מאמר שיטה

הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

16.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

15 בינואר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

במאמר זה

סיכום

תאי גליומה

GL261 מספקים מודל שימושי של בעלי חיים בעלי יכולת חיסונית של גליובלסטומה. מטרות פרוטוקול זה הן להדגים טכניקות מתאימות לניטור צמיחת גידול תוך גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo, ולאמת את התועלת של תאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז לחקר אימונולוגיה של גידול וגישות אימונותרפיות לטיפול בגליובלסטומה.

תקציר

בניגוד למודלים של בעלי חיים של גליומה אנושית המדווחים בדרך כלל, גליומה עכברית GL261 xenografts מסכמים כמעט את כל המאפיינים הקליניים וההיסטופתולוגיים הרלוונטיים של המחלה האנושית. כאשר תאי GL261 מושתלים תוך גולגולתית בעכברי C57BL/6 סינגניים, למודל יש יתרון נוסף של שמירה על מיקרו-סביבה חיסונית שלמה. ביטוי יציב של לוציפראז בתאי GL261 מאפשר ניטור ביולומינסנציה לא פולשני וחסכוני של צמיחת גידול תוך גולגולתי. לאחרונה הוכחנו כי ביטוי לוציפראז בתאי GL261 אינו משפיע על תכונות צמיחת הגידול, ביטוי ציטוקינים אימונומודולטוריים של תאי גידול, חדירת תאים חיסוניים לגידול או הישרדות כוללת של בעלי חיים הנושאים את הגידול התוך גולגולתי. לכן, נראה כי מודל הגליומה של GL261 luciferase יכול להיות שימושי בחקר שיטות כימותרפיות ואימונותרפיות חדשות. כאן אנו מדווחים על הטכניקה ליצירת ביטוי לוציפראז יציב בתאי GL261 וכיצד לחקור את הצמיחה במבחנה ובגוף החי של תאי הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציונית.

מבוא

גליומה ממאירה היא גידול המוח האנושי הנפוץ והקטלני ביותר. גם כאשר מטופלים בכריתה כירורגית מקסימלית, הקרנות וכימותרפיה, ההישרדות החציונית נשארת 15-20 חודשים במרכזי הפניה לגידולי מוח עיקריים1, 2, 3. הצורה האגרסיבית ביותר של גליומה ממאירה, גליובלסטומה, מאופיינת בדמויות מיטוטיות, ניאו-וסקולריזציה, פלישה למוח סמוך ונמק פסאודופליסדינג. השתלות אורתוטופיות של גידולי מוח באמצעות תאי גידול מוח אנושי מילאו תפקיד חיוני במחקר נוירו-אונקולוגי ואפשרו תרגום פרה-קליני לבדיקת חומרים חדשים, לפני הכניסה לניסויים קליניים בבני אדם. בעוד שרוב המודלים האנושיים של קסנוגרפט מסכמים מאפיינים רבים של המחלה האנושית, מגבלה בסיסית בכל מערכות מודל הקסנוגרפט המבוססות על בני אדם היא השימוש בבעלי חיים חסרי חיסון4.

היעדר תגובת מארח שלמה משנה בבירור את צמיחת הגידול הן מבחינת מורפולוגיה של הגידול והן מבחינת יעילות ההשתלה. בעוד שהנחות מסוימות מקובלות בפירוש תוצאות ממודלים מורכבים, השגת מסקנות רלוונטיות בתחום ההערכה הטיפולית היא אתגר. מאפיינים ביולוגיים בסיסיים מסוימים עשויים להיות דומים בבעלי חיים חסרי חיסון ובעלי יכולת חיסונית, אך אחרים כגון דלקת הקשורה לגידול, פלישה לרקמות, תגובה לפציעה הם כנראה שונים מאוד. לעומת זאת, GL261 הוא קו תאי גליומה עכברי המושרה כימית המסכם במדויק את הגליומה כאשר הוא מושתל במוחם של עכברי C57BL/6 סינגניים בעלי יכולת חיסונית5. בדומה למחלה האנושית, גידול תוך גולגולתי מוביל במהירות ובאופן חוזר לתסמינים נוירולוגיים ולמוות של בעלי חיים6-10.

ניתן למדוד ישירות את צמיחת הגידול התת עורי. ניתן למדוד צמיחת גידול תוך גולגולתי רק באמצעות הקרבת בעלי חיים או באמצעות מחקרי הדמיה יקרים. ביטוי יציב של האנזים לוציפראז מאפשר הדמיה ביולוגית תוך גולגולתית לא פולשנית וחסכונית11. ביולומינסנציה של תאי GL261 שעברו לוציפראז נמצאת בקורלציה טובה עם צמיחת גידול תוך גולגולתי. לאחרונה השווינו ישירות את GL261 לתאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז ולא הראינו הבדל בצמיחה ופלישה במבחנה, פרופיל ציטוקינים אימונולוגי, הישרדות in vivo של עכברי גידול תוך גולגולתי הנושאים C57BL/6, או חדירת תאים חיסוניים. טכניקה זו ישימה למחקרים פרה-קליניים של גליובלסטומה הכוללים ניטור לא פולשני של צמיחת הגידול.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים השימוש וטיפול הוועדה באוניברסיטת נורת'ווסטרן ובוצעו בתנאים מעוקרים.

1. שינוי של תאי GL261 עם כתב Firefly לוציפראז הבעה

הערה: וקטורי lentiviral מבוססי HIV-1 להביע לוציפראז גחלילית (Fluc) תחת השליטה של ​​אמרגן וירוס יוצרי מוקד טחול (SFFV). גן הכתב האופטי כבר משובט לתוך פלסמיד הווקטור pHRSIN-CSGW-dlNotI.

  1. לשמור על 293-T תאים הבינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ותאי GL261 במדיום RPMI בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 95 אוויר% ו -5% פחמן דו חמצני (CO 2).
  2. כאשר תרבית תאי 293-T מגיעה confluency 80% בבקבוק T-75, לשטוף את התאים פעם אחת עם phחיץ המלוח osphate (PBS) ללא Ca 2 + וMg2 +, דגירה התאים עם 3 מיליליטר של טריפסין (0.05%) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, triturate עם פיפטה 5 מיליליטר על ידי החזקת הבקבוק מעט מלוכסן ולאסוף את כל התאים מהחלק התחתון של בקבוק. העבר 3 מיליליטר של השעיה תא trypsinized לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, ולהוסיף 7 מיליליטר של מדיום RPMI בשר (בסך הכל 10 מיליליטר של ההשעיה התא).
  3. מערבבים את ההשעיה התא היטב עם פיפטה 5 מיליליטר. קח של ההשעיה התא מהצינור 100 μl ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer. כדי לעשות זאת, שילוב של ההשעיה התא עם 300 μl של פתרון trypan הכחול 100 μl ולהוסיף 2 μl של התערובת לתוך hemocytometer. לספור את מספר התאים ללא כתמי כחולים מארבע תצוגות נפרדות תחת מיקרוסקופ. ממוצע מספר תאים מכל תצוגה, כמספר הזה מייצג 10 4 תאים / מיליליטר.
  4. בינתיים, צנטריפוגות הצינור המכיל את ההשעיה התא ליום 30 ב0 XG במשך 7 דקות. לשאוב התקשורת וresuspend את כדורי תא עם מדיום RPMI טרי לעשות השעיה תא GL261 בצפיפות של 1.0 x 10 6 מיליליטר /. 2.5 x 10 6 תאי זרע GL261 עם 2.5 מיליליטר של תקשורת RPMI לתוך בקבוק T-175 עם 27.5 מיליליטר DMEM (יום 1).
  5. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני עם 20 מיליליטר DMEM הטרי (יום 2).
  6. כדי לייצר את וקטור lentiviral, לערבב מגיב transfection 54 μl עם DMEM הסרום ללא 2 מיליליטר במשך 5 דקות. הוסף 3 מיקרוגרם של איסור הפרסום-Pol, 3 מיקרוגרם של מעטפת וירוס G stomatitis לפוחי (VSV-G), ו -4.5 מיקרוגרם של Fluc (pSIN-Fluc) לDMEM עם מגיב transfection, ודגירה של 20 דקות ב RT. זרוק את כל תערובת DNA לבקבוק 293-T (T-175) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified המכיל 95% אוויר, 5% CO 2 למשך 48 שעות (יום 2).
  7. להוסיף 10 מיליליטר של DMEM הטרי ב 24 שעות לאחר transfection (נפח כולל של מדיום תרבות תא 293-T צריך להיות כ 30 מיליליטר) (יום 3).
  8. כדי לפצל תאי GL261 לצלחת 24 גם, לשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca 2 + וMg2 +, דגירה התאים עם 5 מיליליטר של טריפסין (0.05%) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, triturate עם פיפטה 5 מיליליטר על ידי החזקת הבקבוק מעט מלוכסן , לאסוף את כל התאים מהחלק התחתון של בקבוק, ולספור תאים באמצעות hemocytometer כמו בשלב 1.2. בינתיים, צנטריפוגות הצינור ב XG 300 7 דקות. לשאוב התקשורת וresuspend את כדורי תא עם מדיום RPMI טרי לעשות השעיה תא GL261 בצפיפות של 2.5 x 10 4 מיליליטר /. זרע 2.5 x 10 4 תאי GL261 עם 1 מיליליטר של תקשורת RPMI בצלחת 24 גם (יום 3).
  9. לאסוף 30 מיליליטר של supernatant lentiviral עם 10 מיליליטר פיפטה מהבקבוק 293-T (T-175) בtransfection הבא 48 שעות ולהעביר את supernatant לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשאוב supernatant 30 מיליליטר lentiviral באמצעות מזרק 50 מיליליטר, דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, וaliquot supernatant הנגיפי לתוך 1 מיליליטר aliquots (יום 4).
  10. החלף את מיליליטר 1 של Rמדד מנהלי הרכש בינוני בצלחת תא GL261 (24 גם) עם 1 מיליליטר של supernatant lentiviral ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified (יום 4).
  11. לאחר 48 שעות של זיהום lentiviral, להחליף בינוני עם 1 מיליליטר של RPMI הטרי (יום 6).
  12. לאחר 24 שעות, לחזור על זיהום lentiviral של תאי GL261 (יום 7).
  13. לאחר שעה 2 nd 48 של זיהום lentiviral, להחליף בינוני עם 1 מיליליטר של RPMI הטרי (יום 9).
  14. תמשיך לגדול תאי GL261 לוציפראז שונה (שמכונה תאי GL261.luc) ולהרחיב את תרבות התא לבקבוק T-75.
  15. כאשר תרבית תאי GL261.luc מגיעה confluency 70% בבקבוק T-75, לקצור את התאים על ידי trypsinization ולספור על ידי hemocytometer כמו בשלב 1.2. צלחת תא GL261.luc לתוך צלחת 24 גם בצפיפויות שסיימה את לימודי (1.0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 תאים / טוב) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בhumidiתא fied המכיל 95% אוויר, 5% CO 2 למשך 3 שעות.
  16. למדוד פעילות ביחס לוציפראז סלולארי ללוציפראז שונה U-87 תאי MG (U87.luc) באמצעות הדמיה פליטת אור (איור 1).
    1. הפעל את תוכנת תמונה (לחץ על סמל בשולחן העבודה) ולאתחל את מערכת ההדמיה (לחץ "אתחול" כפתור). האתחול יתחיל באופן אוטומטי ועלול לקחת כמה דקות לביצוע הצ'ק-אין את המערכת ואת המצלמה כדי להתקרר ל -90 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 25 μl של luciferin (מלח אשלגן D-Luciferin, 150 מ"ג / קילוגרם) לכל אחד.
    3. דגירה התאים עם luciferin דקות 1 ב RT ותמונת הצלחת למשך 10 שניות. כדי להגדיר את מערכת ההדמיה, בחר "פלורסנט", "10 שניות" זמן חשיפה, וbinning "בינוני". מניחים את צלחת 24 גם בתחנת ההדמיה ולחץ על הכפתור "רכישה" כדי להתחיל תמונה.
    4. לאחר צילום התמונה שנרכשה בהצלחה, תראה חלון תמונה והרשות פלסטיני כליlette על המסך. לחץ על "החזר על השקעה (אזורים של עניין) כלים" ובחר 6 x 4 מהסמל החריץ. צור 6 x 4 חריצים כדי לכסות את האזור של אות בתמונה של צלחת 24 גם ולחץ על כרטיסיית המדידות (סמל עיפרון). שים לב חלון עם שולחן של מדידות ROI כיחידה של פוטונים לשניה לכל סטרדיאן לסנטימטר רבוע (פוטונים / sec / סנטימטר SR / 2).
    5. תאי השימוש U87.luc, שונו בעבר עם אותו lentivirus משמש כאן לשינוי GL261 11, כביקורת להערכת פעילות לוציפראז בתאי GL261.luc transduced.

2. במבחנה למניעת הפצת הנשק Assay

  1. כאשר תרביות תאי GL261 וGL261.luc להגיע 70% confluency בבקבוק T-75, לקצור את שני שורות התאים על ידי trypsinization ולספור כמו בשלב 1.2, ותאי צלחת לצלחת 96-היטב בצפיפות של 1500 תאים ב 80 μl של מדיום RPMI לכל גם בעזרת פיפטה רבה כדי למזער את הזמן ושגיאת pipetting. Seאד כל שורת תא לסך של 20 בארות. כדי להגביל את האידוי בבארות מאוכלסות על ידי תאים, למלא בארות ריקות עם של מדיום RPMI טרי 100 μl.
  2. להעריך את ההתפשטות הסלולרית באמצעות assay התפשטות תאי colorimetric. כאן אנו משתמשים assay התפשטות תאי MTS. בעזרת פיפטה רבת-ערוצית, להוסיף 20 μl של מגיב MTS לבאר כל צלחת 96-היטב המכילה תאים.
  3. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified המכיל 95% אוויר, 5% CO 2 למשך 3 שעות. למדוד הספיגה ב 490 ננומטר באמצעות קורא microplate. זה חוזר על עצמו בימים 1, 2, 4, ו -7, לאחר ציפוי. לנרמל את הערכים ספיגה, ערכיו של כל יום מחולקים על ידי הקריאות המקבילה הושגו ביום 1 (איור 2).

השתלת תאים 3. גידול

הערה: החיטוי כל הציוד. הכן אזור ניתוח על ידי ריסוס (פתרון chlorhexidine 2%) חיטוי ולכסות עם absorbenוילונות לא. על מנת לשמור על תנאים סטריליים, ללבוש כפפות מנתחים סטרילית במהלך ניתוח, ולחלק את אזור הניתוח לשני תחומים על ידי קלטת צבע. שטח 1 שכותרתו "נקי" ומכיל אספקת עיקור; אזור 2 שכותרתו "מלוכלך" ומכיל חומרים המשמש.

  1. לפני ניתוח בעלי חיים, להכין השעיה תא להזרקה תוך-גולגולתי. קציר תאים וממחוברות 70% T-75 בקבוק ידי trypsinization ולספור תאים באמצעות hemocytometer כמו בשלב 1.2, ולהפוך את ההשעיה תא בצפיפות של 1.0 x 10 5 תאים / μl במאוזן תמיסת מלח 'הנקס בלי Ca 2 + ו Mg 2 + (HBSS).
  2. הרדימי עכברים עם זריקת intraperitoneal של 200 תערובת μl המכילה 100 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם של xylazine מלוחים 0.9%. כדי לאשר הרדמה נכונה, לצבוט את הבוהן של העכבר. אם העכבר הוא בהרדמה לחלוטין, העכבר לא צריך להגיב לגירוי.
  3. נהל 0.1 מ 'g / עצירות קילוגרם באמצעות הזרקה תת עורית על מנת להקל על הכאב שלאחר הניתוח.
  4. לגלח את החלק העליון של הראש של בעלי החיים באמצעות קוצץ ונקי עם מוליך כותנה-טיפ טבול בפתרון של 2% chlorhexidine. החל משחה העין כדי לשמור על שימון נאות במהלך הניתוח.
  5. לעשות חתך sagittal ארוך כ 1 סנטימטר מעל עצם parieto-העורפית באמצעות אזמל סטרילי. כדי להמחיש את גבחת, לנגב את פני השטח של הגולגולת עם מוליך כותנה-טיפ הספוג בתמיסה מי חמצן 3%.
  6. מקדחת הגולגולת עם מחט 25-G סטרילי לעשות חור 3 מ"מ קטן בצד הימין של גבחת ורק מאחורי תפר העטרה.
  7. כדי להבטיח שאתר הזרקה תוך-גולגולתי הוא עד לעומק של 3 מ"מ מהגולגולת, לחתוך 3 מ"מ מהקצה המחודד של קצה פיפטה 20 μl באמצעות מספריים ולהכניס מזרק לתוך קצה פיפטה.
  8. הכנס את המזרק בניצב לחור שנוצר בעבר, ולהזריק את התאים הסרטניים sus לאט פנסיה המכילה 3.0 x 10 5 תאים ב3 μl HBSS, על פני תקופה 1 דקות. השאר את המחט במקום לעוד דקה, ולאחר מכן משוך באיטיות את המחט.
  9. ספוגית הגולגולת עם מוליך כותנה-טיפ טבול במי חמצן 3% ופתרון chlorhexidine 2%. ייבש את פני השטח של גולגולת עם מוליך כותנה-טיפ. חותך את שעוות עצם סטרילי כ 3 מ"מ 3 בגודל ולצרף את שעוות העצם בצד סופו של מוליך כותנה-טיפ. החל שעוות העצם כדי לכסות את החור עם מוליך כותנה-טיפ.
  10. צייר את כל צד של הקרקפת יחד מעל הגולגולת באמצעות מלקחיים, ומצרך כדי לסגור את הפצע. לנקות את הפצע עם כותנה-טיפ טבול בפתרון של 2% chlorhexidine.
  11. לפקח על כל העכברים שלאחר ניתוח עד שהם הופכים מהלכים ולשמור על פעילות תקינה. בדרך כלל, זמן החלמה הוא כ 30 דקות. אל תחזיר את העכברים לכלוב עם חיות אחרות עד שהם התאוששו לחלוטין מן ההרדמה.

ילדה = "jove_title"> 4. הדמיה פליטת אור של צמיחת גידול GL261

  1. לרסס כמות נדיבה של חומר חיטוי (0.05% פתרון אמוניום כלוריד דימתיל) על מגבת נייר נקייה. השתמש במגבת נייר ספוג חומר החיטוי כדי לנגב את גיליון השחור, קונוסים האף ומחיצה בתוך חדר ההדמיה שבו בעלי החיים יהיו במגע עם המכשיר ביסודיות. ביסודיות למחוק את כל המשטחים עם מגבת נייר נקייה ויבשה. חזור על פעולה זו פעם נוספת ולחכות 5 דקות.
  2. לאתחל את תחנת ההדמיה כמו בשלב 1.14.1.
  3. להרדים את העכבר עם תערובת 300 μl המכילה 200 μl של קטמין / Xylazine ושל luciferin 100 μl (מלח אשלגן D-Luciferin, 150 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקת intraperitoneal.
  4. חכה 10 דקות לאחר הזרקה ולאשר אם העכברים הם לחלוטין תחת הרדמה על ידי צובט את הזנב. כדי להגדיר את מערכת ההדמיה, בחר, זמן "פלורסנט" "אוטומטי" חשיפה, וbinning "בינוני". מניחים את העכברים בstati ההדמיהובלחץ על הכפתור "רכישה" כדי להתחיל תמונה. ודא שהזמן לאחר ההזרקה עולה בקנה אחד עם כל פגישת הדמיה.
  5. לאחר צילום התמונה שנרכשה בהצלחה, חלון תמונה וצבעי כלי אמור להופיע. לחץ על "כלים ROI" ובחר "אוטומטי" מהסמל המעגל. כדי להגדיר ROIs, להקיף את האזור של אות בתמונה, ולאחר מכן לקחת מידות של ההחזר על ההשקעה כיחידה של פוטונים / sec / SR / 2 סנטימטר.
  6. קח את העכברים מתא ההדמיה ולפקח על העכברים עד שהם הופכים מהלכים ולשמור על פעילות תקינה. בדרך כלל זמן התאוששות הוא כ 15 דקות. אל תחזיר את העכברים לכלוב עם חיות אחרות עד שהם התאוששו לחלוטין מן ההרדמה.
  7. צג צמיחת גידול על ידי הדמיה פליטת אור פעמיים בשבוע עד חיות להציג את התופעות הבאות: ירידה במשקל (הפסד של יותר מ -20% ביחס למשקל לפני השתלה), inappetance (אנורקסיה מלאה למשך 24 שעות), וחוסר purposefu המתמשךתגובה לגירויים עדינים l (ניסיון חלש לקום), בו בזמן שהם צריכים להיות מורדמים. להרדים בעלי חיים עם תסמינים אלו באמצעות תא CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    1. מקום עכברים לתוך תא המתת חסד (לא צפוף הקאמרית) וזרימה דחוסה CO 2 5-6 דקות. שים לב שכל בעלי החיים הם חוסר הכרה ולא נושם לאחר כ 5 דקות.
    2. קח את העכברים מתוך החדר. ודא שהלב אינו פועם בחזה מרגיש בין האגודל לאצבע שלך ולבדוק שאין רפלקס מצמוץ.
    3. לרסן את העכבר במצב שכיבה על משטח שטוח ולתפוס את העורף בבסיס גולגולת ביד אחת ובסיס הזנב עם אגודל והאצבע הראשונה של היד השנייה.
    4. לרסן את הראש ולמשוך במהירות את הזנב לאחור. ודא גולגולת שמופרדת מחוליית הצוואר הראשונה באמצעות אגודל והאצבע ראשונה.
  8. נוֹרמָהערכי הארה Alize לכל יום נגד קריאות מקבילה הושגו ביום הראשון של הדמיה פליטת אור כמו ב2.3 (איור 3 א) הצעד.
  9. לניתוח סטטיסטי, ליצור עקומות הישרדות באמצעות אומדן קפלן-מאייר 12 ולהשוות את ההבדלים בין עקומות הישרדות באמצעות בדיקת יומן דרגה 13.

תוצאות

תאי GL261 היו נגועים בלוציפראז המכיל lentivirus כפי שתואר לעיל בצעדים 1. הדמיה פליטת אור במבחנה מדגימה ביטוי בלוציפראז חזק דומה לרמות בשליטה החיובית U87.luc שורת תאי גליובלסטומה אדם (איור 1). כצפוי, תאים נגוע GL261 להפגין שום ביטוי בלוציפראז רקע. שלב זה הוא פשוט אך קריטי לביצוע לפני מחקרים נוספים באמצעות שורת התאים הנגוע כדי לאשר ביטוי בלוציפראז יציב.

ביטוי לוציפראז לאחר השתלה תוך גולגולתי.

לפני השתלה תוך גולגולתי, שהראינו שום הבדל בשיעור צמיחה במבחנה של GL261.luc בהשוואה לתאי GL261 (איור 2). לצמיחה תוך גולגולת וניתוח הישרדות, תאים הוזרקו לbrains של עכברי C57BL / 6 לפי פרוטוקול שלב 3. צמיחת גידולים בעכברי נושאי גידולי GL261.luc נותח סדרתי עבור הדמיה פליטת אור באמצעות צעד פרוטוקול 4 והפגין צמיחה לגילוי גידול (איור 3 א). עכברי נושאי גידולי GL261.luc במהירות ובעקביות הפכו גוססים והיו מורדמים. חשוב לציין, שאין הבדל בהישרדות כוללת בין GL261.luc וגידול GL261 נושא בעלי חיים (איור 3). בvivo הדמיה פליטת אור ולכן יכולה לשמש לניטור תגובה לטיפולים ניסיוניים גליובלסטומה. צמיחה מהירה אמינה גידול והישרדות כללית קצרה יכולים להניב כמויות גדולות של נתונים בכמות זמן קצר יחסית.

figure-results-1
פעילות לוציפראז איור 1. בתאי GL261.luc. U87.luc, תאי GL261.luc וGL261 (שליטה שלילית) היו מצופים בצפיפות שלx x x x x 1.0 x 10 6, 5.0 10 5, 2.5 10 5, 1.0 10 5, 5.0 10 4, ו -2.5 10 4 תאים / גם משמאל לימין. הארה (פוטון / sec / סנטימטר SR / 2) נמדד על ידי תחנת ההדמיה לומינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. ביטוי לוציפראז אינו משפיע על התפשטות תאי GL261. תאי GL261.luc לא לגרום ל הבדל בהתפשטות כפי שהודגם על ידי assay התפשטות תאי MTS. הגרף מראה גידול של פי, ביחס ליום 1, כפי שנקבע על ידי השוואת הערך ספיגה הממוצע (ממוצע ± SEM) בנקודת זמן thespecified לערך הממוצע ביום 1 (ערכי -test t מזווגים להשוואותבין כל שורת תאים: P = .7796) 14. ברים שגיאה מייצגים את הערכים הממוצע (ממוצע ± SEM) מדגימות ארבע פעמים בכל יום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. ביטוי לוציפראז מינון לא ישפיע על in vivo צמיחת גידול והישרדות של בעלי חיים. () ניטור פליטת אור מדגים צמיחה הדרגתית של גידול תוך גולגולתי GL261.luc בעכברי C57BL / 6. (ב) ניתוח הישרדות קפלן-מאייר מדגים אין הבדל בהישרדות כוללת עבור עכברים המושתלים intracranially עם שני תאי GL261 (קו מוצק) או GL261.luc (קו מקווקו).אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

תאי גליומה עכברית GL261, כאשר מושתלים לתוך מערכת חיסון intracranially syngeneic C57BL / 6 עכברים, מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים של בעלי החיים xenograft גליומה אנושיים. רבים מגידולי xenografted לגדול כמו נגעים במארז שלא במדויק לשחזר את המחלה האנושית פולשנית. לעומת זאת, גידול GL261 מדגים לא רק פלישה לתוך המוח סמוך, אלא גם ניאו-וסקולריזציה, דמויות mitotic, ונימק עמוק 7. והכי חשוב כאשר לומדים אימונולוגיה גידול או אסטרטגיות טיפול חיסוניות 15, 16, עכבר C57BL / 6 שומר מערכת חיסונית שלמה 8. מחקרים קודמים הראו ביטוי חזק של TGF-β ציטוקינים לדיכוי המערכת החיסונית וגידולים תוך גולגולת מכילים תאי T-רגולציה לדיכוי מערכת החיסון דומה לגליובלסטומה אדם 9, 10.

הטכניקה הפשוטה שתוארה כאן מאפשרת לביטוי יציב של לוציפראז על ידי תאי GL261. לאחרונה דיווחנו סימיLar במבחנה ובצמיחת vivo של תאי GL261.luc בהשוואה לתאי GL261, בנוסף למאפיינים היסטולוגית גידול דומים ותא חיסון לחדור 17. תאי GL261.luc יציבות להביע לוציפראז אשר מזרז החמצון של luciferin מצע המרת אנרגיה כימית לפוטונים ולכן אור לזיהוי. Luciferin יכול להינתן בבטחה לבעלי חיים וחוצה את מחסום דם המוח לאחר הזרקה תוך ורידית או intraperitoneal. בבעלי חיים במחקר קטנים כגון עכברים, פליטת אור יכול להתגלות חיצוני באופן בלתי פולשני 11. לכן, גידול ניתן להעריך באופן סדרתי ללא הצורך בהקרבת בעלי חיים או MRI היקר או הדמיה CT.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כרוך, לא רק התמרה lentiviral, אלא גם אימות של ביטוי היציב של לוציפראז במבחנה לפני תחילת ניסויי כל in vivo. הפסד של התמרה עשוי requiמחדש זיהום lentivirus חוזר. מבוא של גן עמידות לאנטיביוטיקה לתוך וקטור הביטוי יכול לשמש גם כדי לבחור עבור ביטוי בלוציפראז. טכניקה קפדנית נדרשת להשתלה תוך גולגולתי למקום reproducibly מספר התאים עקבי במיקום מדויק אנטומית כדי לאפשר השוואה בין קבוצות טיפול שונות. הבדל עיקרי בין המחקר הנוכחי והמחקרים קודמים של תאי GL261 לוציפראז להביע הוא השימוש בטכניקת יד חופשית להשתלת תאים בהשוואה לשימוש במסגרת stereotactic 18. אנחנו הוכחנו בעבר תוצאות השתלה בקנה אחד עם יד הטכניקה החופשית 19. היתרון של יד הטכניקה החופשית הוא היכולת לבצע ניתוחי תפוקה גבוהה של סוכני טיפול שונים. בידיים שלנו, אנחנו יכולים להשתיל כ -60 בעלי חיים בשעה 1.

לאחר השליטה בטכניקה, היישומים העתידיים של הטכניקה הם בלתי מוגבלים. כdemonstr GL261mitoses אטס גבוה וגידול מהיר דומה לגליובלסטומה אדם, ניתן להעריך טיפולים אנטי-שגשוג. כמו כן, ניתן להשתמש בטיפולים אנטי-פולשני ואנטי-angiogenic כגידולי GL261 הם פולשנית וangiogenic. יש להשתמש בזהירות בעת בוחנת את ההשפעה של תרופות כימותרפיות שמכוונים כנגד מטרות אנושיות. בהשוואה למחקרים קודמים ניצול xenografts גליובלסטומה אדם להביע לוציפראז 20, זה ייחשב הגבלה של המודל שלנו. כמו כן, ההשפעה של אסטרטגיות טיפול חיסוניות של גידול ניתן ללמוד במודל xenografted GL261.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לראג'ואנט קאור על הסיוע הטכני. ברצוננו להודות למקסוול טום על הסיוע בהכנת וירוס הלנטי. עבודה זו נתמכה על ידי הקתדרה ע"ש רזא וג'ורג'יאנה חטיב בניתוחי גידול בבסיס הגולגולת באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו, ופרופסור ויו"ר מייקל ג'יי מרצ'יז באוניברסיטת נורת'ווסטרן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
D-לוציפרין, אשלגן מלחזהב ביוטכנולוגיהLUCK-100חנות הרחק מהאור
תוכנת תמונה חיהקליפר מדעי החייםצור קשר להצעת מחירללא
קסנוגן לומינהקליפר מדעי החייםצור קשר להצעת מחיראף אחד
24-well; תרבית רקמה סטנדרטית; פלקון353047
CellTiter 96 AQueous בדיקת התפשטות תאים עם תמיסה אחת PromegaG3582none
Synergy 2 Multi-Mode ReaderBioTekצור קשר להצעת מחיראף אחד
96 באר צלחת בדיקה, צלחת שחורה, תחתית שקופה עם מכסה, תרבית רקמות TretaedCoster3603none
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01חומר בקרה
XylazineSigma-Aldrich23076-35-9none
28G מחט (עם מזרק) פישר   22-004-270AKA מזרק אינסולין
2% כלורהקסידיןפישרNC9756995AKA " נולבסאן"
3% מי חמצןפישרH312P-4יש לאחסן הרחק מאור
משחת עיניים1272830 הידועגם בשם " דמעות אקווה"
25 גרם 1 1/2 מחטBD בקטון דיקינסון305127ללא
אזמל חד פעמינוצה2975מס '21
גזהפישר22028563 חיטוי לפני השימוש
כרית חימוםDunlapHP950ללא
מהדק עור, סיכות, מסירסטולטינג59020ללא
PDI Alchol רפידות הכנהפישר23-501-711אין
רפלקס 7 מ"מ קליפים פצועים 100 חבילהBrain Tree Scientific, INC203 1000חיטוי לפני השימוש
רפלקס 7 מ"מ Wound Clip ApplierBrain Tree Scientific, INC204 1000חיטוי לפני השימוש
רפלקס 7 מ"מ מסיר קליפ פצעהמוח Scientific, INC205 1000ללא
ספוגית קצה עגול יחיד עם ידית עץQosmedix10107חיטוי לפני השימוש
תמיסת המלח המאוזנת של הנקס ללא Ca2+ ו-Mg2+ (HBSS)Gibco14170-112ללא
מזרק המילטוןהמילטון80300ללא
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2961ללא
שעוות עצםמכשיר הרווארד599864אף אחד
עץ

מקורות

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GL261In Vivoproliferation
הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.