מאמר שיטה

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

DOI:

10.3791/53271

⸱

10 באוגוסט 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר דה-סלולריזציה של כליות חולדות Sprague Dawley על ידי זלוף קדמי של חומרי ניקוי דרך כלי הדם, ויוצר מטריצות חוץ-תאיות של כליות המשמשות כתבניות לאכלוס מחדש עם תאי אפיתל כליה אנושיים. רסלולריזציה ושימוש בבדיקת זלוף רזזורין לניטור הצמיחה מבוצעים בתוך ביו-ריאקטורים זלוף שתוכננו במיוחד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הדור של acellular, עדיין פיגומי biofunctional, כליות מטריצה ​​תאית (ECM), כי הם שימושיים כמו מצעי דגם בקנה מידה קטנה לפיתוח רקמות איבר בקנה מידה. כליות עכברוש ספראג Dawley הם cannulated ידי החדרת צנתר לעורק הכליה וperfused עם סדרה של חומרי ניקוי נמוך ריכוז (Triton X-100 וסולפט dodecyl נתרן (SDS)) מעל 26 שעות כדי להפיק פיגומים עם שלם ללא פגע, כל-הכליה כלי דם perfusable, glomeruli, וtubules כליות. בעקבות decellularization, פיגום הכליות ממוקם בתוך כלי bioreactor זלוף אישית מעוצב, ועורק הכליה צינתור מחובר למעגל זלוף הכולל: משאבת peristaltic; צינורות; ובדיקות אופציונליות עבור pH, חמצן מומס, ולחץ. לאחר חיטוי הפיגום עם חומצת peracetic ואתנול, ואיזון רמת החומציות (7.4), פיגום הכליה מוכן לזריעה באמצעות טפטוף של מדיום התרבות בתוך largחממת דואר קיבולת נשמרה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ארבעים מיליון אפיתל צינורי קליפת המוח תאי כליה (RCTE) מוזרקים דרך עורק הכליה, ומהירות perfused דרך הפיגום תחת זרימה גבוהה (25 מיליליטר / דקה) ולחץ (~ 230 מ"מ כספית) במשך 15 דקות לפני הפחתת הזרימה לשיעור פיסיולוגי (4 מיליליטר / דקה). תאי RCTE בעיקר לאכלס את הנישה ECM צינור בתוך קליפת הכליה, להתרבות, וליצור מבני אפיתל צינורי בשבעה ימים של תרבות זלוף. פתרון resazurin 44 מיקרומטר במדיום תרבות perfused דרך הכליות עבור שעה 1 בחילופים בינוניים לספק הערכת fluorometric, המבוסס על חיזור חילוף חומרים של כדאיות תא ושגשוג במהלך tubulogenesis. Bioreactor זלוף הכליות מאפשר דגימה לא פולשנית של מדיום להערכה ביוכימי, ויציאות כניסה מרובות לאפשר זריעת מדרדר חלופית דרך הווריד או השופכן כליות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לrecellularize פיגומי כליות עםמגוון רחב של סוגי תאים, כולל אנדותל כלי דם, אפיתל צינורי, וfibroblasts סטרומה, להערכה מהירה בתוך מערכת זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שמספר חולים הסובלים מאי ספיקת כליות סופנית ממשיך להגדיל, יש מחסור חמור וגובר במספר כליות תורם זמינים להשתלה. חוסר היכולת לעמוד בביקוש של מספר עולה הרף של מועמדים ברשימת הממתינים להשתלת כליה גרמה מחקר בהנדסת איבר כליות עם המטרה הסופית של פיתוח מותאם אישית, שתלי כליה מושתלים בביקוש 1,2. בניית רקמות כליה מתפקדות מהתאים של חולה היה מבטלת את הצורך בדיכוי חיסוני לכל החיים, להקטין את כמות זמן חולים מוציאים על דיאליזה מחכים להשתלת כליה, ולהרחיב את ההשתלה להצלת חיים ליותר חולים עם מחלת כליות כרונית.

הצעד הראשון לקראת ביו-הנדסת רקמות כליה באמצעות תאים שמקורם בחולה הוא לפתח פיגום שמשמש כמצע תומך לparenchyma כליות (למשל epithe צינוריליאל), פיברובלסטים סטרומה, וצמיחת תאי כלי דם. יש לי פיגומים ביולוגי המופקים ממטריצות איבר טבעי תאיים (ECMS) כמה מאפיינים שהופכים אותם רצויים לשימוש בהנדסת רקמות, כולל ההרכב הביולוגי הטבעי שלהם; מאקרו ומייקרו המתאימים להעניק תפקוד פיסיולוגי; והתאמה ביולוגית סלולרית, קידום הידבקות תא, הגירה, ורקמה בונה שיפוץ 3. שיטה מבטיחה לייצר פיגומים לשחזור רקמות כליה היא באמצעות decellularization של כליות אלוגנאית או xenogeneic שלשמר הרבה של הרכב החלבון טבעי המורכב של ECM הכליות 4, לשמר את המורכבות אדריכליות הגלומות של האיבר, ולהתגבר על הקושי קשור לישבנים עד הנדסת רקמות cellularized העבות על ידי מתן אספקת דם לתאי פיתוח לאחר recellularization הפיגום 5.

decellularization זלוף הוא תהליך בחומרי ניקוי, אנזימים, או פתרונות הפוגעים בתאים אחרים שמועברים באופן אחיד דרך רשת כלי הדם של האיבר 6. אסטרטגיה זו כבר נקבעה כתהליך יעיל להפיק פיגומי ECM מבוסס איבר acellular כשלושה ממדים (3D), תבניות ביולוגיות להנדסה כל-איבר 6-8, כפי שמעיד על ההתפתחות של תבניות כליות acellular מכליות אדם מושלכות 9 וכליות xenogeneic התקבלו מבעלי החיים גדולים (למשל חזיר 10, עז 11) ומקורות 12 מכרסמים. בפרט, השימוש במודלים של בעלי חיים קטנים כגון מכרסמים דורשים פחות תאים ותקשורת ותרבות, שהוא מועיל במיוחד ללימודי recellularization האיבר שבו מספרים סלולריים מוגבלים בדרך כלל, כמו במקרה עם רקמות המופקים מתאי גזע. המטרה של פרוטוקול decellularization המתואר היא לייצר ECM כליות acellular שיכול לשמש כמערכת פיגומי 3D להתחדשות של structur הכליותes, כולל tubules נפרון שאוכלסו מחדש בדוגמא הנוכחית עם אפיתל צינורי קליפת המוח כליות אדם תאים (RCTE). אנחנו שתוארו קודם לכן ההערכה הקפדני שלנו של פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על חומרי ניקוי decellularization כליות עכברוש 7, שהוא מהיר יותר (יום בערך) יותר מאשר בשיטות אחרות שדווחו בעבר (רוס ואח '.- 5 ימים 12, שיר ואח' .- 4.5 ימים 13), וחושף את האיבר לריכוז נמוך משמעותי (0.1%) של סולפט dodecyl נתרן denaturant (SDS) במהלך decellularization מדיווחים קודמים 12-15.

מספר מצומצם של מחקרים שתיארו את השימוש בכליות מכרסמי decellularization והשימוש הבא כפיגום 3D לאכלוס סלולארי (ביקורת במקומות אחרים 1) 12-16. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה שלנו הוקמה בעבר, האופטימלית decellularization לייצור פיגומי כליות acellularמכליות עכברוש ספראג Dawley 7. באמצעות bioreactors זלוף אישית מעוצבת מסוגל תרבות זלוף הכפולה זריעה ותחזוקת 17, אנחנו recellularize פיגומי כליות acellular עם תאי RCTE אנושיים, אשר באופן עקבי לאכלס מחדש את רכיב צינורי במטריצות decellularized אלה, להתרבות, ולשרוד בתרבות זלוף במשך יותר משבוע. בנוסף, אנו מראים השימוש של assay זלוף resazurin - שאינן רעילה לתאים זולים, וההערכה מטבולית לא פולשנית שימש בעבר לרעיל לומד 17 - כדי לספק אינדיקציה לכדאיויות תא ושגשוג בתוך כליות recellularized לאורך זמן 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסר של אתיקה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

Decellularization 1. הכליות

  1. הכן את פתרונות decellularization. הכינו את הכרכים של ריאגנטים הבאים עבור כל כליה שdecellularized, בתוספת נפח אחד נוסף (למשל, עבור 4 כליות, להכין 5,000 מיליליטר Triton X-100 לצעד 1.1.3.):
    1. הכן 500 מיליליטר המים אוסמוזה הפוכה (ROH 2 O). הערה: לחלופין, מים ללא יונים ניתן להשתמש בשלבים שבי ROH 2 O מצויינים.
    2. הכן 1,000 מיליליטר Triton X-100, 1% (V / V) בROH 2 O. לאט לאט להוסיף 10 מיליליטר טריטון X-100-990 מיליליטר מים בכוס גדולה תחת ערבוב מהיר על צלחת ומערבבים. לאפשר מגיב לפזר לגמרי לפני השימוש (לפחות 10 דקות).
    3. הכן 1,000 מיליליטר Triton X-100, 1% (V / V) בROH 2 O (ספטמברarate נפח).
    4. הכן 1,000 סולפט מיליליטר נתרן dodecyl (SDS), 0.1% (V / V) בROH 2 O. לאט לאט להוסיף 5 מיליליטר SDS (20% מניות פתרון) למיליליטר מים 995 בכוס גדולה תחת ערבוב מהיר על צלחת ומערבבים. לאפשר מגיב לערבב אחיד לפני השימוש (לפחות 10 דקות).
    5. הכן 500 מיליליטר ROH 2 O (נפח נפרד).
  2. הכן כליות לdecellularization.
    1. לשחזר כליות מעכברוש ספראג Dawley זכר (ז 250-300) כפי שתואר קודם לכן 7.
      1. להרדים את העכברוש בזריקת intraperitoneal של pentobarbital (50 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). לעתים קרובות לבדוק את עומק ההרדמה (כל 10-15 דקות) על ידי ניטור תפקוד נשימה, קצב לב, ותגובת קמצוץ הבוהן במהלך ניתוח. אם בעל החיים יש קצב נשימה מוגבר או רפלקס דוושה חיובי, לנהל מינון משלים (עם 1/3 ל1/4 של המינון הראשוני) של pentobarbital.
      2. בצע abdomina קו האמצע אורךחתך l לחשוף את הכליות, אב העורקים בבטן, ווריד הנבוב הנחות.
      3. הזרק 2,000 יחידות הפרין USP / קילוגרם משקל גוף לוריד הפין.
      4. לגייס שתי הכליות על ידי נתיחה עדינה. זהירות להפריד הכליות משומן perirenal, תוך שמירה על הקפסולה הכליות המקיפה את הכליה בשלמותה. Perfuse הכליות עם מי מלח קר (10 מיליליטר) דרך אב העורקים בבטן אינפרא כליות.
    2. הכנס קטטר 24 מד לתוך עורק הכליה, בחוזקה ולקשור את הקטטר לעורק, ו( באמצעות מזרק) בעדינות perfuse הכליות עם 10 מיליליטר פוספט שנאגרו מלוח קר (PBS) לברור לחלוטין האיבר של דם.
    3. לטבול את הכליות ב 25 מיליליטר PBS בתוך צלחת פטרי ומקום במקפיא C -20 ° להקפיא בהדרגה את האיבר (ובכך גרימת תמוגה תא) לאחסון עד decellularization.
      הערה: אם רוצה, וריד שופכן ו / או כליות יכול להיות גם cannulated לזריעה מדרדר, אם כי לא תאר בתיפרוטוקול של.
    4. לגמרי להפשיר את הכליות הקפואות (equilibriate בטמפרטורת חדר (RT)), ובעדינות perfuse עם 10 מיליליטר של PBS כדי לבדוק את עורק הכליה ligated להדלפות. אם הדלפות או התנגדות משמעותית הם נצפו, מחדש קטטר עורק הכליה.
  3. הכן ציוד לdecellularization. להרכיב את מערכת זלוף decellularization כמתואר באיור 1.
    1. חבר "אורכו של צינור משאבת peristaltic (איור 1D, ו) לשני אורכים מספיק (> 36" אחד 8 מומלצים) של 1/16 "צינורות פנימיים בקוטר (ID) גומי סיליקון (1D איור, ח). השתמש בשני מנעול Luer זכר ל1/8 "מתאמי תיל הצטרפו נקבה אחת Luer x מתאם Luer נקבה להצטרף מגזרים של צינורות (איור 1D, י). הכנס מנעול Luer זכר נוסף ל1/8 "מתאם תיל (1D איור, ג) לסוף במורד הזרם של קו זלוף לקובץ מצורף לכליותצנתר עורקים.
    2. חבר כל מגזר צינורות משאבת peristaltic לראש משאבת 4 רולר-שימוש במחסנית משאבה גדולה.
    3. לאחר שהניח את הסוף במעלה הזרם של צינור גומי סיליקון במאגר הפתרון הראשון (ROH 2 O), החזק את לחצן "ראש" לראש מלא כל מעגל זלוף עם פתרון. קריטי: ודא שאין בועות תישארנה בפח בצינור, וכי בסופו במעלה הזרם (משמאל הפתוח לצייר נוזל) של צינור גומי סיליקון מאובטח מתחת לממשק נוזל האוויר של המאגר מגיב, כמתואר באיור 1.
  4. בצע את פרוטוקול decellularization בשעה 7 RT.
    1. חבר את הקטטר עורק הכליה של כל כליה מופשר לסוף צינור מעגל זלוף במורד הזרם מהמשאבה, להבטיח כי אין בועות אוויר כלואות בקטטר. לאפשר לכליות להיות מושעים לאורך הקיר הפנימי של כוס 5 L (מאגר אוסף perfusate ריק, ראה איור1B יור), כך שעורק הכליה אינו מפותל או מפותל.
    2. התאם את כונן המשאבה עד 5 מיליליטר / דקה, ולחץ על הכפתור "התחל". ודא שכל כליה היא מרוססת על ידי התבוננות בטפטוף פתרונות מהחלק התחתון של האיבר.
    3. Perfuse כל כליה עם ריאגנטים הבאים כמתואר באיור 1 א
      1. Perfuse עם 500 מיליליטר ROH 2 O ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, 40 דקות.
      2. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 1% Triton X-100 ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 3, 20 דק '.
      3. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 1% Triton X-100 ב 1 מיליליטר / דקה במשך 16 שעות, 40 דקות.
      4. Perfuse עם 1,000 מיליליטר 0.1% SDS ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 3, 20 דק '.
      5. Perfuse עם 500 מיליליטר ROH 2 O ב 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, 40 דקות.
        הערה: כל כליות decellularized עשויות להיות מאוחסנים בPBS (ללא תוספים) בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס עד למקסימום של שבועיים לפני השימוש.

2. להיתוך bioreactor העצרת, עיקור כליות, והכנה לRecellularization

  1. הכן כלי bioreactor.
    1. שטוף את מאגרי bioreactor הזכוכית (רכיב גוף) וראשי bioreactor עם חם, לדלל פתרונות מנה חומרי ניקוי (למשל. 1% פתרון נוזל לניקוי כלים במים ברז) ולשטוף היטב במים ברז ולאחר מכן ROH 2 O. לאפשר רכיבים להתייבש לחלוטין.
    2. החל נפח קטן (~ 5 מיליליטר) של siliconizing מגיב לחלק התחתון של כל מאגר. ודא שמגיב מרטיב את כל המשטח התחתון לכמה שניות, ואז לנקז את נוזלים עודפים.
    3. לאפשר המאגרים לייבוש במנדף ב RT O / N. לחלופין, מאגרים עשויים להיות מיובשים בתנור על 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לזרז ייבוש ולשפר את העמידות של הציפוי, אשר נועד למנוע התקשרות של תאים לחלק התחתון של מאגר bioreactor הזכוכית.
  2. הכן רכיבי מעגל זלוף לעיקור (איור1D).
    1. חותך את האורכים הבאים של צינורות (עבור כל bioreactor):
      1. חותך שני 25 "באורכים של 1/16" צינור גומי סיליקון ID (1D איור, ח).
      2. לחתוך באורך אחד 8 "של צינורות משאבת peristaltic (איור 1D, ו).
      3. לחתוך "אורך 1/16" 4.25 אחד צינורות גומי סיליקון ID.
      4. חותך שני 1 "אורכים של 1/16-מוקף חומה עבה" צינור גומי סיליקון ID (1D איור, ז).
      5. לחתוך באורך 2 "אחד" מזהה x 0.5 "1/4 צינור חיצוני קוטר (OD) גומי סיליקון (איור 1D, ה).
    2. הכן את מתאמי Luer הבאים (לכל bioreactor):
      1. הכן מנעול Luer 10 זכר ל1/8 מתאמים דוקרני '(איור 1D, ג)
      2. הכן 2 זכר Luer מתחבר (1D איור,)
      3. הכן 2 כמוסות Luer נקבה (1D איור, ב)
      4. הכן 5 נשי Luerx מתאמי Luer נקבה (X5; איור 1D, ד)
    3. לשטוף את כל מתאמי צינורות וLuer עם חם, לדלל פתרונות נוזל לניקוי כלים, לשטוף היטב במים ברז ולאחר מכן ROH 2 O, ולאפשר להם להתייבש.
  3. להרכיב מעגלי זלוף.
    1. סליפ 1 "אורכו של צינור גומי סיליקון ID 1/16 '-מוקף חומה עבה על acceptor Luer כניסה צמוד לראש של bioreactor. הנח זכר מנעול Luer ל1/8 "מתאם עקיצה מזהה לקצה פתוח של צינור. חזור לacceptor Luer הכניסה האחר, ולהתחבר כובע Luer נקבה לאטום את היציאה (מיועד לטכניקות זריעה בשופכן או ורידים אינם מתוארות בפרוטוקול זה).
    2. חבר "קטע של 1/16" כל 25 צינורות גומי סיליקון ID למגזר 8 "של צינורות משאבת peristaltic באמצעות מנעול Luer זכר ל1/8" עקיצה זיהוי ומתאמי נקבת Luer x הנשיים Luer (1D איור, י).
    3. חבר קצה אחד פתוח טובין גומי סיליקוןז לשקע perfusate התקשורת בצד החיצוני של ראש bioreactor. חבר את "האורך של 1/16" 4.25 צינורות מזהה לצד השני (הפנימי) של שקע perfusate תקשורת בחלק הפנימי של ראש bioreactor.
    4. חבר מנעול Luer זכר ל1/8 "מתאם תיל מזהה לקצה הפתוח הנותר של צינורות מעגל זלוף. חבר נשי Luer x מתאם Luer נקבה לזכר Luer הנעילה. חבר את נקבת Luer x מתאם Luer נשי לנעילת Luer הפתוחה הגברית המובילה לacceptor Luer הכניסה על bioreactor. זה ישמש ככניסת perfusate התקשורת המובילה ישירות לתוך עורק הכליה צינתור.
    5. ודא שאין יציאות על מכסה bioreactor נותרות פתוחות או חשופות. חוזקה לסגור את שסתום הוואקום בגוף bioreactor.
    6. התאם את ראש bioreactor על גוף המאגר, עם טבעת O דחוקה בין החריצים הזהים מרפדים כל רכיב. הנח מהדק מתכתי על הממשק להחזיק שני המרכיבים יחד.
    7. התאם את יציאת האוורור בראש bioreactor עם מסנן אוורור 0.2 מיקרון, המחבר את שני מרכיבים באמצעות אורך 2 "של" זהות x 0.5 "1/4 צינור גומי סיליקון OD (איור 1D, ה). פתח את שסתום האוורור.
    8. מעט לשחרר את כובע הבורג האדום על ראש bioreactor.
    9. מניחים את מתאמי Luer שנותרו ו -6 מלקחיים דגימה משוננים "בכיס וחותם autoclavable.
  4. החיטוי bioreactors התאסף והתקעים Luer גבריים.
  5. הכן את חומרים כימיים לעיקור פיגום וזלוף הבינוני הבאים לפני זריעה (כרכים מפורטים לכליות decellularized):
    1. בתוך מנדף, להכין 50 מיליליטר 0.1% חומצת peracetic, 4% אתנול פתרון על ידי הוספת 2.56 מיליליטר פתרון peracetic חומצה (39% ריכוז מניות) ו -40 מיליליטר 200 אתנול הוכחה ל~ 957 מיליליטר ROH 2 O בבקבוק 1 ליטר. מערבבים היטב על ידי בקבוק היפוך שוב ושוב, ומניח בארון בטיחות ביולוגי.
    2. הכן150 מיליליטר 1x פתרון PBS, מראש מעוקר-ידי מעוקר.
    3. הכן 50 מיליליטר מדיום DMEM / F12 בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (עט-דלקת).
  6. לאסוף את הפריטים שנותרו להרכבת bioreactor זלוף. מניחים את כל הפריטים בארון בטיחות ביולוגי. קריטי: ודא שארון הבטיחות הביולוגי מצויד בעבודת שקעי חשמל לשלטון כונן המשאבה הדיגיטלית. לחלופין, להשתמש בכבל מאריך לחיבור כונן המשאבה לשקעי חשמל חיצוניים מחוץ לארון.
    1. לאסוף כליות decellularized.
    2. לאסוף bioreactors autoclaved עם מעגלי זלוף מצורפים.
    3. לאסוף כיס autoclaved המכיל מתאמי Luer ומלקחיים.
    4. לאסוף כונן דיגיטלי משאבה עם ראש 4 רולר-מצורף, ומחסניות משאבה גדולות (1 למעגל זלוף).
  7. להשלים את מעגל זלוף כמתואר בתרשים 1C תחת ג סטריליסובל ממצבים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
    1. חבר ברזלים 3-דרך (איור 1D, i) בין מנעול Luer זכר ל1/8 מתאם "זיהוי עקיצה ליד כניסת perfusate התקשורת ומתאם Luer נקבה נקבת Luer x. להשאיר את כל שלוש יציאות בפתוחות ברזלים.
    2. הסר את מכסה הבורג האדום על ראש bioreactor ופיפטה 50 מיליליטר של 0.1% חומצת peracetic, 4% אתנול פתרון למאגר הבינוני דרך הפתח.
    3. חבר את קטע צינור משאבת peristaltic לראש המשאבה באמצעות מחסנית משאבה גדולה. התאם את קצב הזרימה עד 5 מיליליטר / דקה, "התחל" עיתונות, ולאפשר למעגל ראש.
      1. כאשר הנוזל ממלא את קו זלוף ומגיע לנמל הפתוח הנותר של הסתום המשולש, חבר את היציאה באמצעות Luer זכר התקע (1D איור,).
      2. לאפשר למעגל ראש באופן מלא עד שלא אוויר הוא ציין בצינור מעגל זלוף או בחלק הפנימי של acceptor Luer הכניסה. אם necessaר"י, להגדיל את קצב הזרימה באופן זמני לגרש בועות מקו זלוף. כאשר דרוך באופן מלא, לעצור את כונן המשאבה.
    4. תקע בזהירות את סוף Luer הנשי של הצנתר לתוך עורק הכליה acceptor Luer זכר מפרצון על פני השטח הפנימיים של ראש bioreactor באמצעות 6 המלקחיים המעוקרים ". ודא שהחיבור הוא חזק ושאין אוויר שנשאר בקטטר. לאפשר הכליות לתלות בעדינות מקטטר עורק הכליה, כך שעורק הכליה לא לסובב או שריטה.
    5. הדק את המהדק המתכתי המחזיק ביחד ראש bioreactor וגוף, כך שמאגר bioreactor הוא סגור היטב. סגור את כובע הבורג האדום על ראש bioreactor.
  8. לעקר כליות ב RT על ידי זלוף עם peracetic 0.1%, 4% אתנול בפתרון 5 מיליליטר / דקה לשעה 1, ולאחר מכן שלושה זילופים 1-שעה ברצף של RT עם 50 מיליליטר PBS ב 5 מיליליטר / דקה.
    1. שינוי פתרונות:
      1. אחרי שעה 1, לעצור את המשאבה ולפתוח כובע בורג אדום. באמצעות STEלהרגיז פיפטה פסטר (autoclaved), לשאוב בזהירות כל הפתרון ממאגר bioreactor. השאר את מעגל זלוף דרוך באופן מלא.
      2. פיפטה 50 מיליליטר של תמיסה טריות לתוך מאגר bioreactor, לסגור את כובע הבורג, ולהתחיל את המשאבה.
  9. לאחר השטיפה הסופית PBS, לשאוב PBS מהמאגר ופיפטה 50 מיליליטר במדיום DMEM / F12 בתוספת 10% FBS ו -1% פן-דלקת. סגור את כובע הבורג, ולהעביר את bioreactor עם מעגל זלוף המצורף לחממת קיבולת גדולה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  10. במידת צורך, להעביר את כונן המשאבה לחממה. חבר במעגל זלוף bioreactor למשאבה, ותנקבו בכליות 4 מיליליטר / דקה לשעה לפחות 1 לפני הזריעה.

3. כליות Recellularization עם תאים בקליפת המוח כליות Tubular אפיתל

  1. כמויות מספיקות חמות של DMEM / F12 (בתוספת 10% FBS ו -1% פן-דלקת) וגell מתנער אנזים להרמת תא 37 ° C. כרכים הציעו מפורטים להלן:
    1. הכן אנזים מתנער 10 מיליליטר תא ו -10 מיליליטר DMEM / F12 לבקבוק 175 סנטימטר 2 תרבות להרמה.
    2. הכן 5-10 מיליליטר DMEM / F12 לכליות לזרע.
  2. לאסוף מספר מספיק של צלוחיות תרבות לריכוז הזריעה הרצויה (4 x 10 7 הנציחו תאי RCTE אנושיים 18 לתוצאות כליות בקליטתם מקסימלי של תאי RCTE באמצעות אסטרטגית זריעה זה).
  3. תאי מעלית מהצלוחיות באמצעות אנזים מתנער תא. בינוני לשאוב מבקבוק, אז פיפטה 10 מיליליטר אנזים תא dissociating לתוך בקבוק. בקבוק מקום בחממת 37 ° C כדי לזרז ניתוק.
  4. בדקו בקבוק במיקרוסקופ לעומת שלב כל 2 דקות עד ניתוק מלא של תאים ממשטח בקבוק הוא ציין. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לרמה של מפגש של התאים, אבל תאי RCTE יהיה require כ 15 דקות כדי לנתק באופן מלא.
  5. קח דוגמא של השעיה תא ניתק לספירה לפני pelleting. לדלל את ההשעיה התא עם נפח שווה של מדיום DMEM / F12 מראש חימם, וצנטריפוגות ב 232 XG כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) במשך 5 דקות.
  6. ספירת התאים בצנטריפוגה. לדלל את המדגם שהושג עם נפח שווה של Trypan הכחול, ופיפטה 10 μl לכל קצה של hemacytometer לספירה. לחשב צורך דילול גלולה נפח להשיג ריכוז הזריעה הרצוי (2 x 10 7 תאים / מיליליטר).
  7. לאחר צנטריפוגה, לדלל את הכדור עם נפח מתאים של מדיום התרבות להשיג ריכוז סופי של 2 x 10 7 תאים / מיליליטר. צייר את 2 מיליליטר של ההשעיה הזריעה לתוך מזרק 5 מיליליטר סטרילי.
  8. העבר את bioreactor זלוף לארון בטיחות ביולוגי. הפעל את שסתום ברזלים כדי לסגור זרימה לנמל הזריעה. הסר את התקע להחליק זכר Luer מברזלים, ולחבר את המזרק עמוס ההשעיה הזריעה.
  9. במהירות להעביר את מעגל זלוף בחזרה לחממה, ולהשתמש במחסנית המשאבה הגדולה כדי לאבטח את קטע צינור משאבת peristaltic לראש המשאבה.
  10. זריעת תאים: סגור את נמל שסתום ברזלים מצביע לכיוון משאבה. לאט לאט להזריק את ההשעיה התא לכליות, על מנת להבטיח כי כל ההשעיה מועברת מהמזרק לתוך קו ברזלים וזלוף. הפעל את שסתום ברזלים כדי לסגור זרימה מהמזרק, ולהתחיל את המשאבה במהירות של 25 מיליליטר / דקה במשך 15 דקות.
  11. אחרי 15 דקות, מוריד את קצב זרימת המשאבה עד 4 מיליליטר / דקה. בינוני בורסה ביום שלמחרת (100 מיליליטר נפח לשינויים שלאחר מכן) ולאחר מכן בכל יומיים.

4. הערכה של כדאיויות תא והפצה באמצעות Resazurin זלוף Assay

  1. הכן מגיב resazurin. לפזר מלח נתרן resazurin 110.5 מ"ג בשל PBS 100 מיליליטר תחת ערבוב, ולדלל 01:10 על ידי הוספת 5 מיליליטר שלוכתוצאה מכך פתרון עד 45 מיליליטר PBS הטרי כדי ליצור פתרון מניות resazurin 440 מיקרומטר. מסנן לעקר (באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק), ולאחסן את פתרון המניות בצינור חרוטי 50 מיליליטר מוגן אור ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן פקדי מדיה בתוספת resazurin. הכן פתרון 10% של מגיב resazurin במדיום התרבות (למשל. 5 מיליליטר resazurin פתרון מניות בינוני תרבות + 45 מיליליטר) כדי ליצור resazurin עובד פתרון. החיטוי 10 מיליליטר נפח של הפתרון עובד resazurin במכל מוגן אור. הערה: זה יקטין לחלוטין מתחם resazurin לresorufin, וישמש כביקורת חיובית לחישוב הפחתת resazurin אחוזים.
  3. Aliquot 1 מיליליטר כל אחד מפתרון עובד resazurin (חמצון), autoclaved resazurin עובד פתרון (מופחת), ומדיום התרבות לבד (ריק) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר נפרדים אוסף. מניחים את הצינורות הפתוחים באותו החממה כbioreactors זלוף.
  4. העבר את זלוף הכליותמעגל מהחממה לארון בטיחות ביולוגי. הסר את מכסה בורג מהראש bioreactor, ומדיום תרבות לשאוב ממאגר bioreactor בעזרת פיפטה פסטר.
  5. פיפטה 10 מיליליטר של resazurin עובד פתרון למאגר, כובע בורג קרוב, ולהעביר את מעגל זלוף הכליות חזרה לחממה.
  6. התחל המשאבה ב 4 מיליליטר / דקה ולאפשר מגיב לperfuse דרך הכליות עבור שעה 1 בדיוק.
  7. אחרי שעה 1, לעצור את המשאבה, ולהעביר את מעגל זלוף הכליות לארון הבטיחות הביולוגי.
  8. לאסוף את פתרון resazurin המותנה (מופחת באופן חלקי), ולהוסיף בינוני תרבות 100 מיליליטר למאגר bioreactor. מעגל זלוף העברה לחממה, ולחדש את הזרימה (4 מיליליטר / דקה).
  9. פיפטה μl 100 (x 3 משכפל) התנה resazurin פתרון, resazurin עובד פתרון, autoclaved עובד פתרון, וריק תקשורת ותרבות לשחורה (אטום) 96-גם צלחת assay. קראו עוצמת הקרינה (excitatיון: 540/35; פליטה: 590/20) באמצעות ספקטרופוטומטר.
  10. חישוב הפחתת אחוזים כיחס של עוצמות הקרינה מנורמלות על ידי עוצמת הקרינה (FI) שנוצרו על ידי מדיום resazurin חמצון (ORM, או resazurin עובד פתרון אינו חשוף לתאים) או מופחת resazurin הבינוני (RRM, או autoclaved עובד פתרון):% ההפחתה = 100 x {[FI (פתרון resazurin מותנה) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. לנרמל תוצאות, להכפיל הפחתת% על ידי במחזור נפח (10 מיליליטר) ולחלק בזמן דגירה (1 שעה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כליות perfused ברצף עם מים ולדלל פתרונות חומר ניקוי (1% Triton X-100, 0.1% SDS) על פי פרוטוקול decellularization הוקם בעבר, אופטימלי (ראה איור 1 א ', ב') 7, הפכו יותר ויותר שקופים על פני תקופה 26 שעות, כ מוצג באיור 2 א. פיגום כליות acellular וכתוצאה מכך הוא נטול תאים ושומר על ECM כליות מלוכד נתמך על ידי כמוסת כליות שלמה, שלא ניזוק בעקבות פרוטוקול זלוף. על ידי זלוף חומר הניקוי הסופי (SDS), רשת כלי הדם של הכליות, ובפרט את כלי interlobar, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול decellularization תאר מייצר באופן עקבי ECM כליות acellular לחלוטין המשמש כתבנית 3D לתרבות של תאים אנושיים כליה קליפת המוח צינורי אפיתל (שני הפרוקסימלי ודיסטלי נגזר אבובית), בנוסף לתאי האנדותל של כלי דם 7,17. כלי דם כליות cannulated משמש כתכונה המרכזית למסירה אחידה של חומרים כימיים ותאים בפיגום בתוך הגדרת bioreactor, ובכך לאפשר decellularization זלוף, פרוטוקולי זלוף זריעת תאים, תרבות זלוף לטווח ארוך, וresazurin. כcannulation כזה, תקין של עורק הכליה לפני זלוף איב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לתמיכתה של קרן משפחת זל. אנו מכירים בתמיכה מיוזמת מענקי המחקר התרגומי של קרן הזיכרון הצפון-מערבית, מענק פיתוח הפקולטה של האגודה האמריקאית למנתחי השתלות, ומענק מחקר לחוקר הצעיר מהקרן הלאומית לכליות של אילינוי. אנו מודים לתמיכה מקרן רוברט ר. מקורמיק. עבודה זו נתמכה גם על ידי NIDDK K08 DK10175 ל-J.A.W. ליבות הדמיה והיסטולוגיה המשמשות למחקר זה נתמכות על ידי המעבדה להיסטולוגיה ופנוטיפ של עכברים, מרכז מכשור בדיקות אלקטרונים (EPIC) וליבת ציוד של מכון סימפסון קוורי באוניברסיטת נורת'ווסטרן, ומענק תמיכה במרכז הסרטן (NCI CA060553). המחברים רוצים להודות לליבת המיקרו-כירורגיה של אוניברסיטת נורת'ווסטרן לרכש כליות מכרסמים. הערכת מורפולוגיה של אפיתל צינורי כלייתי לאחר התאיות שנערכה במשאב המשותף של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הנתמך על ידי P30 CA118100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנטים
TRITON X-100, דרגת פרוטאומיקה, תמיסת נתרןVWRM143-4L
, BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, 20% ב-H2OSigma-Aldrich05030
, פורום, ~ 39% בחומצה אצטית (RT)Sigma-Aldrich77240פראצטי הוא דליק וקורוזיבי. התכוננו בתוך מכסה אדים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים (למשל כפפות, משקפי מגן).
200 הוכחה אתנולVWRV1001TP
Sigmacote, מגיב סיליקון לזכוכית ומשטחים אחריםSigma-AldrichSL2לטיפול במאגרי ביו-ריאקטור. מכונה בטקסט מגיב סיליקון.
DMEM/F12 MediaLife Technologies11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, MediatechCorning35-010-CV
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X 10,000 יחב"ל פניצילין 10,000 ומיקרו; g/mL StreptomycinCorning30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol RedLife Technologies12605-028מכונה בטקסט אנזים מפריד תאים.
Trypan Blue Stain (0.4%)Life Technologies15250-061
מלח נתרן ResazurinSigma-AldrichR7017
ציוד:
כונן דיגיטלי Masterflex L/S, 600 סל"ד, 115/230 VACCole-ParmerEW-07522-20
Masterflex L/S מחסניות גדולות עבור ראשי משאבה 07519-05 ו-06.קול-פארמרEW-07519-70מכונה בטקסט מחסנית משאבה גדולה.
ראש משאבת מחסנית Masterflex L/S 8 ערוצים, 4 רולר.Cole-ParmerEW-07519-06
מלקחיים דגימה ישרים בגודל 6 אינץ', משונניםVWR82027-438
*ביו-ריאקטור לזלוף כליותWilMad Labglass*עיצובים מותאמים אישיתביו-ריאקטורים מיוצרים כמתואר על ידי WilMad Labglass. העיצובים תוארו לעומק בפרסום קודם.
מעגל זלוף
24 גרם x 0.75 אינץ'. צנתר IV מוגן BD Insyte Autoguard (0.7 מ"מ x 19 מ"מ) עשוי מחומר ביולוגי BD Vialon. יש מחט מחורצת. (50/sp, 200/ca)BD Biosciences381412מכונה בטקסט קטטר מד 24.
צינורות Masterflex PharMed BPT, L/S #14, 25'Cole-ParmerHV-06508-14מכונה בטקסט צינורות משאבה פריסטלטית.
צינורות סיליקון מרפאים במי חמצן, 1/16 אינץ' ID X 1/8 אינץ' OD, 25 רגל/חבילהCole-ParmerHV-06411-62מכונה בטקסט צינורות גומי סיליקון 1/16 אינץ' ID.
צינורות סיליקון מאסטרפלקס פלטינה, L/S 14, 25 רגל.Cole-ParmerHV-96410-14מכונה בטקסט צינורות גומי סיליקון עבים בגודל 1/16 אינץ'.
צינורות סיליקון VWR, 1/4 אינץ' ID x 0.5 אינץ' ODVWR89068-484
Acro 50 מסנני אוורור, Pall Life SciencesVWR28143-558מכונה בטקסט מסנן אוורור 0.2 מיקרון.
מתאמי Cole-Parmer Luer, מנעול Luer זכר למזהה 1/8 אינץ', ניילון, 25/pkCole-ParmerT-45505-11מכונה בטקסט מנעול Luer זכר למתאם דוקרני 1/8 אינץ'.
אביזר Cole-Parmer Luer, תקע לואר זכר, ניילון, 25/pkCole-ParmerEW-45505-58
מתאם לואר נקבה x נקבה, ניילון, 25/pkCole-ParmerEW-45502-22מכונה בטקסט מתאם Luer x נקבה Luer.
Cole-Parmer Luer Accessory, כובע לואר נקבה, ניילון, 25/pkCole-ParmerEW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock עם מנעול לואר זכר מורחב, ניסוח שאינו DEHP, ללא לטקס (LF), עמיד בפני שומנים, ללא PVD, מספר קטלוגי 50/csCareforde Healthcare10254821Smiths Medical (ספק) הוא #MX4311L.
רכיבים
5 מ"ל מזרק חד פעמי BD Luer-Lok עם BD Luer-Lok™ קצה.BD Biosciences309646
35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת תרבית אחיזה קלהBD Biosciences353001משמש למשיכת תרחיף תאים למזרק לזריעת תאים.
דודציל סולפט של AMRESCO תמיסת חומצה פראצטית רכיבי אחרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

תגיות

מאמרים קשורים