזי מלכודת GFP עם גליצין עם אותו חלבון שהוסר מחרוזי מלכודת GFP על ידי מחשוף אנזימטי. הניסוי ינותח על ידי בדיקת החלבון המתויג GFP והחלבון השסוע עם נוגדן כנגד החלבון עצמו. אם החלבון אינו ניזוק על ידי פליטה, יש להשיג שיווי משקל ביחס של 1:1. גישה זו תציין גם אם הנוכחות של תג ה-GFP עצמו פוגעת בתכונות הקישור של החלבון המועמד, אם כי זה דורש ייצור של מבנה עם אתר מחשוף אנזימטי בין התג לחלבון הקושר. בין אם החלבון נפגע על ידי התג או שלב הפליטה, ניתן לטפל בבעיה על ידי שינוי הפרוטוקול לשימוש בשיטת טיהור חלופית. במקום GFP, ניתן לתייג חלבונים קושרים באמצעות His, לטהר אותם באמצעות Ni-NTA ולנתח אותם באמצעות נוגדן כנגד ה-His-tag. המאפיין החשוב הוא ששני החלבונים הקושרים חייבים לחלוק תג משותף, אם כי, במידת הצורך, ניתן להוסיף שני תגים לחלבון, אחד לטיהור והשני לזיהוי.

הפרוטוקול נועד לחקור תחרות בין אינטראקציות עם תחומי המתג I/II. למרות שרוב האינטראקציות של GTPase מתווכות על ידי מוטיב זה, ישנם כמה יוצאים מן הכלל, בעיקר האינטראקציות של GDI הנקשרות לזנב הפרניל, כמו גם טשטוש תחומי המתג. באופן עקרוני, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש ב-GTPase מטוהר מתאי יונקים, כך שה-GTPase יעבור טרום-נילט, עם זאת, נוכחותם של אתרי קשירה מרובים או השפעות אלוסטריות מסבכות את הפרשנות של נתונים קושרי תחרות. בעיות נוספות הקשורות לשינוי כזה הן ש-GDIs מטהרים במשותף עם GTPase מתאי יונקים, מה שפוגע בטוהר החלבונים המבודדים ובאופי ההידרופובי של קבוצות הפרניל, פירושו ש-GTPases prenylated קשורים ל-GDI או לממברנת השומנים וגורמים כאלה יצטרכו להילקח בחשבון בניסוי.

כמות ה-GST-Rac1 המשמשת בבדיקה. חלבון הקישור הקבוע של GTPase חייב להיות בריכוז גדול יותר מה-Rac1, או כאשר מוסיפים את המתחרה, הוא פשוט ייקשר ל-Rac1 חופשי. יהיה ברור מיד אם זה קרה מכיוון שקשירה של המתחרה, ללא אובדן של החלבון הקבוע, תתגלה באותו אופן כמו כאשר שני החלבונים המתחרים נקשרים זה לזה כפי שמוצג באיור 3B. כבקרה נוספת (שלב 5.3), יש לכלול תגובת קישור המכילה כמות כפולה של חלבון קושר קבוע וללא חלבון קושר משתנה (שלב 5.3). אם ה-Rac1 בניסוי הטיטרציה רווי, הכפלת כמות חלבון הקישור הקבוע לא תשפיע על הפלט. הנפחים המוצעים בפרוטוקול צריכים להיות מתאימים, אך ניתן להפחית את כמות ה-Rac1 בקלות. אם נצפתה קשירה של המתחרה ללא אובדן של שותף הקישור הקבוע, יש לנסות להפחית את כמות ה-Rac1 לפני שמנסים למפות אתרי קשירה כדי למנוע היווצרות מורכבת משולשת.

אינטראקציה לא ספציפית של חלבונים קושרי GTPase עם ה-GST או החרוז, כמו גם באופן ספציפי עם Rac1. בעיה זו תתבטא בקישור שיורי של החלבון קושר ה-GTPase הקבוע, גם כאשר החלבון המשתנה קושר GTPase הגיע לרמה בריכוז גבוה. זיהוי בעיה זו יסייע על ידי ביצוע ניסויים הדדיים שבהם מוחלפים החלבונים הקבועים והמשתנים הקשורים ל-GTPase. ניסויים הדדיים גם ישפרו מאוד את הדיוק של אומדן נקודת שיווי המשקל, ולכן יש לכלול אותם תמיד. במקרים של קשירה לא ספציפית, עדיין ניתן לחשב את הריכוזים היחסיים שבהם מושג שיווי משקל על ידי השוואת עוצמת הפס בין המקסימום למינימום עבור כל חלבון, או על ידי מדידת מידת הקישור הלא ספציפי על ידי שימוש בחרוזי GST כפיתיון, במקום GST-Rac1.

יש להשתמש במבחני משיכה באמצעות תנאי העמסת נוקלאוטידים שונים כדי להשלים את מבחן התחרות המתואר בפרוטוקול זה. קביעת העדפת הנוקלאוטידים של שותפים חשובה הן להבנת אירועי התחרות והן להבנת מסלול האיתות בו מעורב החלבון קושר ה-GTPase. באיור 2B אנו מנתחים קשירה של חלבונים עם העדפה מבוססת ל-GTPase טעון GTP או נטול נוקלאוטידים כאמצעי לאימות העמסת נוקלאוטידים. עם זאת, הגיוני לחקור גם את השפעת העמסת הנוקלאוטידים על כל אחד מהמתחרים. אם המתחרים ההיפותטיים מראים העדפות שונות, התחרות תתרום פחות למסלול האיתות, ואכן תחלופת נוקלאוטידים עשויה להיות המנגנון המכוון את חילופי החלבונים הקושרים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
מעכב פרוטאז שלם	Roche	05 056 489 001
חרוזים מגנטיים גלוטתיון	פירס	88821
פוליאתילנימין, מסועף, ממוצע Mw ~ 25,000	סיגמא אולדריץ'	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dubbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	מאוד לא יציב. Aliquot ולאחסן ב-80- מיד עם הבנייה
מחדש GTPγ S	Sigma Aldrich	G8634	מאוד לא יציב. Aliquot ואחסן ב -80 מיד עם הבנייה
מחדש חסימת מאגר	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
נוגדן נגד GFP	צבעים חיים	632592	שימוש ב 1/1000 דילול
DyLight 800 מצומד עז אנטי ארנב נוגדן משני	Fisher Scientific	10733944
נוגדן Anti-PAK1	איתות סלולרי	2602S	שימוש בדילול 1/1000
מערכת הדמיה אינפרא אדום Odyssey SA	Li-cor	9260-11PC