הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי

27.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53303

⸱

18 בינואר 2016

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

תקציר

אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה בשימוש נרחב למניפולציה מרחבית-זמנית מהירה ויעילה של גנים שונים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. ביטוי יתר של גנים רצויים אפשרי באותה מידה כמו מחקרי אובדן תפקוד בתיווך shRNA. לכן הוא מציע מגוון רחב של יישומים. ההיתכנות להתמקד בתאים מסוימים באזור מובחן מגדילה עוד יותר את מגוון היישומים הפוטנציאליים של שיטה שימושית מאוד זו. למיקוד יעיל של אזורים ספציפיים ידע על הדקויות, כגון השלב העוברי, המתח שיש להפעיל והכי חשוב מיקום האלקטרודות, הוא הכרחי.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר אלקטרופורציה ספציפית ויעילה ברחם של מספר אזורים במערכת העצבים המרכזית של העכבר C57BL/6. בפרט מוצג כיצד להעביר אזורים המתפתחים לקליפת המוח הרטרו-טחולית, קליפת המוח המוטורית, קליפת המוח הסומטוסנסורית, קליפת המוח הפיריפורמית, קורנו אמוניס 1-3, הפיתול המשונן, הסטריאטום, גרעין המחיצה הרוחבית, התלמוס וההיפותלמוס. למידע זה על השלב העוברי המתאים, מסופק המתח המתאים לשלב העוברי המתאים. והכי חשוב מתוארת מפת זווית, המציינת את המיקום המתאים של הקוטב החיובי. פרוטוקול סטנדרטי זה מסייע להקל על יעילות באלקטרופורציה של הרחם, מה שעשוי גם להוביל להפחתת מספר בעלי החיים.

מבוא

מאז התיאור הראשון בשנת 2001 על ידי שלוש קבוצות עצמאיות 1-3 אני n electroporation ברחם הפך לכלי סטנדרטי בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. בהשוואה לדור של עכברי נוקאאוט, שהוא, למרות טכניקות שיפור ברציפות, עדיין זמן וכסף רב, ברחם הערעורים electroporation בשל הפשטות שלה. אז, ברחם electroporation מאפשר gain- מהיר ויעיל ומחקרי הפסד של פונקציה 4.

לtransfect האזורים במוח, התמיסה המכילה את הפלסמיד הטעון השלילי מוזרקת לתוך חדר. במהלך הדופק החשמלי, ה- DNA הטעון השלילי נודד לכיוון הקוטב החיובי ולכן אזור transfected ניתן לבחור פשוט על ידי שינוי המיקום של הקוטב החיובי. זה לעתים קרובות הוכח כי אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית יכולים להיות ת"אrgeted 3,5-8. לדוגמא, המחקרים האחרונים מראים transfections הספציפי של ההיפוקמפוס, קליפת אגסי או סטריאטום 9-11. עם זאת, המידע על העמדות המתאימות הם לעתים קרובות טופל רק בקושי והם לא תמיד קלים להעביר לזנים שונים עכבר.

Transfection של שלבים עובריים מסוימים הוא רחוק מכך. גורמים המשפיעים על רבים חייבים להילקח בחשבון בעת בחירת ההגדרה לספציפי electroporation ברחם. ראשית, כדי transfect אופטימלי השלבים עובריים המתאימים, יש צורך בידע על המתח המתאים. מתח גבוה להקטין את שיעור ההישרדות, ואילו מתח נמוך להפחית את יעילות transfection 2,3,12. גם הגודל של ההנעה אלקטרודה ממלא תפקיד מכריע, משום שהשימוש במשוטי אלקטרודה שתוצאות גדולות מדי בסגוליות מופחתות או יכול לגרום למוות בשל חיבה של קצב הלב 4,12,13. מיושםמתח ואת הגודל והמיקום של ההנעה אלקטרודה הם התכונות החשובות ביותר שיש לשקול, אבל יש גם גורמים נוספים המשפיעים על התוצאה של electroporation, כמו הכמות השימושית של ה- DNA-פתרון.

פיתחנו פרוטוקול מפורט המאפשר transfection המהיר והיעיל של אזורי מוח השונים של עכבר C57BL / 6 12. בפרוטוקול זה מידע מפורט על המתח כדי לשמש ואת הגודל של ההנעה אלקטרודה לסגולית משופרים מסופק. יתר על כן, מידע על החדר להיות מלא יחד עם המלצות לסכום של פתרון פלסמיד ואת המיקום של האלקטרודה מסופקת. אינדיקציה למידע מיקום מפורט במפה והדמיה נוספת של עמדות אלה מאפשרת ספציפיים פשוטים ויעילים ברחם electroporation של קליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי לא,הוא קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב, התלמוס וההיפותלמוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: הטיפול בעכברים והפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות אירופאיות, לאומיות ומוסדיות לטיפול בבעלי חיים.

1. ברחם Electroporation

הערה: ברחם electroporation בוצע כפי שפורסם בעבר 12,14. לכן, השיטה היא רק תיארה בקצרה בבאה (איור 1).

  1. הכנות
    1. הכן פתרון מהיר ירוק צבעוני ללא רעלן פנימי מתקדם פלסמיד הכיתה transfection (המכיל 1,5 pCAGGS) כפי שתואר קודם לכן 12.
    2. משוך ולטחון (35 זווית מעלות) נימי זכוכית בורוסיליקט (0.8-.9 קוטר) לזריקות.
    3. לעקר מכשירים.
  2. כִּירוּרגִיָה
    1. לנהל משככי כאבים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, SC, 24 דיפו שעות) לפחות 30 דקות לפני תחילת הניתוח.
    2. שמור את האורך שלההרדמה למקסימום של 35-45 דקות (שלב III - שלב של הרדמה כירורגית פי 15 guedel - דקות 25-30 מקסימליים).
    3. הרדימי עכברי מתוזמן בהריון עם isoflurane (אינדוקציה בתא: 2.8%, ניתוח באמצעות מסכה: 2.5%). לאשר הרדמה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
    4. החל משחה העין כדי למנוע עין-יובש במהלך הרדמה.
    5. לחטא את אזור הניתוח עם 7.5% פתרון Providone-יוד ולכסות את העכבר עם גזה סטרילית (לחה עם פתרון 0.9% מלוחים נזיל אלכוהול) עם רק את אזור הניתוח החשוף.
    6. גזור לפתוח את חלל הבטן עם אזמל (חתך בעור: 1.5-2 סנטימטר, חתך שריר: 1-1.5 סנטימטר).
    7. לשמר את חלל הבטן נפתח מהתייבשות על ידי הרטבה עם 0.9% תמיסת מלח נזיל אלכוהול חיממה או תמיסה איזוטונית סטרילית אחרת כמו בבימויו של צוות או ועדה וטרינרים.
    8. לחלץ בזהירות קרנות רחם (באמצעות מלקחיים טבעת, לא לגעת ברחם עם אצבעים).
  3. הזרקה של ה- DNA וelectroporation. הערה: הפרטים המדויקים למיקוד אזורים ספציפיים מצוינים בסעיף 2.
    1. לאט לאט להזריק את פתרון ה- DNA בצבע לתוך החדר כפי שצוין באיור 1 וסעיף 2 דרך נימי ורוסיליקט מוכנות.
    2. החל המתח המתאים לשלב העוברי המתאים (למשל., 36-38 V עבור E14) באמצעות אלקטרודות מיוחדות מלקחיים מסוג פלטינה (אלפיות שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). Pulse משוטי electroporation במהלך היישום של המתח כדי למזער את הנזק של קיר הרחם.
  4. / טיפול שלאחר ניתוח electroporation ההודעה
    1. להחליף את קרן הרחם בזהירות בחלל הבטן.
    2. לתפור את השרירים וחתך בעור בנפרד.
    3. תן את שאר עכבר על מכשיר תמיכה תרמי להתאוששות.
    4. לפקח על העכבר במהלך התאוששות (התנהגות, הזנה וצריכת מים), 4 שעות, 24 שעות ו -48 שעות לאחר ניתוח. במידת צורך, יחול משככי כאבים נוספים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, 24 דיפו שעות) עבור 2 ימים נוספים.

2. Transfection של תחומי מוחין ספציפיים

הערה: המיקום של הקוטב החיובי מוצג כזווית בין הציר האנכי דרך החדר מלא בפתרון ה- DNA (החדר ממני או השלישי) ואת המיקום של הקוטב החיובי. כאשר ממלאים את החדר השמאלי העמדות-הפוך מראה. באיור 4 העמדות של קדמוני האוזן מוצגות, המספקות נקודות התייחסות חשובות.

  1. Transfection של אזורים בקליפת המוח (איור 2 א, לוח 1).
    1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של אזורים בקליפת המוח להשתמש בעוברי E14.
    2. הזרק 1.5-2 μl DNA-פתרון המכיל DNA 4 מיקרוגרם בחדר לרוחב תקיןבאמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
      1. מקם בזהירות את העובר באמצעות מלקחיים טבעת כך שאין כלי נראים מעל האתר לנקב.
      2. לאט לאט להזריק את ה- DNA-הפתרון כ 0.75 מ"מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ"מ לרוחב מתפר sagittal (איור 3). ודא שעומק ההחדרה הוא 1.2 מ"מ (E14, נמדד מדופן הרחם). בדקו צביעה כחולה-ירוקה עם תיחום חד.
    3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 36-38 V.
      3. מניחים במרכז אלקטרודות רק הקדמי של primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש קליפת retrosplenial 330-0 מעלות, לtransfect הקורטקס המוטורי 0-40 °, לtransfect הקליפה החושית 40-95 °, לtransfectקליפת אגסי 95-110 מעלות (איור 2 א).
    4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 4 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
  2. Transfection של ההיפוקמפוס (איור 2, לוח 1).
    1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של היווצרות בהיפוקמפוס להשתמש עוברי E15.
    2. להזריק 2 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
    3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 38-40.
      3. מניחים במרכז הקוטב השלילי רק הקדמית של primordium האוזן והמרכז oו הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן.
      4. לtransfect gyrus המשונן להשתמש זוויות 190-210 מעלות, לtransfect ammonis קורנו (CA) 3 210-230 מעלות, לtransfect Ca 2 230-250 מעלות, לtransfect ° CA1 250-275 (איור 2).
    4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. לבצע ניתוח לאחר היווצרות בהיפוקמפוס מלאה (לאחר הלידה, p21) כמפורט בסעיף 3.
  3. Transfection של גרעין במחיצה לרוחב וסטריאטום (איור 2 ג, טבלת 1)
    הערה: הזוויות חופפות עם אלה לtransfecting היפוקמפוס. לtransfect גרעין רוחב המחיצה וסטריאטום ללא שלבים עובריים מוקדם transfection ההיפוקמפוס לא רצוי (E12) ביעילות צריך להיות בשימוש.
    1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של הגרעין במחיצה לרוחב וstriatאממ להשתמש עוברי E12.
    2. הזרק 1 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
    3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש באלקטרודה 0.5 מ"מ.
      2. השתמש 33 V.
      3. מניחים במרכז את האלקטרודות ברמה של primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש גרעין במחיצה לרוחב 100-170 מעלות, לtransfect ° סטריאטום 170-240 (איור 2 ג).
    4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
  4. Transfection של התלמוס וההיפותלמוס (איור 2 ד, טבלת 1)
    1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. בuelectroporation טרו של עוברי E12-E13 שימוש התלמוס וההיפותלמוס.
    2. הזרק 1-1.5 DNA-פתרון μl המכיל 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב (משמאל או מימין) דרך נימי ורוסיליקט מוכנות. חכה במשך 2-3 דקות, עד שהפתרון הוא מתפזר לחדר השלישי. לחלופין ישירות להזריק לתוך החדר השלישי.
      הערה: זה משפר ספציפי אבל עלול לגרום לירידה בשיעור הישרדות (סיכון גבוה לניזק).
    3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש באלקטרודה 0.5 או 3 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 33-35 V.
      3. מניחים במרכז אלקטרודות רק אחורי primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש התלמוס 25-40 מעלות, לtransfect ° ההיפותלמוס 90-180 (איור 2 ד).
    4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כdescribed בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.

3. זלוף קיבוע

  1. הכנות
    1. paraformaldehyde החם 4% (PFA) עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. ממלאי מזרק 50 מיליליטר עם PBS (4 ° C) ומזרק שני עם PFA חימם. למנוע בועות.
    3. חבר את המזרקים לברזלי שלוש-דרך. חבר את הקצה השלישי לסט עירוי מכונף (פרפר).
    4. לשטוף את סט העירוי המכונף עם PBS.
  2. זִלוּף
    1. עמוק להרדים את העכברים (בהריון או לאחר לידה transfected) עם יישום תת עורית של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (7.5 מ"ג / קילוגרם).
    2. לאשר את שלב הסובלנות כירורגית על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
    3. פתח את חלל הבטן מתחת רק כלוב הצלעות.
    4. בזהירות לחתוך את הסרעפת.
    5. לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות באמצעות חתך בדואראתר אח עד עצם הבריח.
    6. הכנס את הקצה של הפרפר לתוך החדר השמאלי בלב (החל מהשיא של הלב).
    7. חותך את תוספת פרוזדורי שמאל.
    8. לאט perfuse העכבר עם PBS (כ -10 מיליליטר).
    9. לעבור הסתום המשולש.
    10. Perfuse העכבר עם 5-10 מיליליטר PFA 4%.
    11. לערוף את העכבר באמצעות מספריים ולנתח את המוח מתחיל בנקב הגדול. לבצע הנתיחה כפי שפורסם בעבר 16.
    12. Postfixate המוח במשך 2 ימים בPFA 4%. שמור את המוח על 4 מעלות צלזיוס בחושך.

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. צור 70 מיקרומטר חלקים (לדוגמא, עם vibratome).
  2. אופציונאלי: שפר את הקרינה עם מכתים נוגדן.
    1. לחסום את החלקים עבור שעה 1 ב RT (0.1-0.2% Triton X-100, 5% בסרום עז נורמלי)
    2. דגירה O / N עם הנוגדן המתאים (אנטי-GFP, 1: 1,000)
    3. לשטוף 3-5 פעמים עם חיץ 0.1 M פוספט.
    4. דגירה שעה 3-5 עם נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המתאים המשני (אלקסה פלואוריד 488 נגד הארנב-IgG מצומדות, 1: 1,000).
    5. אופציונאלי: Counterstain עם 4-6-diaminodino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 גר '/ מיליליטר במאגר M 0.1 פוספט) 1 דקות.
    6. ניתוח הקרינה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2, מציג דוגמאות לספציפיות electroporation ברחם של אזורי פיתוח לקליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי, קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב , התלמוס וההיפותלמוס. תוצאות transfections מוצגות ליד הזווית המומלצת (איור 2). להדמיה טובה יותר של הזוויות in vivo העמדה של האלקטרודה (0.5 מ"מ) מוצגת גם על עובר (איור 5, עובר ברחם, עובר בצק מי שפיר, עובר גז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר את קליפת המוח הרטרו-טחולית, קליפת המוח המוטורית, קליפת המוח הסומטוסנסורית, קליפת המוח הפיריפורמית, קורנו אמוניס 1-3, הפיתול המשונן, הסטריאטום, גרעין המחיצה הרוחבית, התלמוס וההיפותלמוס של עכברי C75BL/6. עם כל המידע שסופק זהו הפרוטוקול הראשון, המספק את כל המידע הדרוש כדי לשחזר בקלות טרנספקציות של אזורי המוח הללו בעכבר C57BL/6. פרסומים קודמים התמקדו בעיקר בכמה אזורים ספציפיים ולכן המידע המפורט הדרוש לטרנספקציות ספציפיות הוא רק בקושי סטנדרטי.

המיקום והגודל של ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

טכני נתמך על ידי מלאני פייפר וניקולאי שמרובסקי (המכון לאנטומיה מיקרוסקופית ונוירוביולוגיה, המרכז הרפואי האוניברסיטאי מיינץ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מקסי פלסמיד EndoFreeQIAGEN12362
רוט ירוק מהיר0301.1
pCAGGSAddgene
נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר 0.8-0.9 מ"מ)היה Precision Instrument Inc.1B100F-4
איזופלורן (פורן)אבוטPZN 4831850
קרפרופן (רימדיל)פייזר GmbHמספר אישור: 400684.00.00
משחת עיניים (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer PZN 01578681
0.9% בנזיל אלכוהול 0.9% תמיסת מלחבית מרקחת
של המרכז הרפואי האוניברסיטאי מיינץ
גזה (ES-Kompressen)הרטמן407835
סטרילי 5-0 תפר משי פרמה-ידEthicon Johnson & ג'ונסוןK890H
מלקחיים טבעתיים 1/1.5 מ"מFine ScienceTools 11101-09
מלקחיים טבעתיים 4.8/ 6 מ"מFine Science Tools11106-09
מלקחיים טבעתיים 2.2/ 3 מ"מFine Science Tools11103-09
Adson מלקחיים משוננים ישרים 12 ס"מFine Science Tools1106-12
Irisמספריים-עדין ישר-חד/ קהה 10 ס"מכלי מדע עדינים14028-10
מספריים מיונז-סטיל-ישר 15 ס"מכלי מדע עדינים14012-15
Dumont #5 מלקחיים-Inoxכלי מדע עדינים11251-20
מחזיק מחט Castroviejo-עם נעילה-טונגסטן קרביד 14 ס"מכלי מדע עדינים12565-14
Elektroporator CUY21 SC נפה ג'ין ושות'
FST 250 מעקר חרוזיםחם Fine Science Tools18000-45
Microgrinder EG-44Narishige
P-97 MicropettePuller Sutter Instrument CompanyP-97
אלקטרודות פלטינה 650P 0.5 מ"מNepageneCUY650P0.5
אלקטרודות פלטינה 650P 3 מ"מNepageneCUY650P3
אלקטרודות פלטינה 650P 5 מ"מNepageneCUY650P5
אלקטרודות פלטינה 650P 10 מ"מNepageneCUY650P10
מערכת הרדמהRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Vapor 19.3
צלחת חימוםRothacher-Medical GmbHHP-1M
בקר טמפרטורה 220V ACRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV

מקורות

  1. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  2. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  4. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
  5. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
  6. Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
  7. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  8. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37(2011).
  9. Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
  10. Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
  11. Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
  12. Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
  13. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  14. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
  15. Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
  17. Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
  18. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

targetingDNAtargeting
Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.