מאמר שיטה

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

DOI:

10.3791/53307

⸱

26 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs ממלאים תפקידים מכריעים במוח ומהווים מטרות פוטנציאליות למידול ניוון עצבי. עם זאת, הפרעה ברמות ה-miRNA היא מאתגרת בשל האורך הקצר של ה-miRNA וחוסר הנגישות של רקמת המוח. סרטון זה מציג שיטה לעיצוב אנטגומיר והעברה ספציפית למוח באמצעות נוירופפטיד בעכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) הם מווסתים מרכזיים של ביטוי גנים. במוח, תהליכים חיוניים כמו התפתחות עצבית ותפקודים עצביים תלויים בביטוי נכון של מיקרו-רנ"א. הפרעה של מיקרו-רנ"א במוח יכולה לשמש למודל מחלות נוירודגנרטיביות על ידי ויסות מוות של תאי עצב. כיום, הזרקה סטריאוטקטית משמשת להעברת חומרי נוקדאון miRNA למיקום ספציפי במוח. כאן, אנו דנים באסטרטגיות לתכנון אנטגומירים כנגד miRNA עם שינויים נוקלאוטידים נעולים (LNA). לאחר מכן לתאר שיטה להעברה ספציפית למוח של אנטגומירים, באופן אחיד על פני אזורים שונים במוח. שיטה זו פשוטה וישימה באופן נרחב מכיוון שהיא מתגברת על הניתוח, הפציעה הנלווית ומגבלת המסירה המקומית בזריקות סטריאוטקטיות. הכנו קומפלקס של פפטיד נוירוטרופי חודר תאים Rabies Virus Glycoprotein (RVG) עם אנטגומיר כנגד miRNA-29 והוזרקו דרך וריד הזנב, כדי לספק באופן ספציפי במוח. עיצוב האנטגומיר שילב תכונות המאפשרות מיקוד ספציפי של ה-miRNA ויצירת קומפלקסים לא קוולנטיים עם הפפטיד. הפלת ה-miRNA בתאי עצב, גרמה למוות של תאים אפופטוטיים ולפגמים התנהגותיים נלווים. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה למודלים חריפים של ניוון עצבי באמצעות הפרעה של miRNAs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו RNA צמחו כמטרות טיפוליות חדשניות בשל תפקידם האוניברסלי בוויסות של ביטוי גנים וראיה ישירה למעורבות במחלה. MiRNAs הם נבדקות באופן פעיל לפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות 1,2. יתר על כן, שינויים בביטוי מירנה קשורים עם כמה מחלות 3 וסימולציה של שינויים אלה על ידי ההפרעות מלאכותיות של ביטוי מירנה ניתן להשתמש כדי ללמוד את מסלולי הסלולר מעורבים בביטוי מחלה. משלוח רקמות ספציפי של תרופות המכוונות למירנה הוא כיום אתגר גדול לפיתוח תרופות המבוסס מירנה. Antagomirs ומחקה מירנה סוכנים מבטיחים לperturbing רמות מירנה 4-6. עם זאת, תכונות מיוחדות המשפרות את הספציפיות והיעילות שלהם צריכה להיות משולבות בעיצוב של antagomirs לפני שהם יכולים לשמש להפרעות בvivo של ביטוי מירנה.

מיקרו RNA רלוונטי במיוחד כמטרות בניווניות חשוכות מרפא כיום ומחלות נוירו-התפתחותית. מחסום דם-המוח מהווה מגבלה למסירת antagomirs במוח. זריקות stereotactic נמצאות בשימוש נרחבת במודלים של מכרסמים לספק מולקולות למקומות ספציפיים במוח 7. זה דורש מיומנות, השקעה נרחבת במכשור וזמן. זריקות stereotactic הן פולשני, כוללים ניתוח, לגרום לקטין לפחות פציעה ומוגבלת לאספקה ​​מקומית. השימוש בפפטידים תא חודר עם העדפה לנוירונים מיקוד יכול להתמודד מגבלות אלה שכן הם יכולים להיות מועברים באמצעות מסלול טרנס וכלי דם, אך לפרוץ את מחסום דם המוח. כגון פפטיד נגזר מוירוס הכלבת גליקופרוטאין (RVG), שימש בעבר כדי לספק siRNA כנגד וירוס דלקת מוח יפני בעכברים 8. מצאנו כי השימוש בפפטיד לantagomir משלוח, miRNAs יכול להיות יעיל הפיל במוח העכבר 9.

ontent "> האתגר הגדול השני של מירנה לדפוק למטה נובע מגודלו הקטן של miRNAs ואת הנוכחות של isoforms רצף קשור באופן הדוק. אנחנו לוקחים את הדוגמא של MMU-miR-29 משפחה שמורכבת משלושה isoforms קשור באופן הדוק, miR-29 , B ו- C. Antagomirs גם בדרך כלל שונה לאורך עמוד השדרה כדי להגדיל את היציבות שלהם והופך אותם עמידים להתקפות של nucleases. נעול חומצות גרעין (LNAs) מציעות יתרון נוסף שהם משפרים יציבות תרמית ואף להוביל ליעד השפלה מעל ומעבר הפרעה סטרית 10. היכרות עם שינויים לכל אורך עמוד השדרה יכולה להיות יעילה אך יקר. יש לנו קודם לכן ראו ששינויים מעבר למספר אופטימלי עשויים שלא לשפר את היעילות נוספת. העיצוב של antagomir לכן כרוך השינוי האופטימלי של antagomir.

למורכב antagomir לא קוולנטית עם פפטיד neurotropic, יחויב hepta- להארכה נונה-ארגינין משמשת. D-ארגיניןשאריות משמשות מאז שהם מעניקים יציבות גבוהה יותר כפי שהם לא רגישים למחשוף על ידי פרוטאזות. Hepta- למתיחות נונה-ארגינין לפעול סוכני תא חודר יעילים כ, למרות שהם אינם מקנים סגוליות סוג התא. על ידי קוולנטית קישור פפטיד RVG למקשר נונה-ארגינין, neurotropic, פפטיד תא חודר נוצר. שאריות מטען החשמליות חיובי של פפטיד אינטראקציה עם עמוד השדרה חומצות גרעין הטעון השלילי, ליצירת קומפלקסים. מתחמים אלה יכולים לשמש לtransfect יעילות DNA או RNA לתאים בתרבית וin vivo לרקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל ההליך כוללים נושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת אתיקה המוסדית בעלי חיים (וא"א) במכון לגנומיקה וביולוגיה אינטגרטיבית, ניו דלהי (IGIB / AEC / 10/2013). פרוטוקול זה מותאם במיוחד עבור משלוח ממוקד של Antagomir-29 במוח ובמציאה של miR-29.

האסטרטגיה עיצוב Antagomir 1.

  1. אחזר את רצף מירנה בוגר מ -11 miRBase (http://www.mirbase.org/).
  2. אחזר את הרצפים של בני משפחת מירנה הקשורים באמצעות הקישור "ג'ין המשפחה" בשיא miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. הפוך משלים את הרצף: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html מספק כלי נוח ללהפוך רצפים משלימים.
  4. סמן את העמדות להיות שונה על ידי השימוש בLNA ההנחיות הבאות:
    1. בחר שאריות תימין להציב מלבד 3-4 בסיסים לשינוי LNA, מאז pyrimidines LNA הם יציבים יותר מpurines 12.
    2. בחר שאריות ציטוזין מופרדות על ידי 3-4 שאריות אם שלב קודם מייצר פחות מחמישה שינויים.
    3. לתעדף חמישה שינויים עד סוף '5 של antagomir, שכן זה ימנע את רצף הזרע.

הכנה מורכבת 2. Antagomir-neuropeptide

שים לב: זהו שלב הקריטי ביותר בפרוטוקול ושהוא צריך תקינה. כדי לתקן את הפרוטוקול כל oligonucleotide שכותרתו fluorescently (FLO) ניתן להשתמש במקום של antagomir 9. פפטידים צריכים להיות של טוהר גבוה (הכיתה HPLC, 98% טוהר) ניתנות .Sequences ואחראי על פפטיד וantagomir בטבלה 1.

  1. החלט מספר מוles של antagomir להיות מוזרק המבוסס על תשלום טוחנת בantagomir, רעילותו ומשקליו של העכבר. לחשב את מספר השומות של פפטיד להיות מוזרק המבוסס על יחס טוחנת אחראי antagomir: פפטיד.
    הערה: סטנדרטיזציה יחס טוחנת אחראי antagomir: פפטיד לרעילות ואספקה ​​יעילה במוח העכבר. השתמש ביחסים שונים תשלום טוחנת של oligonucleotide שכותרתו fluorescently: פפטיד לתקינה. מצאנו שAntagomir-29 ושליטה היו שניהם רעילים במשקל גוף 4microgram / גרם של עכבר. Antagomir-29 ושליטה שמשו במשקל גוף 2microgram / גרם, אבל ריכוז יעיל זה עשוי להשתנות בכל מיקרו-רנ"א.
  2. לדלל את הפפטיד וantagomir בצינורות microfuge נפרדים מפתרונות מניות עם 10% D-גלוקוז סטרילי לריכוז הסופי הרצוי כפי שמחושב בשלב 1.
  3. שמור את צינור microfuge עם פתרון פפטיד במערבולת במהירות vortexing מתון.
  4. להוסיף 1/3 שלישי שלפתרון ntagomir לצינור פתרון פפטיד, לאט, טיפה חכם, בזמן שהוא מעורב באופן יסודי על מיקסר מערבולת.
  5. המשך ערבוב של פתרונות במערבולת דקות 1 הבאות ולאחר מכן לאפשר לתערובת לעמוד במשך דקות 1.
  6. חזור על השלב 4 ו -5 פעמים נוספות לערבב antagomir פתרון שנותר עם פתרון פפטיד באותו הצינור microfuge. בנוסף האיטי הוא קריטי ליצירת מתחמים מונו לפזר כי הם יעילים בtransfection. בנוסף מהיר יכול להוביל להצטברות של המתחמים והמשקעים שלהם.
  7. דגירה המורכבת למשך 30 דקות ב RT ללא vortexing. בתקופה זו של דגירה, להתאקלם העכברים למעבדה שבה זריקות תבוצענה.

3. זנב הזרקה לוריד של קומפלקס Antagomir-neuropeptide

  1. לרסן את החיה, הצב את העכבר בעוצר או decapicone של גודל נכון.
  2. נקה את פני השטח של הזנב באמצעות יחסי ציבור מקלון צמר גפןבמים חמים (כ -40 מעלות צלזיוס) ספוג דואר. זה יקדם התרחבות ולהגדיל את הנראות של הווריד.
  3. מתקרב לזנב עם נפח קטן (0.5-1.0 סמ"ק) מזרק אינסולין בזווית 15-20 מעלות. היזהר שלא להציג את כל אוויר לתוך המזרק. התחל בחלק הדיסטלי של הזנב. הזרק המורכב. הסר את המחט ולהחיל ספוגית חיטוי ישירות לאתר ההזרקה (כ 5-10 שניות) כדי לעצור את דימום.
  4. החלף את העכבר בכלוב מאוורר בנפרד בקבוצה של 3-5, עם קלח התירס ונייר טישו כהעשרה. אין להשאיר עכברי uninjected והזריקו באותו כלוב.

4. מבחני התנהגות

הערה: שמור את המרווח של 3-4 שעות הזמן במבחנים בין הזרקה והתנהגות, כדי לאפשר התאוששות לאחר הזרקה. להביא את העכבר לחדר שקט. נא לא להפריע בעלי החיים בתקופה זו של התאקלמות.

  1. להתאקלם בעכבר כדיחדר חדש למשך 30 דקות ולאחר מכן להתחיל את מבחני ההתנהגות הבאים. שמור פער של 10 דקות בין כל assay התנהגות.
  2. צְבִיטָה Hindlimb:
    הערה: בדיקה זו מצביעה על בעיות בתפקוד מוטורי וליקוי נוירולוגים.
    1. הרם את העכבר בעדינות על ידי החזקת בסיס ליד הזנב ברקע ברור.
    2. בדוק את מצב hindlimb במשך 10-15 שניות. מתנפץ עכבר סוג בר hindlimbs מבטן, ואילו עכבר Ataxic נוטה לחזור hindlimbs אחד או שניהם לכיוון הבטן יותר מ -50% מהזמן מושעים 13.
    3. להחזיר את העכבר לכלוב
  3. מבחן מדף:
    1. הרם את העכבר בעדינות על ידי לחיצה על הזנב ולשמור אותו על המדף של כלוב.
    2. שים לב במיוחד העכבר בפינת הכלוב. עכבר סוג בר יכול לעבור בקלות הפינות בלי פחד ולאבד את שיווי המשקל. עכבר Ataxic לאבד את שיווי המשקל, הקפאתה או מנער תוך כדי ההליכה לאורך מעקה כלוב ובפינות.
  4. assay טביעת רגל עכבר:
    הערה: לassay זה לשמור את גיליון הסופג מוכנה, בקומה של מסלול צר (~ 70 סנטימטר ארוך, ~ 5 סנטימטרים רוחב עם קירות ~ 5 סנטימטר גבוה.)
    1. החזק את העכבר בעדינות ביד אחת ולהחיל דיו על הגפיים האחורי על ידי מברשת.
    2. הנח את גיליון הסופג על רצפת מסלול צר.
    3. לאפשר עכבר כדי ללכת או לרוץ על גיליון סופג בקו ישר במסלול מקצה אחד לשני.
    4. חזור על התהליך עוד פעמיים עם כל עכבר באמצעות גיליון סופג טרי.
    5. מדוד את המרחק בין שני צעדים רצופים בתנועה קדימה. אין לכלול כמה עקבות הראשונות והאחרונה שבו החיה רק ​​ייזום וסיימה הריצה שלה, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ההליך שהוצג כאן, מתחמים של oligonucleotide 50microgram שכותרתו fluorescently (FLO) ו~ פפטיד RVG 850microgram של 01:15 יחס תשלום טוחנת (FLO: פפטיד) הוכנו והזריקו רק פעם אחת דרך וריד זנב. מורכב של מטריקס וירוס כלבת אינו neurotropic פפטיד (RVM) וFLO שימש כביקורת משלוח. למחרת, מוח עכברים וכבד היו מבודדים והשעיות תא בודדות היו מוכנות. תאים נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הירוק. מורכב FLO-RVG נמסר בהצלחה עם זמן קצר ביותר של יום אחד וזוהה כקרינה ירוקה בתאי המוח, אך לא בכבד

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדגימים מתודולוגיה נגישה לחקר ההשפעות של אפנון miRNA. נכון לעכשיו, רוב הניסיונות לאפיון in vivo של פונקציות miRNA כרוכים ביצירת עכברי נוקאאוט או טרנסגני המבטא ספוג miRNA. רוב ה-miRNAs, אפילו אלה הספציפיים לסוג התא, מתבטאים ביותר מאיבר אחד. לדוגמה, miRNAs שנחשבו בתחילה כספציפיים למערכת ההמטופויאטית באים לידי ביטוי גם במוח, עקב נוכחות מיקרוגליה. לפיכך, אפילו אסטרטגיית נוק-דאון ספציפית לסוג התא, המבטאת חומרים אנטי-חושיים כנגד miRNAs בשליטת מקדמים ספציפיים לסוג התא עשויה לייצר השפעות פלאוטרופיות. משפחת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסוביק מאיטי על עזרתו בתכנון האנטגומירים. אנו מודים גם ל-Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey ו-Bijay Pattnaik על עזרתם בשיטות ניסיוניות. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר מדעי ותעשייתי (BSC0123). HS, MV ו-RR מכירים במלגה מהמועצה למחקר מדעי ותעשייתי, הודו. MAS מכיר במלגה מוועדת המענקים של האוניברסיטה, הודו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערבולת
או Decapicone
מסלולבאורך ~70 ס"מ, רוחב ~5 ס"מ עם קירות בגובה ~5 ס"מ.
ריאגנטים
אוליגונוקלאוטידים בעלי תווית פלואורסצנטית (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% סטרילי D-גלוקוז
אנטגומיר-29Exiqonסינתזה
בקרת אנטגומירExiqonסינתזה
נוירופפטיד RVGG.L.Biochem ( שנחאי) בע"מסינתזה מותאמת אישית>98% טוהר
נוירופפטיד RVMG.L.Biochem (שנחאי) בע"מסינתזה מותאמת אישית>98% טוהר
אחר
כותנה
מים
מזרקי
גיליונות סופג דיו
מברשת
חיטוי
ריסון צר מותאמת אישיתמותאמת אישיתחמיםאינסולין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
  3. Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
  4. Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
  5. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
  6. Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
  7. Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170(2013).
  8. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  9. Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
  10. Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
  11. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
  12. Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
  13. Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
  14. Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
  15. Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
  16. Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroRNAAntagomirLNAPCR

מאמרים קשורים