שיטה להערכת מאפייני החיזוק של אתנול בחולדות ללא מצוקת מים, סכרין Fading או הדרכת גישה מורחבת

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ויעילה ליזום אופרנטית במהירות להגיב עבור אתנול בחולדות כי בניגוד שיטות סטנדרטיות, אינו מחייב מצוקת המים או סוכרזית / סוכרוז דהייה ליזום להגיב.

תקציר

אופרנטית שיטות אוראליות עצמי ממשל משמשות כדי ללמוד את המאפיינים של אתנול החיזוק בחיות. עם זאת, השיטות הסטנדרטיות דורשות דהיית סכרין / סוכרוז, מצוקת מים ו / או הדרכה מורחבת ליזום אופרנטית להגיב בחולדות. מאמר זה מתאר שיטה חדשה והיעילה ליזום אופרנטית במהירות להגיב עבור אתנול נוחה הנסיינים ואינו דורש מצוקת מים או דהיית סכרין / סוכרוז, ובכך לחסל את לבלבל הפוטנציאל של שימוש בממתיקים במחקרי מנהל עצמי אופרנטית אתנול. באמצעות שיטה זו, חולדות Wistar בדרך כלל לרכוש ולתחזק מינהל עצמי של פתרון אתנול 20% בתוך פחות משבועיים של אימונים. יתרה מכך, ריכוזי והטבות אתנול דם משיגים תוצאות טובות עבור מושב עצמית ממשל 30 דקות. יתר על כן, נלטרקסון, תרופה ה- FDA עבור תלות באלכוהול כי הוכח לדכא מינהל עצמי אתנולבמכרסמים, מינון באופן תלוי פוחת צריכת אלכוהול ומוטיבציה לצרוך אלכוהול עבור אתנול עצמית ניהול חולדות 20%, ובכך אימות השימוש בשיטה חדשה זו כדי ללמוד את המאפיינים של אלכוהול החיזוק בחולדות.

מבוא

פיתוח מודלים של בעלי חיים כדי לחקור את השפעות החיזוק של תרופות הוכיח כלי חשוב ללמוד התמכרות לסמי אדם. באופן ספציפי יותר, מנהל עצמי אופרנטית הוא מודל התנהגותי בשימוש נרחב כי הוא אחד האמצעים היעילים ביותר להערכת השפעות החיזוק החיוביות של פתרון אתנול נצרך דרך פה. סוגיה מוקדם עם פיתוח מודל כזה היה טעם מרתיעה העיקרי של ריכוזים גבוהים של אתנול עבור רוב מכרסמים, תופעה משותפת גם בבני אדם עם ניסיון מועט או לא עם אלכוהול ^1. פרוטוקול סטנדרטי כדי להתגבר על מחסום זה דורש מצוקת מים ו / או סכרין או סוכרוז דהייה לרכישה והתחזוקה של מנהל עצמי. עם זאת, שתי הגישות האלה אינן יתרון. הם דורשים תקופות ארוכות של אימונים כדי ליזום פשוט להגיב על אתנול לקבל שיעור הצלחה יחסי של רכישה. השימוש בממתיקים גם משלב הטיה פוטנציאליתהפרשנות של נתוני המנהל עצמי. מגבלות אלה אינן חלים על הפרוטוקול הבא.

בקצרה, שמשון ועמיתיו ² הראו כי המסת אתנול פתרון מתוק של סוכרוז 20% ולאחר מכן דמימה המתיקות מעל 4 שבועות של אימון נדרש ליזום להגיב עבור אתנול 10% במים. יתר על כן, צריכת אתנול אמין בדרך כלל מושגת ב 6 עד 8 שבועות ^1-3. גישה זו היא בעייתית מאוד. ראשית, זה דורש זמן ממושך של אימונים לפני חוקרים יכולים להתחיל למדוד אתנול מנהל עצמי. לעומת זאת, מינהל עצמי תוך ורידי של קוקאין או הרואין דורש 1 - 0 ימי אימונים טרום התרופה על מנוף אספקת מזון בחיות מוגבלים מזון, ויציב להגיב על תרופת מושגת לעתים קרובות 10 - 12 ימים ^4,5. מגבלה נוספת של שיטה זו היא העובדה כי סכרין סוכרוז הם מתגמלים מאוד חולדות לעורר דפוסי פעילות המוח שלimilar לסמים של התעללות, וכך מציג הפוטנציאל מקעקע ב מנהל עצמי אתנול לומד ^6-9. לבסוף, חולדות רכישת עצמית ממשל של פתרון אתנול באמצעות השתנות להראות בשיטה זו רכישה בשיעור ותגובת ^1,10, עם חלק ניכר של חולדות נשללו בעקביות מניסויים בשל רכישת כושל ו / או שיעור תגובה מספק.

לעומת זאת, עם פרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה פשוטה אך יעילה רכישה ותחזוקה של מנהל עצמי האוראלי של אתנול 20% בפתרון מים כי אינו מחייב מצוקת מים, סוכרוז / דהיית סכרין או הכשרת גישה מורחבת. תחקיר שנערך לאחרונה מצא כי מינהל עצמי עבור אתנול אוראלי מציג עקומת מנה תגובה הפוכה בצורת U עם צריכת אתנול הגבוהה ביותר במהלך מינהל עצמי בריכוז 20% אתנול, ובכך לספק רציונל לבחירת 20% פתרון אתנול experim שלנוental עיצוב ^11.

פרוטוקול

כל הנהלים נערכים בהתאם מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. טיפול בבעלי חיים והשיכון

1. בהגיעכם המושבה, חולדות Wistar זכר בבית ששוקלת 200 - 225 גרם בעת הכניסה בזוגות טמפרטורה (21 מעלות צלזיוס) וסביבה מבוקרת לחות עם מחזור אור כהה הפוך 12 שעות.
   הערה: בהתאם הרציונל של הניסויים, חולדות עשויות להיות חד שוכן.
2. אפשר החולדות להסתגל ביבר ואת מחזור אור לפחות שבוע לפני תחילת ניסוי ולטפל בהם מדי יום. לשקול את החיות, פעם בשבוע.
3. תן חולדות גישה חופשית זולל ומי ברז למשך הניסוי (מניעת מים אין צורך ליזום להגיב ^12). לנהל את כל הבדיקות התנהגותיות בשלב הכהה של מחזור האור-חושך בחדר בדיקות כהה.
   הערה: למרות שאנחנו משתמשים באופן שגרתי חולדות Wistar זכר בוגר צעיר (ימים לאחר הלידה 62 - 65), עמ 'זוrotocol יכול תיאורטית להיות מתאים חוקרת זנים אחרים של חולדות, כמו גם יחסי מין ו / או הפרשי גיל.

2. הדרכה אופרנטית

1. לנהל את כל ההדרכה והבחינות התנהגותי בתאי אופרנטית זהים מדידת 30.5 × 29.2 × 24.1 סנטימטר המכיל קומות לרשת ומחבתות פסולות מרופדות מצעים (השתנה בין בעלי חיים כדי להפחית רמזי ריח), שוכן בתאי קול הפחתת מצויד מאווררים לאוורור .
   הערה: חולדות מאומנות על ידי-תניה אופרנטית מיום 1 של אימונים (תגובה על מנוף יש צורך לקבל חיזוק) בין + 1 h ו + 8 שעות של חושך המחזור. אין חשיפה טרום לאלכוהול, ולא מזון או בעיצוב נוזל לפני אימון אלכוהול.
2. לצייד כל תא אופרנטית עם אורות גירוי, משאבות מזרק ושני מנופים נשלפו מיקומו רוחבי אל כלי קיבול כוס נוזל. תאי ושליטה ממשק על ידי מחשב באמצעות תוכנה מתאימה.
   הערה:רוב הספקים יספקו חבילות מנהל עצמי המכילות את כל המרכיבים הדרושים, כמו גם תוכנות וממשקים צורכות לשלוט על התאים.
3. כתוב תכנית אופרנטית אוויר שרצון יחס קבוע (FR) תזמון חיזוקי 20% אתנול (לוח זמנים אופרנטית שבו תגובה מתחזקת רק לאחר מספר מסוים של תגובות) על פי הוראות היצרן. לדוגמא, ביחס של 1 קבוע יחס, חולדות צריכות לייצר תגובה אחת להשיג חיזוק (ראה במקטע קבצי הקוד משלים דוגמא של תכנית fr1). בצע את הפקודות הבאות.
   1. רחב שתי ידיות לסמן תחילתה של הפגישה לאותת זמינויות אלכוהול.
      הערה: מנוף לחץ אחת על הידית הקשורים אתנול (פעיל) מתוגמל על ידי המסיירת בהיקף של 100 μL של אתנול 20% במים הסמוכים שתייה גם ויוזם תקופה מקבילה 5-זמן קצוב אותתה על ידי האירקיו-אור מעל הידית. The-אור קיו הוא הציג ביום 1 של אימונים.
   2. במהלך פרק הזמן קצוב, שיא להגיב למרות שאין לו השלכות מתוכננות. תגובות רשומות על הידית האחרת (לא פעילה) אף שמעולם יש להם שלכות התנהגותיות. הערה: המנוף הפעיל משמש כביקורת להעריך התנהגות שאינה ספציפית.
   3. רשום את מספר תגובות על המנוף הפעיל (שיעורי תגובה) ומספר התגמולים אתנול 20% הרוויחו.
   4. לאחר 30 דקות חלפו, לחזור בו שתי הידיות כדי לסמן את סופה של הפגישה כדי לסמן את סופה של זמינות אלכוהול.
   5. שמור בארכיון את כל הנתונים.
4. לפני תחילת האימון, לבדוק את התפקוד התקין של כל המכשירים בתא אחד אופרנטית (מנופים נשלפים, מנפק נוזל).
5. הכן את הפתרון אתנול 20% v / v מ -190 הוכחה (95%) אתנול מדולל במים ברז.
   הערה: פתרון אתנול יכולים להישמר בטמפרטורת החדר. בהתאםעל היצרן, פתרונות אתנול מניות עשויים להיות עד 99.98%. כמו כן שימו לב, ואילו כתבי יד שפורסם, ריכוזי אתנול בדרך כלל מוצגים נפח / נפח, וחלקם עשוי להציג אותם כמו משקל / נפח.
6. מלא את המזרק עם הפתרון אתנול 20% ולוודא שאין דליפות או בועות אוויר בתוך קווי העירוי. ידני לדחוף נפח קטן של אתנול מבעד לקווי העירוי לוודא כי אתנול יימסר כראוי לשקע מתגובת חיזק הראשונה. ייבש את הקיבול עם מגבת נייר ולוודא כי הוא ריק לפני תחילת הפגישה.
7. טענת את תוכנת שולטת זמני FR של חיזוק אתנול 20%
8. רכבת operant- וחולדות נאיבי סמים תחת לוח זמנים fr1 כדי עצמית לנהל אתנול 20% ללא מצוקת המים במהלך 30 מפגשים דקות.
   1. הובלת החולדות מן הביבר לחדר הבדיקות באמצעות כלוב תחבורה.
   2. להקצות לכל חולדה בתא אחד.קח בכל עכברוש פרט מכלוב תחבורה והכנסת אותו לתא עצמית הממשל המוקצה.
   3. נסה לשמור על מצב של הניסוי עקבי בכל יום. לכן, תמיד לבדוק חולדות באותו התא עצמית ממשל פחות או יותר באותו זמן בכל יום.
   4. הפעל את התוכנה כי יוזם את לוח הזמנים fr1 של חיזוק אתנול 20%.
   5. בסוף הפגישה, להסיר את החולדות מתא המנהל העצמי ולהחזיר אותם הביבר.
   6. על מנת לאשר באופן ידני שפתרון האלכוהול נצרך על ידי בעלי החיים, להשתמש במגבת נייר ולבדוק אם הקיבול הוא מיובש. לחלופין, השתמש מזרק 1 מ"ל או 2 ולאסוף את הנוזלים שנותרו קיבול לאמוד את היקף שאינו נצרך.
      הערה: הערכה מדויקת יותר (אך גם יקר יותר), אפשר לצייד כל תא עם מערכת lickometer מחובר קיבול כוס נוזל המאפשר ספירה מדויקת של ללקקs המיוצר על ידי החולדות במהלך הפגישה עצמית הממשל.
   7. לנקות את רצפת קירות רשת של כל תא עם חומר חיטוי לפני שטח.
   8. לאחר השימוש, לשמור על קווי עירוי על ידי ניקוי אותם עם פתרון אתנול 70%. כאשר אינו בשימוש, הכנס את הכובע כדי למנוע עובש ואבק.
9. לאחר כל פגישה, לאסוף ולנתח את הנתונים שנוצרו. ביתר פירוט, לחשב את המספר הממוצע של לחיצות מנוף פעילות, המספר הממוצע של תגמולי אלכוהול שהתקבל וכן המספר הממוצע של בתי מנוף פעילים.
   הערה: ברוב העיתונים, צריכת אלכוהול מוצגת גם צריכת אתנול גרם / קילו (משקל גוף). צריכת האתנול ניתן לחשב באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   עם נפח נצרך (מ"ל) - מספר rewards הרווחת ± נפח / גמול וצפיפות יחידתי של אתנול בטמפ 'החדר - 0.789 גרם / מ"ל.
   לדוגמה, אם חולדה במשקל 400 גרם הרוויח 20 Rewaכבישי פתרון אתנול נ 20% / v:
   
10. לנהל פגישות 5/6 ימים בשבוע עד התייצבות ביצועים (מוגדר מינימום של 15 הפעלות ואין שינוי בשיעור העולה על 15% במספר הכולל של תגמולים שנצברו במהלך 3 המפגשים האחרונים).
    הערה: לאחר חולדות הגיעו בסיס יציב על fr1, תכנית התניה אופרנטית ניתן לשנות על פי הוראות היצרן כדי להגדיל את מספר התגובות צורכות לקבל גמול אלכוהול. היחס הקבוע יכול למשל להיות עלה ל FR2 או FR3 כדי למזער חיזוק בשוגג.
11. למדוד ריכוזי אתנול דם:
    1. כדי לאשר את הפירות שהתקבלו בפגישה עצמית הממשל שנצרכים על ידי חולדות, למדוד ריכוזי אתנול דם לאחר מינהל עצמי. לאחר חולדות הגיעו בסיס יציב, לאסוף דם מעורק הזנב לרוחב מייד לאחרהפגישה. הכנס מחט 23 G לתוך כלי הדם ולאסוף 50 דגימות μL דם באמצעות צינור נימים.
    2. העברת דגימות דם 50 μL עד 10 בקבוקונים אמיץ מ"ל ולהוסיף 50 μL של 1: 1,000 איזופרופיל אלכוהול כסטנדרט פנימי. כן עקומת תקן 10 כדי 300 מ"ג / ד"ל מסטנדרטים אתנול. תהליך דגימות עם סמפלר אמיץ עם טור כרומטוגרפיה ¹³ בהתאם להגדרות היצרן.
12. יחס מתקדם
    1. השתמש יחס מתקדם (PR) לוחות זמנים להעריך את המוטיבציה של החיות לצרוך פרס ^14. PR הוא לוח זמנים אופרנטית שבו את מספר התגובות להשיג חיזוק הוא גדל בהדרגה (במונחים אחרים, חולדות צריכות לעבוד קשה יותר עבור כל גמול רצוף).
       הערה: בניגוד FR הפעלות, הפעלת PR אינה מתוזמן ו יפוטר רק פעם אחת 30 דקות שחלף ללא יחס הושלם.
       1. מניחים חולדות בקופסאות אופרנטית שהוקצו להם ולאפשרלהם להגיב על אתנול 20% תחת לוח זמנים PR של חיזוק: שמור את כל תנאי הניסוי זהים לאלה המשמשים את לוח הזמנים FR (ראה שלב 2.3), למעט להגביר את הדרישה תגובה או עלות בתוך המושב (כלומר, מספר בתי מנוף נדרש על מנוף פעיל ולקבל תגמול אתנול יחיד) על פי הנוסחה הבאה: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 ... הערה: דוגמה תכנית יחסי הציבור מסופקת במקטע קבצי קוד משלימה.
       2. לסיים את הפגישה PR פעם 30 דקות שחלף ללא גמול.
          הערה: נקודת העצירה מוגדרת הדרישה בתגובה האחרונה שהשלימה במהלך פגישת PR.

3. בדיקת תוקף הניבוי של מודל אופרנטית של אלכוהול עצמית הממשל

הערה: לאחר חולדות רכשו בסיס עצמי ממשל יציב (ראה שלב 2), אפשר להעריך את תוקף הניבוי של המודל על ידיבדיקת יעילותם של נלטרקסון, תרופה ה- FDA כרגע תלות באלכוהול בהפחתת מינהל עצמי אתנול 20%. אנו ממליצים לעשות בדיקה זו על FR הגבוה ביותר שהושגו במהלך אימון (FR2), כאשר התגובות הן גבוהות באופן מהימן. ברגע תוקף ניבוי מוקם, המודל יכול לשמש כדי להעריך מועמדי תרופה חדשים.

1. לפני יום בדיקה, לתת חולדות זריקות מלוחות תת עורית 30 דקות לפני עצמית ממשל הפעלות להרגיל אותם הזריקה במהלך מינימום של שני מפגשים רצופים עצמי ממשל או עד להגיב עבור אתנול אינו מושפע על ידי הזריקות המלוחות (המוגדרות ללא שינוי יותר מ -15% במספר הכולל של תגמולים שנצברו במהלך 2 הפגישות האחרונות).
2. ממסי נלטרקסון מלוחים ולהתאים את ה- pH להגיע ניטראלי כדי להקל על הזריקות לבעלי החיים. להזריק את התרופה בהיקף של 1.0 מ"ל / ק"ג 30 דקות לפני הפגישה, באמצעות תוואי תת עורית של הממשל. הערה: ליטרature מספק ראיות טובות עבור בחירה מנה בין הטווחים של 0.1 - 1 מ"ג / ק"ג, כך 0.1, 0.3 ו 1 מ"ג / ק"ג משמשים בפרוטוקול זה.
   הערה: מחקרים מצביעים על שימוש בשני מהסלולים תת עורית ו intraperitoneal של ממשל נלטרקסון, אם כי העצמה שלהם עשויה להיות שונה עם הזרקה תת עורית להיות פי 30 יותר חזק כי זריקות intraperitoneal ^15. מסיבה זו, אנו ממליצים להשתמש תוואי תת עורית כמו השימוש במסלול זה עבור הזרקה של נלטרקסון יאומת משוכפלים על ידי מעבדות שונות במגוון של ריכוז בין 0.1 ו 1 מ"ג / ק"ג ^12,15,16.
3. במהלך יום המבחן, להזריק חולדות בסדר מאוזן / אקראי בעיצוב בין-נושאים על אחת מאבני מחזורי מינון ארבעה נלטרקסון (0, 0.1, 0.3 ו 1 מ"ג / ק"ג) 30 דקות לפני הפגישה עצמית הממשל.
4. בין כל מחזור מינון, לאפשר חולדות כישלון התרופה עם מינימום של שני מפגשים רצופים עצמי ממשל או עד להגיב עלאתנול הוא חוזר לנקודת ההתחלה. הערה: כתוצאה מכך, בסוף המבחן, כל העכברושים כבר הזריקו בכל אחת מארבע מנות.
5. לאחר שלב זה, בחר את המינון היעיל ביותר (1 מ"ג / ק"ג) ולבדוק את השפעת נלטרקסון על המוטיבציה של החיות לצרוך אלכוהול בלוח זמנים יחס פרוגרסיבי (ראה שלב 2.12).

תוצאות

איור 1 מציג את עצמי התנהגות ממשל הנציג של חולדות Wistar operant- ותרופות-נאיביות (שמונה קבוצות שונות בהיקף כולל של 239 חולדות) מאומן על פי לוח זמני fr1 כדי עצמי לנהל אתנול 20% ללא מצוקת מים או סוכרזית / דהיית סוכרוז במהלך פגישות 30 דקות. עם פרוטוקול זה, חולדות ליזום מנוף לחץ כדי לקבל גמול אתנול מהר מאוד, כבר קבל יותר מ -10 פרסים במהלך הפגישות הראשונות (איור 1 א). הם מגיעים שיעורי להגיב יציבה על מנוף פעיל על ידי מוש...

דיון

עם פרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה חדשה להשיג ולתחזק מינהל עצמי אוראלי יציבה של אתנול 20% בחולדות כי בניגוד המודלים הקלאסיים של מינהל עצמי אתנול, אינו מחייב את השימוש מצוקת המים, הכשרה גישה מורחבת, או סוכרזית / סוכרוז דהייה ^12. יתר על כן, נלטרקסון, תרופה ה- FDA כרגע תלות באלכוהול, בהצלחה מקטין אלכוהול מינהל עצמי ואת המוטיבציה לצרוך אלכוהול של חולדות Wistar מאומן עם פרוטוקול זה. תוצאה זו מספקת אימות תרופתית חשובה של הפרוטוקול כפי שהוא עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא הנחתת קול MDF גבוה במיוחד, פנים: 22 אינץ' רוחב x 22 אינץ' H x 16 אינץ' D	Med Associates Inc.	ENV-018MD
תא בדיקה מודולרי גבוה במיוחד עם חלק עליון שונה, מחבת פסולת ופוטוקרן	Med Associates Inc.	ENV-007CT-PH
רצפת רשת נירוסטה לחולדה או פרימטים קטנים	Med Associates Inc.	ENV-005
מנוף נשלף	Med Associates בע"מ	ENV-112CM	2 של SA chambers
Stimulus Light, עדשה לבנה בגודל 1 אינץ', מותקנת על פאנל מודולרי	Med Associates Inc.	ENV-221M	2 by SA chambers
שקע נוזלי כפולה עם צינורות נירוסטה 18 ga	Med Associates Inc.	ENV-200R3AM
, 3.33 סל"ד	Med Associates Inc.	PHM-100
	Med Associates Inc.	PHM-122-18
SmartCtrl 8 כניסות / 16 פלט חבילת	Med Associates Inc.	DIG-716P2
תוכנת MED-PC	Med Associates Inc.	SOF-735
http://www.mednr.com/	Med Associates Inc.		אתר אינטרנט שהוא קוד פתוח ונוצר כדי להציע לחוקרים מקום להחלפת קוד סימון MEDState
Kendall Monoject 20 סמ"ק מזרקים, Regular Luer Tip	VWR International	MJ8881-520657
אתנול, טהור, 190 הוכחה (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs	2801
0.9% הזרקת נתרן כלורי, USP	Hospira	0409-4888-50
נלטרקסון הידרוכלוריד	סיגמא אולדריץ'	N3136-1G
23 גרם BD PrecisionGlide מחטים	BD	305145
Minivette POCT 50 ומיקרו; L, K3EDTA	Sarstedt	17.2113.150	לאיסוף דם נימי