הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות
במאמר זה
סיכום
תקציר
פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראזות הם אנזימים ביו-סינתטיים המזרזים העברה של קבוצת מתיל אחת או יותר מ-S-אדנוזיל-L-מתיונין לפוספטידיל-אתנולמין, מונומתיל-פוספטידיל-אתנולמין או דימתיל-פוספטידיל-אתנולמין כדי לתת מונומתיל-פוספטידיל-אתנולמין, דימתיל-פוספטידיל-אתנולמין או פוספטידילכולין. אנזימים אלה נמצאים בכל מקום בתאי בעלי חיים, בפטריות, ונמצאים גם בכ-10% מהחיידקים. הם ממלאים פונקציות חשובות שונות בפיזיולוגיה של התא מעבר לתפקידם הישיר בחילוף החומרים של השומנים כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, טרשת עורקים, צמיחת תאים או אלימות. כתב היד הנוכחי מדווח על בדיקה אנזימטית פשוטה ללא תאים המודדת את ההעברה של קבוצות מתיל טריטיות מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine לפוספטידיל-אתנולמין תוך שימוש בתמציות תאים שלמים כמקור אנזימים. הצורות המתילציה המתקבלות של פוספטידיל-אתנולמין הן הידרופוביות ולכן, ניתן להפריד אותן מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine מסיס במים על ידי מיצוי אורגני. ניתן ליישם בדיקה זו על כל סוגי תאים אחרים ולהשתמש בה לבדיקת מעכבים/תרופות ספציפיות לפוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז מעניין ללא צורך בטיהור האנזים.
מבוא
methyltransferase Phosphatidylethanolamine אנזימים (PEMT) לזרז את הקובץ המצורף קוולנטיים של קבוצות מתיל אחד או יותר באמצעות -adenosylmethionine S (SAM) כתורם קבוצה מתיל על PE, monomethyl-PE או דימתיל-PE לתת monomethyl-PE, דימתיל-PE ו / או phosphatidylcholine (PC). אנזימים אלה הם כמעט בכל מקום בתאים של בעלי חיים ופטריות. ניתן גם למצוא אותם בכמה צמחים 1 וכ -10% מחיידקים, במיוחד אלה שאינטראקציה עם אאוקריוטים 2.
PEMTs רלוונטי לביולוגיה של התא לא רק על ידי תרומה לייצור של מחשב, אשר הוא ברמת שומנים בדם העיקרית בתאים של בעלי חיים, אלא ג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הכנת תמצית 1. תא
- לגדול תאי שושנת יריחו בבקבוק סטרילי פלסטיק האטומים עם כובע הדוק אוויר ב 26 מעלות צלזיוס במדיום עשוי 1x M199 בתוספת 20 מ"מ HEPES pH7.4, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר heme , 0.35 גר '/ L Naco 2 H, 0.1 אדנין מ"מ, ו -2 מיקרוגרם / מיליליטר biopterin בלי ללחוץ. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים צפיפות תאים של 1-2 x 10 7 / מיליליטר.
- בטל supe....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג assay PEMT התלוי זמן, שבוצע עם תמצית כל תא שושנת יריחו כמקור אנזים באמצעות PE אנדוגני כמצע. כמות הרדיואקטיביות בשלב האורגני הייתה לכמת ידי ספירת נצנץ. מספרים וכתוצאה מכך נוצלו כדי לחשב את הסכום של קבוצות מתיל tritiated מועברות על גבי PE. פעילות PEMT הייתה ליניארי לכ 20 דקות. לאחר מכן הוא הגיע לרמה בסביבות 30 דקות, לאחר שזה נשאר קבוע לעוד 15 דקות. כצפוי, פעילות PEMT לא זוהתה כאשר אין תמציות תא נוספו לassay
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
assay זה פשוט, מהיר PEMT מאפשר כימות של צורות מפוגלים של PE שנובע מהעברה של קבוצות מתיל רדיואקטיביים מSAM על PE באמצעות תמצית תא כולו כמקור חלבון. הוא מהיר, רגיש, לשחזור, ומתאים גם לאנזימים מטוהרים 17. ניתן להוסיף Monomethyl- או דימתיל-PE לassay אם methyltransferase של עניין הוא ספציפי למצעים אלה ולא לPE 12,13,18,19. אם נעשה שימוש באנזים PEMT מטוהר, ניתן להוסיף PE לassay. הגבלה של פרוטוקול זה היא שassay אינו מזהה את מוצרי תגובות (monomethyl-PE, דימתיל-PE, או .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד העניינים הצהיר
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH ARRA RO3 AI078145 ו-1SC3GM113743 ל-RZ.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (פעילות ספציפית של 5-15 Ci/mMole) | Perkin Elmer | NET155050UC | Aliquot את המגיב והקפאה ב-20 מעלות; C; עקוב אחר הנחיות בטיחות הקרינה בעת השימוש |
| בקוקטייל מעכב פרוטאז | Roche Life Sciences | 11836170001 | לדלל אותו טרי |
| חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 425-600 מ"מ | סיגמא אולדריץ' | G8772 | |
| תמיסת חומצה ביקינצ'ונינית | סיגמא אולדריץ' | B9643 | |
| נחושת (II) סולפט | סיגמא אולדריץ' | C2284 | |
| מונה נצנוץ MicroBeta2 עם גלאי 1 | פרקין אלמר | 2450-0010 | |
| ספקטרופוטומטר Biomate 3 | Thermo Scientific | 840208300 | |
| תמיסת מלאי BSA (10 מ"ג/מ"ל) | ניו אינגלנד Biolabs | B9001S | |
| נוזל נצנוץ | מוצר מחקר International Corp | 111198 | |
| S-(5'-אדנוזיל)-L-מתיונין כלוריד (הידרוכלוריד) | קיימן כימיקלים | 13956 | מדללים את המגיב ב-20 מ"מ HCl ומקפיאים מינוטים ב-80 מעלות; C |
מקורות
- Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean. J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcho....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
