זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים

סיכום

מיקרוסקופיה משופרת של שדה כהה והדמיה היפר-ספקטרלית עם מיפוי ספקטרלי מאפשרים סינון, לוקליזציה וזיהוי של חומרים בקנה מידה ננומטרי בדגימות היסטולוגיות עם מהירות ודיוק משופרים בהשוואה לשיטות מסורתיות. מטרת מאמר זה היא לספק שיטות להדמיית שדה כהה ומיפוי היפרספקטרלי של ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות.

תקציר

ננו-חומרים נפוצים יותר ויותר בתעשייה, בייצור ובמחקר ביו-רפואי. הצורך בכלים וטכניקות המסייעים בזיהוי, לוקליזציה ואפיון של חומרים ננומטריים בדגימות ביולוגיות הולך וגובר. השיטות הזמינות כיום, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים, נוטות להיות עתירות משאבים, מה שהופך את השימוש בהן לאסור עבור חלק גדול מקהילת המחקר. מיקרוסקופ שדה כהה משופר בתוספת מערכת הדמיה היפרספקטרלית עשוי לספק פתרון לצוואר בקבוק זה על ידי מתן אפשרות לאפיון מהיר וזול יותר של ננו-חלקיקים בדגימות היסטולוגיות. שיטה זו מאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי בניגודיות גבוהה כמו גם זיהוי ננו-חומרים. לטכניקה זו מכינים דגימות רקמה היסטולוגיות כפי שהיו מוכנות למיקרוסקופיה מבוססת אור. ראשית, דגימות בקרה חיוביות מנותחות כדי ליצור את ספקטרום הייחוס שיאפשר זיהוי של חומר מעניין בדגימה. בקרות שליליות ללא החומר המעניין מנותחות גם על מנת לשפר את הספציפיות (להפחית תוצאות חיוביות כוזבות). לאחר מכן ניתן לדמות ולנתח דגימות באמצעות שיטות ותוכנות למיקרוסקופיה היפרספקטרלית או להתאים אותן לספקטרום הייחוס הללו על מנת לספק מפות של מיקום החומרים המעניינים בדגימה. הטכניקה מתאימה במיוחד לחומרים בעלי ספקטרום החזר ייחודי ביותר, כגון מתכות אצילות, אך ישימה גם לחומרים אחרים, כגון תחמוצות מתכתיות למחצה. טכניקה זו מספקת מידע שקשה להשיג מדגימות היסטולוגיות ללא שימוש בטכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים, שעשויות לספק רגישות ורזולוציה גבוהות יותר, אך הן עתירות משאבים וגוזלות זמן רב יותר ממיקרוסקופ אור.

מבוא

כננו משמש יותר ויותר במגוון רחב של תעשיות ויישומים, יש צורך בשיטות ההדמיה ננו ואפיון שיותר מהירים, זולים, ונוחים יותר משיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להמחיש את ננו-חלקיקי אינטראקציות (NP) עם תאים, רקמות, ומערכות חיים, רבות טכניקות אופטיות להיות מועסקים, כוללים התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה ¹ וגישות המבוסס על שדה חלוף, כגון השתקפות כוללת פנימית (TIR) ​​או כמעט, מיקרוסקופ סריקת שדה אופטי (NSOM) ^2,3. עם זאת, אלה הם גישות אנליטיות מתקדמות, מחוץ להישג ידם של רוב המעבדות אינן מומחים ^4. מיקרוסקופ אלקטרונים, כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), שימש גם ללמוד אינטראקציה עם NP ^5,6,7,8 תאים. darkfield טבעתי זווית גבוהה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (HAADF) סריקה נעשה שימוש כדי לחקור את האינטראקציה של צירופים ועם וירוסים ^9. מיקרוסקופיה confocal היא טכניקה פופולרית אחרת המשמשת ללמוד NP-תא אינטראקציות ^10.

בשנים האחרונות, טכניקות מבוססות darkfield הדמיה היפרספקטראלית (HSI) שימשו ככלי אנליטי מבטיח ללימוד צירופים ובמטריצות ביולוגיות ^11. מערכות HSI ליצור ייצוג תלת-ממדי של נתונים מרחביים ורפאים, המכונים קובייה או דטה קיוב ^12. המפה המרחבית של וריאציה רפאים משמשת לזיהוי חומרים. פרופילי רפאים של חומרים ידועים יכולים להיות שנוצרו ומשמשים כספריות התייחסות להשוואה לדגימות ידועות. אחד היתרונות הגדולים עם מערכות HSI הוא היכולת שלה לשלב הדמיה עם ספקטרוסקופיה, ובכך לבסס את המיקום והפצה של צירופים ולא ידועים בvivo או vivo לשעבר, כמו גם המקשר אותם לחלקיקי התייחסות נוספות של הרכב ידוע, דומה.

ישנם מספר יתרונות שלבאמצעות מערכות HSI על שיטות הדמיה קונבנציונליות: הכנת מדגם מינימאלית נדרש; הכנת מדגם היא בדרך כלל לא הרסנית בטבע; רכישת תמונה וניתוח הוא מהירה יותר; הטכניקה היא חסכונית ^13; וההפצה וניתוח מרחבי של תרכובות מעורבים הרכב ו / או במטריצות מורכבות נעשה בקלות רבה יותר ^14.

למחקר ננו מעורב דגימות יקרות, אחד השיקולים החשובים ביותר היא הזמינות של שיטת הדמיה אינה הרסנית, המאפשרת לפוטנציאל לבחון שוב ושוב דגימות בשיטות אחד או יותר. חוזר או ניתוחים מרובים עשויים להיות רצויים לפתח מערכי נתונים מקיפים שלא יהיו זמין משיטה אחת. לעניין זה, לומד תכונות אופטיות שלה הוא הדרך הבטוחה ביותר כדי לנתח את המדגם. באמצעות מערכת HSI מיקרוסקופ darkfield המשופר (EDFM) וללמוד את התגובה האופטית של המדגם - כלומר reflectance, אלא גם ספיגה והעברה - זיהוי ואפיון תכונה ניתן לבצע ^15. נקודות קצה אפיון אפשריים כוללות הערכה של גודל יחסי וצורה של חלקיקים או agglomerates והפצה של חלקיקים בתוך מדגם.

במאמר זה, אנו מתארים שיטות מיפוי במיוחד עבור חלקיקי תחמוצת מתכת ברקמה שלאחר המוות באמצעות מערכת HSI מבוססת על אלגוריתם התאמת פיקסל-רפאים המכונה ממפה רפאים זווית (SAM). בחרנו יישום מסוים זה כי יש לו את הפוטנציאל כדי להשלים נוכחית ועתידיים במחקר nanotoxicology vivo, שבו מודלים של בעלי החיים משמשים כדי להעריך את ההשלכות הבריאותיות של חשיפה לננו המהונדס. יישום של שיטה זו יכול גם להודיע ​​מחקר משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי שמנצל דגמי רקמה או בעלי חיים. בקליטה מסוימת, ננו-חלקיקים, הפצה, חילוף חומרים, והפרשה לאורך organs ורקמות יכולים להיחקר עם מערכת זו. מגוון רחב של יישומים נחקר לשימוש במחקר ביו-רפואי ^11.

שיטה זו יכולה להיות מנוצלת להערכה של דגימות ביולוגיות שונות (כגון סוגי רקמות שונות, דגימות שטיפה ברונכואלוואולרית, וכתמי דם) שנחשפו לחלקיקים של מגוון רחב של יצירות יסודות ^16-19. יתר על כן, שיטה זו היא שימושית לחקר ננו-חלקיקי biodistribution in vivo ובמבחנה, שהוא רלוונטי ללימודי משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי ^11. מעבר לדגימות ביולוגיות, EDFM וHSI ניתן להשתמש כדי להעריך חלקיקים בדגימות סביבתיות, כגון שפכים ^20. הערכת חשיפה תעסוקתית ניתן להקל על ידי השימוש בטכניקה זו, שכן היא עשויה לשמש כדי להעריך את היעילות של ציוד מגן אישי במניעת חדירת ננו-חלקיקים. יתר על כן, te המחקרבבוקר כרגע הוא מפתחת EDFM דומה ופרוטוקול HSI להערכת דגימות אמצעי סינון של חלקיקים שנאספו מהערכות חשיפה תעסוקתיות. בעוד הכנת הסוגים השונים מדגם אלה לEDFM וHSI עשויה להשתנות, חשוב שהם מוכנים באופן כזה שהם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי המערכת האופטית. בדרך כלל, המדגם צריך להיות מוכן כאילו זה יהיה דמיין באמצעות מיקרוסקופיה brightfield המסורתית. ישנן מספר מערכות הדמיה היפרספקטראלית זמינות ¹¹ מסחרי.

פרוטוקול

פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש במוסד בשיתוף פעולה של החוקרים, מאוניברסיטת סטוני ברוק. ניתן למצוא רשימה של חומרים וציוד המשמש למאמר זה ספציפיים בטבלה 1.

1. הכנת דוגמאות של רקמות

1. הכן רקמות בעלי חיים שנחשפו לחלקיקי תחמוצת מתכת לצביעה היסטולוגית או immunohistochemical לפי שיטות שתוארו בעבר ^21-23.

2. הדמיה

1. מאתחל מיקרוסקופ
   הערה: למחקר זה, היה בשימוש במיקרוסקופ כיתה מחקר, לבוש עם מקור אור darkfield ביצועים גבוהים, בקר XY הממונע שלב, מצלמה היפרספקטראלית עומק 14-bit, ועדשות אובייקטיביות מרובות (אוויר 10X, 40X אוויר, טבילת שמן 100X) . יש המערכת משמשת כאן ברזולוציה מרחבית 64 ננומטר ב100X הגדלה (טבילת שמן). הקבל המשמש להרבעה זהיש y תכונות תאורת שני קוהלר וקריטי ומתמקד אור collimated ביותר בזוויות אלכסוני במדגם.
   1. חבר והפעל על מערכת מחשב של מקור האור, בקר XY שלב, מצלמה אופטית (הדמיה darkfield), מצלמה היפרספקטראלית, ו. הגדר את מקור אור 75% כוח; להעלות את הבמה כדי גובה מרבי; לחבר את ספר האור למעבת הדמיה darkfield משופר או לcollimator על גביו של מיקרוסקופ הדמיה brightfield משתקפת.
      הערה: על ידי הגדרת מקור אור 75% כוח, יש תאורה מספקת, אחידה של כל הפיקסלים בכל שדה הראייה שמשפר פיקסלים עמומים יותר תוך שהוא מאפשר לניגוד בין פיקסלים משעממים ובהירים.
   2. להעלות את הקבל לעמדת הפעלה. החל 3-5 טיפות של הסוג-שמן טבילה על עדשת הקבל בזהירות, הימנעות ההיווצרות של בועות. לנגב את השמן ומרח אותו מחדש, אם בועות צריכה טופס.
   3. מקם את o השקופיתn השלב. לאט לאט להעלות את הקבל עד שמן הטבילה יוצר קשר עם השקופיות. זה יהיה מורגש דרך הטבעת במהירות התבהרות של הארה שבו השמן יוצר קשר עם השקופיות.
2. שים את מטרת 10X במקום. להתמקד וליישר את הקבל על ידי בחינה באמצעות oculars.
   1. הזז את השלב למעלה ולמטה באמצעות ידית מוקד מטרה הגסה עד הבהירות מוגדלת.
   2. הזז את הקבל להתמקד למעלה ולמטה באמצעות כפתור כוונון הקבל עד בהירות מקסימלית נמצאת. תנסה ליצור המקום המרכזי המבריק האפשרי בשדה הראייה.
   3. התאם את ידיות יישור הקבל כנדרשת כדי למרכז את נקודת האור, במידת הצורך.
   4. השתמש בידית מוקד מטרה בסדר להביא את נקודת האור אל מוקד. בעת שינוי מטרות להשיג הגדלה שונה, להתאים מחדש את מטוס המוקד. כאשר ניצול מטרת 100X, חל ירידה של שמן טבילה מעל coverslip כדי לשפר את התמונת דואר ולמנוע נזק לעדשה האובייקטיבית.
3. תמונות לכידה
   1. השתמש בבקר במה כדי למצוא אזור של עניין. אזור זה ייקבע על ידי הצרכים של הניסוי. מחוון טיפוסי יהיה גבוה לעומת אזורים הסמוכים, כמו האזורים רוויים בחלקיקי תחמוצת מתכת לעתים קרובות להיראות בהירים יותר מאשר באזורים בלעדיהם.
   2. להביא את האזור למוקד באמצעות כפתור מוקד מטרה בסדר, התאמת מוקד הקבל כצורך לאזן תאורה. להשיג אזור ניגודיות גבוהה, מוגדר היטב בתוך שדה הראייה.
   3. לקבוע מה תמונות (למצלמה האופטית) או datacubes (למצלמה היפרספקטראלית) יהיה שנתפס, ובאיזה רצף. בדרך כלל, תמונות אופטיות מתקבלות עם מטרת 10X אוויר, מטרת מיזוג 40X, ומטרה טבילת שמן 100X ודטה קיוב HSI להתכתב עם מטרת טבילת שמן 100X.
      1. פתח את תוכנת הדמיה האופטית. לחץ על "הגדרות ו# 8221; בשורת התפריטים. בחר את "הכפתור לכידת תמונה לאירוע לכידה". בחר את פורמט תמונה המאוחסנת (TIFF שימש לניסוי זה); להקצות שם הקובץ; לגלוש ובחר תיקיית תמונה מאוחסנת; לשמור timelapse ברירת המחדל; לחץ על "אישור".
      2. בחר את הגדרות החשיפה שיוצרות את התמונה בניגוד הגבוהה ביותר בתפריט "החשיפה" (למחקר זה, לרמה של 0.0%, רווח של 3.0 dB, ותריס של 35 מילי-שניות היו בשימוש).
      3. ללכוד את התמונה על ידי לחיצה על הכפתור "תמונה" בשורת התפריטים. ללכוד כמה תמונות darkfield נמוכה הגדלה נוספת על אלה בהגדלה גבוהה על ידי שינוי מטרות מיקרוסקופ, על מנת לספק הקשר.
         הערה: צלם תמונות אופטיות בהגדלה זהה כמו כל datacubes שיהיה שנתפס עם המצלמה היפרספקטראלית, כתמונות אופטיות אלה נוטות להיות גדול יותר של שדה ראייה ומראה אסתטי טוב יותר לבדיקה ויזואלית מאוחר יותר. זה חיוני כי כל datacubes שמאוחר יותר לנתח spectrally שימוש הגדלה עקבית, כפי שייתכן ששינוי המטרה ישנה את ספקטרום השידור של אופטיקה מיקרוסקופ, שינוי הספקטרום שנתפס, וכך להקטין את הדיוק של ממפה הרפאים הזווית (SAM). אם החברה דטה קיוב אחד בהשוואה לחברת דטה קיוב אחר שהושגה עם מטרה שונה, פונקצית SAM לא יכולה לעבוד.
   4. בחר את גלאי ההדמיה המצלמה היפרספקטראלית ידי הפניית ידית מקור אור על מיקרוסקופ למצלמה היפרספקטראלית. אם הנורית מופנה לכיוון המצלמה היפרספקטראלית, אין תמונה, תוכלו לראות בתוכנת המצלמה האופטית. למזער אבל לא לסגור את חלון תוכנת הדמיה האופטי, כאחד אולי יצטרך אותו כמפורט בשלב 2.4.4.
4. לכידת Datacubes
   1. פתח את תוכנת הדמיה היפרספקטראלית לרכישת datacubes HSI. ודא מדריך האור מופנה למצלמה היפרספקטראלית.
   2. פתוח "Hypמיקרוסקופים erspectral "בשורת התפריטים ובחרו" בקרות HSI מיקרוסקופ ".
   3. הגדר את הגדלת היעד ולשמור את הנתיב. הקפד לקרוא את כל תמונות וקבצים מובהקים ולכן אין דריסה מתרחשת. לשנות את תפיסת השטח בהגדרות על ידי התאמת שדה הראייה או מספר הקווים (השתמש 720 קווים למחקר זה), עם כמות משמעותית של זמן נוסף הנדרשת ללכידת אזורים גדולים. לבסוף, קבע את זמן החשיפה (0.25 שניות למחקר זה). השאר כל דבר אחר לברירת מחדל, ולחץ על "התצוגה המקדימה HSI" כדי להציג את התמונה.
      הערה: גרף עוצמת שמופיע מראה את חברת דטה קיוב HSI שיירשם בציר האופקי. הציר האנכי מייצג את אורכי הגל של הספקטרום שיהיה שנתפס בחברת דטה קיוב HSI. הצבת הסמן בכל עמדה על גרף עוצמת המתאים לגל רפאים גורמת עוצמות של כל הנקודות על פני התמונה, באורך הגל ש, שיוצג.
   4. פוקוס מבוסס על תצוגה זו על ידי התאמת מוקד מטרת הקנס כדי לחדד את הפסגות בתמונה זו. אם זה קשה מדי, אורך המוקד של המצלמה האופטית הוא די דומה, כך לטעון את תוכנת הדמיה האופטית ולהעביר את המחוון למצלמה האופטית, המיקוד, ולאחר מכן לחזור לתוכנת ההדמיה היפרספקטראלית ולהחזיר את המחוון למצלמה היפרספקטראלית .
   5. התאם את עוצמת מתצוגה זו על ידי התאמת בהירות מקור, מוקד הקבל, או על ידי ביטול התצוגה המקדימה כדי להתאים את זמן החשיפה. האחרון מניב את התוצאות הטובות ביותר, אבל זמן חשיפה מוגבר יכול להימשך זמן רב יותר לתמונה. המטרה היא לפסגות משמעותיות יותר להיות מספיק גדולות, אבל לא עולה על העצמה מקסימלית לגלאי; כאן, מגוון האידיאלי הוא בין 1,000 ל -16,000 יחידות.
   6. לחץ על "לכידה". מיקרוסקופ יבקש לקחת תמונה נוכחית כהה. הפניה לפס גלילה העליונה או צמצם (בזהירות, כדי שלא להפריע ליישורומוקד של כל אופטיקה האחרות), ולחץ על "אישור". שחזור בר שקופיות או צמצם אל המיקום הנכון ולחץ על "אישור" שוב כאשר הפקודה לתמונה מופיעה. הדמיה יכולה להימשך עד 30 דקות, למרות שפעמים של כ -5 דקות אופייניות יותר. זמני חשיפה ארוכים יותר יביאו לפעמי הדמיה עוד. מחוון התקדמות הוא הווה. היזהר שלא להפריע באופן פיזי את ההיקף עד שמחוון ההתקדמות משלים.
   7. שים לב ארבעה חלונות חדשים עם השמות: "רשימת להקות זמינות", "# 1zoom", "1scroll #" ו- "להקת RGB # 1". להגדיל את החלון "הלהקה # 1RGB" כמו זה דטה קיוב לכל אזכור בעתיד.
   8. לחץ לחיצה ימנית על החברה דטה קיוב ולשמור אותו כTIFF ולחץ על "אישור". אם הדמיה סיימה; לשים את כל הדגימות; לנקות את כל המשטחים חשופים שמן עם isopropanol 70% במים; להעלות שלב לגובה מרבי; הקבל נמוך לגובה מינימאלי ועיתונות למצב הלא-מבצעי; לִסְגוֹרלמטה או לנתק את מקור האור, בקר במה, ומצלמות.

3. יצירה של ספריות ספקטרלית הפניה

1. בחירה של ההפניה ספקטרה
   1. בחר ביקורת חיובית שידועה מכיל את החומר של העניין הכלול באותה המטריצה ​​כדגימות ניסוי, שכן פרופילי רפאים HSI הם מטריצה ​​תלויה.
      1. במחקר זה, להשתמש בעור חזירי מוזרק במינונים גבוהים של חלקיקי תחמוצת מתכת כפקדים חיוביים להשוואה לרקמת העור חזירית הניסיונית ממחקר חשיפה אקטואלי. פרופילי הרפאים של חלקיקי תחמוצת מתכת בהשעיה נוצרו ונבדקו ונמצא ששליטה חיובית מתאימה לדגימות ניסוי היסטולוגית בשל המטריצות השונות.
   2. להשיג דטה קיוב מהביקורת החיובית כמתואר בשלב 2.4., שימוש במצלמה היפרספקטראלית.
      1. להיות זהיר במיוחד כאשר seלכושר העצמה, כמו זה הוא המדד העיקרי שבו מסנן החלקיקים הפנימי לזהות את החומרים. כל עוצמות מעל הנקודה של הגלאי (כאן, 16,000 יחידות) הרוויה תגרום נתונים לא חוקיים (ראה צעד 2.4.5.).
   3. לחץ לחיצה ימנית בחלון התמונה, והשארתי לחץ על "ספקטרום Z-פרופיל". חלון פרופיל מוקפץ ספקטרלית יופיע. שמאל לחץ על פיקסלים של ריבית על החברה דטה קיוב, במיוחד המבריקים אלה או אלה שניתן לזהות בביטחון כמייצג את החומר של עניין. שים לב לחלון פרופיל ספקטרלית מראה את הספקטרום קשור. שים לב במיוחד לערך הנמוך ביותר והגבוה ביותר שלהם ושאורך גל מתאים לזה.
      1. כאשר מדידות מדגם שליטה החיובית, סקר על ידי לחיצה על האזורים של עניין, כי הם מאוד בהיר ביחס לרקמה הסובבת, במיוחד אלו עם חלקיקים הניתנים לזיהוי בקלות. חלקיקים אלה הם סיכוי הטובים ביותר להיות מאטרials של עניין, במיוחד במקרה של מתכות.
   4. השתמש בכלי "מסנן חלקיקים" תחת תפריט "חלקיקים ניתוח" לזהות חלקיקים הנוכחיים בחברת דטה קיוב. בחלון הקופץ החדש, להתבונן "ספקטרלית מקס לחרוג". זה ייקבע על ידי תצפיות בשלב 3.1.3. קבע ערך זה כך שזה גבוה מפיקסלים ברקע, אך נמוך מהחומרים של עניין. "נתונים מקס תקף" הוא העצמה מקסימלית (כאן, 16,000 יחידות).
      1. השאר פרמטרים אחרים לברירת מחדל, אבל לא לכלול אובייקטים המבוססים על גודל התיבה על ידי התאמה "סף גודל". שמור את הנתונים זה גם בשלב זה, או אחרי ריצת הניתוח. לצורך ניסוי זה, השתמש בפרמטרים הבאים: Spectral מקס לחרוג: 5,000; נתונים מקס תקף: 16,000; סף גודל (פיקסלים): 400. ברגע שכל הפרמטרים נקבעו, לחץ על "אישור".
   5. שים לב לגרף וכתוצאה מכך בפרטיםחלקיקים זוהו בתוך סף העצמה שצוין; נתונים אלה ניתן לייצא. אם אורך גל ההחזרה המרבי האופייני לחומר של עניין ידוע, בחר אותם חלקיקים שיש להם ערך דומה "מקס WL"; אחרת, לחץ על "בחר הכל". לאחר מכן לחץ על "יצוא"; "ספריית ספקטרלית כדי". בחר שם קובץ ולאחר מכן לחצו על "אישור".
2. הסר ספקטרה חיובית שגויה
   1. בחר מדגם שישמש כביקורת שלילית. כגון מדגם צריך להיות מוכן וטופל באותה הדרך כמו כל דגימות הניסוי להציל שהעדר חלקיקים דומים או זהים לחומר של ריבית מובטחת.
      הערה: חשוב שהמטריצה ​​של השליטה השלילית זהה למטריצה ​​של דגימות ניסוי, כפרופילי רפאים HSI הם מטריצה ​​תלויה. במחקר זה, השתמשנו עור חזירי שלא נחשף לננו תחמוצת מתכת כשליליבקרות.
   2. השג כמה datacubes מהביקורת השלילית כמתואר בשלב 2.4.7, באמצעות המצלמה היפרספקטראלית. לפחות אחד נדרש, אבל יותר ניתן ללכוד להגדיל סלקטיביות (זה חשוב במיוחד במקרה שכמה מזהם עשויים להיות בספקטרום ההתייחסות).
   3. השתמש בתוכנת ההדמיה היפרספקטראלית לסנן ספריית הרפאים שנאספו בשלב 3.1 (ביקורת חיובית) נגד כל חברה דטה קיוב שנתפס בשלב 3.2.2 (בקרות שליליות) באופן סדרתי, כפי שהורה בשלבים הבאים:
      הערה: שמור את הספרייה וכתוצאה מכך, מסוננת רפאים לקובץ נפרד, ולהשתמש בו כספריית רפאים ההתייחסות לחומר של עניין.
      1. לחץ על "ספריית ספקטרלית מסנן" תחת תפריט ניתוח, הממוקם בסרגל כלי התכנית הראשי. לחץ על "פתח"; "קובץ חדש" ובחר את ספריית הרפאים שנוצרה בשלב 3.1. לביקורת החיובית כקובץ הקלט. לחץ על "אישור".
      2. חֵלֶק קִדמִימקור xternal, בחר "תמונה" מתחת לתיבת ספקטרלית נתונים. שמור הגדרות ברירת מחדל תחת תיבת פרמטרי עיבוד. בחר שם פלט לספרייה מסוננת (זה צריך להיות שונה ממקורי, או ספריית הרפאים הגלם נאספה ייאבד). לחץ על "אישור".
      3. לחץ על "פתח"; "קובץ חדש" ובחר את חברת דטה קיוב הראשונה שנתפס בשלב 3.2.2 לביקורת השלילית, כאשר יתבקש לבחור תמונת מקור.
         הערה: התוכנה תנתח את ספריית הרפאים ולהסיר כל ספקטרום שמתאים לכל ספקטרום של חברת דטה קיוב הביקורת השלילית. הסרת הרקע מהקריטריונים לבחירה ובכך מפחיתה את הפוטנציאל לשווא-תוצאות חיוביות. סיכום יהיה זמין כאשר זה נעשה (שים לב שהסיכום זה לא נשמר באופן אוטומטי).
      4. אם סינון נוסף הוא רצוי, לחזור מצעד 3.2.3.1, למעט: צעד 3.2.3.2, בחר את הספרייה האחרונה מסוננת הרפאים יצרה (וכתוצאה מכך אחרי הצעד 3.2.3.3 שיתוף.mpletes); בשלב 3.2.3.3, בחר בחברת דטה קיוב הבאה מהצעד 3.2.2.
         הערה: תיקון ונרמול לספקטרום המנורה עשויה להיות נחוצות אם דגימות לפזר כמות ניכרת של אור (למשל, צינורות פחמן) ו / או אם אפס ספקטרום להישאר כאשר סינון ספריית רפאים שליטה חיובית נגד ביקורת שלילית. בנסיבות אלה לא עלו למחקר שלנו וכן תיקון זה לא בוצע.

ניתוח 4. תמונה

1. מיפוי הרפאים זווית
   1. פתח את "ספקטרלית הזווית Mapper" (SAM) מתפריט ספקטרלית, תפריט משנה שיטות מיפוי, באמצעות תוכנת ההדמיה היפרספקטראלית פעם כל datacubes הניסיוני נרכשה הבא שלב 2.4. ממפה זווית הרפאים משווה ספקטרום על ידי גיאומטרי ניתוח השינויים בעוצמת כפונקציה של אורך גל (כלומר, זה משווה שני ספקטרום ידי נרמול עוצמתם והשוואת הזוויות מחדשרכישתו כדי לעקוב אחר הגרף של כל ספקטרום) ^24.
   2. עם דטה קיוב הפתוחה, בחר את השם של החברה דטה קיוב הניסיונית בחלון הקופץ ולחץ על "אישור". אם אין שמות קבצים רשומים, לחץ על "לפתוח"; "קובץ חדש", לבחור את החברה דטה קיוב הניסיונית, לאחר מכן לחץ על "אישור".
      1. שים לב חלון קופץ חדש בשם Endmember אוסף: SAM. לחץ על "יבוא" בשורת התפריטים, ולאחר מכן בחר "מתוך קובץ ספריית ספקטרלית". חלון קופץ קובץ קלט ספרייה בשם ספקטרלית יופיע. פתח את הספרייה ספקטרלית של התייחסות שיצרה בשלב 3.2.3. ולחץ על "אישור". שים לב חלון קופץ חדש בשם "ספריית ספקטרלית קלט".
      2. לחץ על "בחר בכל פריטים"; לחץ על "אישור" לחץ לחיצה ימנית על "צבע" ובחר "החל צבעי ברירת מחדל לכל." לחץ על "בחר את כל," ואחריו "החל" ולאחר מכן לבחור את קובץ פלט שםd לחץ על "אישור". ספקטרלית הזווית Mapper ייקח כמה שניות כדי לנתח ולשמור את הנתונים.
   3. פתח את החברה דטה קיוב בתוכנת ההדמיה היפרספקטראלית. בחר "סיווג" בתפריט הכיסוי של חלון התמונה, לאחר מכן נווט לשם הקובץ ולחץ על "אישור". המשתמש יכול כעת כיסוי כל ספקטרום מהספרייה כדי לראות היכן הם המפה בתמונה.
   4. בחר באפשרות "מיזוג חוגים" מתפריט האפשרויות ב" כלי הכיתה האינטראקטיבי "נפתח באמצעות תפריט שכבה בחלון התמונה, אם ערכת צבעים אחידה היא רצויה, כגון לניתוח קל יותר על ידי תוכנות אחרות (כמתואר בשלב 4.2 .).
   5. סמן את כל הסיווגים לשלב (בדרך כלל, הכל חוץ "בלתי מסווג" ב" השיעורים למזג לתוך בסיס "רשימה), ובחר ספקטרום אחת מהרשימה" מחלקת בסיס ", ולאחר מכן לחץ על" אישור ". צבע שעכשיו represאף אוזן גרון כל הספקטרום שנבחר.
   6. לחץ על הצבע שנבחר וכל ספקטרום ההתאמה יוצג בצבע ש.
   7. כדי להשיג תמונת dichromatic שתציג את ספקטרום ההתאמה על רקע שחור, cIick על קופסא הצבעים "בלתי מסווגים", שהוא שחור כברירת מחדל. שים לב תמונת dichromatic. יכול להיות הפוך צעד זה על ידי לחיצה שוב על קופסא הצבעים "בלתי מסווגים".
   8. לחץ לחיצה ימנית כדי לשמור את התמונה כקובץ TIFF, לרבות כל שכבות פעילה כרגע.
      הערה: לעיבוד הדמיה עתיד, תמונת dichromatic תשמש.
   9. בחר "הפצת Class" מתפריט האפשרויות בחלון "אינטראקטיבי בכיתה הכלי" לרכוש את סטטיסטיקת המיפוי. הנתונים אלה מייצגים כמה פיקסלים רבים היו ממופים (בלתי מסווג) וכמה זוהו כחומר של עניין. שים לב שמספר הפיקסלים אינו מתאים עם מספר החלקיקים הממופים. מידע זה אינו אוטומטי recorded.
2. ניתוח חלקיקים בהיפרספקטרליות ממופה תמונות
   1. פתח את התמונות בתוכנת NIH ImageJ.
   2. השתמש בתפריט התמונה, התאם תפריט משנה, פונקציה "סף". בחר פרמטרים שמבדילים חלקיקים של עניין מכל חומרים אחרים. השתמש בפרמטרי הסף הבאים במחקר זה: שיטת סף ברירת מחדל, צבע האדום, מרחב צבע HSB, בדק את תיבת הסימון רקע כהה, תיבות סימון לעבור בדיקה לגוון, הרוויה ובהירות.
      הערה: זה עשוי להשתנות באופן משמעותי ממקרה למקרה. בעת ניתוח דטה קיוב ממופה, זה יכול להיות פשוט יותר על ידי איחוד כל המחלקות הרלוונטיות לצבע אחד וכיסה בצבע שעם כל צבעים מסווגים לפני יצירת התמונה (שלבים 4.1.4 ל4.1.8).
   3. השתמש בתפריט לנתח, "לנתח חלקיקים" פונקציה, אשר לאחזר מידע לאזור, כלומר, ערכי מינימום ומקסימום. במחקר זה, השתמש בפרמטרים כאן: הגודל 0-אינסוף, מעגלי0-1, דבר תכנית, בדק את תיבת הסימון צג תוצאות.
   4. לניתוח סטטיסטי, לייצא את הנתונים לתוכנה אחרת המאפשרת השוואה סטטיסטית עם המספר והגודל של חלקיקים הממוקמים בדגימות שליטה דומות. אנו ממליצים להשתמש בגיליון אלקטרוני לניתוח של נתוני ImageJ. הנתונים מוצגים בטבלת התוצאות לאחר שלב 4.2.4 צריכים להיות מועתקים לגיליון אלקטרוני. פונקצית MAX ניתן להשתמש בעמודה הראשונה (ללא כותרת) כדי לקבוע את מספרם של חלקיקים, ואילו הפונקציה הממוצעת יכולה לשמש על עמודת פינת כדי לקבוע את הגודל ממוצע של חלקיק. בעתיד, אימות ניסיוני תהיה רדפה לחקור פונקציה זו בקביעת גודל ממוצע נגד סטנדרטי הוקם לשינוי הגודל (למשל, TEM).

תוצאות

מיקרוסקופיה היפרספקטרליות שימושית ליכולתה לזהות חומרים באופן דומה לספקטרופוטומטריה. כפי שצוין באיור 1, יש כל חומר כמה ספקטרום אופייני וצורה כללית של החזרתה, שהוא ייחודי. יתר על כן, איור 1 מדגים את אופי המטריצה ​​תלויה של פרופילי רפאים: פרופילי רפאים לכל אחת משלוש תחמוצות המתכת בדגימות רקמה היסטולוגית (פנל עליון) שונים מפרופילי רפאים לכל אחת משלוש תחמוצות המתכת בהשעיה מימית ( פנל תחתון). על ידי מיפוי פרופילי רפאים האופייניים לדגימות ידועות באותה המטריצה, הטכניקה שימושית לקביעת קיומו או העדרו של חומר, ויכולה גם חצי כמותית להשוות כמויות יחסי של חומר בדגימות.

ספריות רפאים התייחסות נוצרו מדגימות עור שליטה חיובית מתאימות למיפוי לניסוידגימות עור. כפי שניתן לראות באיור 2, ספריות רפאים התייחסות המפה גם לבקרות החיוביות המתאימות ולא מפה לבקרות השליליות המתאימות.

היתרון המשמעותי ביותר של הטכניקה הוא היכולת שלה לזהות רמות נמוכות של חומרים של עניין בדגימות, כמו גם כדי להבדיל אותם ממזהמים. . לדוגמא, ניתן להבחין צינורות בודדים בריאות במהלך השאיפה של מינונים נמוכים כמו 40 מיקרוגרם בחולדת 20-30 גרם ²⁵ איור 3 מדגימה זאת בדגימות עור היסטולוגית: בעוד כמה חלקיקים ברורים בקלות בתמונה האופטית darkfield (עמודה 2), אחרים מזוהים באמצעות הדמיה היפרספקטראלית (עמודה 3) שאולי הוחמצה באמצעות מיקרוסקופ brightfield (טור 1) או בשיטות אחרות. השימוש בdarkfield HSI משמש גם כדי לשפר את הספציפיות על מיקרוסקופיה brightfield הפשוטה. אז תמונות אלה יכולים להיות כפופות ליותר צורות כמותית של ניתוח, nניתוח חלקיקי otably באמצעות ImageJ.

יש מיקרוסקופיה darkfield המשופרת מספר יישומים שונים, גם בהיעדרו של הדמיה היפרספקטראלית. הראשון הוא היכולת שלה לייצר באיכות גבוהה, תמונות בחדות גבוהה. זו באה לידי הביטוי הטוב ביותר על ידי איור 3, שבו חלקיקים של עניין הם לזיהוי בקלות בהשוואה לעמיתיהם brightfield. תמונות אלה יכולים להיות כפופות גם לניתוח חלקיקים כמותי, אם כי בהעדר מיפוי היפרספקטראלית, זהירות היא הכרחית כדי למנוע מבלבל חלקיקים מזהמים מחלקיקים של עניין.

ספריות איור 1. הפניה רפאים (מטריצת רקמה) בהשוואה לספריות רפאים (חלקיקים בתרחיף). נתון זה ממחיש את החשיבות של יצירת ספריית רפאים התייחסות מנאןomaterials של עניין באותו המטריצה ​​כדגימות ניסוי. השורה הראשונה מציגה את ספריית התייחסות רפאים (RSL) עבור כל חומר במחקר זה (אלומינה, סיליקה וceria). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

RSL זה נוצר על ידי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, שבו דגימות רקמת שליטה חיובית סוננו נגד דגימות רקמת ביקורת שליליות. השורה השנייה מציגה ספריות רפאים (SL) שנוצרו מהחלקיקים של עניין בהשעיה נוזלית בשקופית זכוכית. לאלומינה, שיא bimodal באורכי גל של 500 ו -650 נמצא בRSL, ואילו שיא יותר מעוגל ופחות ייחודי שראה בSL ההשעיה אלומינה NP סביב 600. לסיליקה, שיא באורך גל של כ -650 היה הווה בRSL, ואילו שיא יותר מעוגל ופחות ייחודי שראה בSL ההשעיה NP סיליקה בarouND 600. לceria, שיא bimodal נמצא באורכי גל של 520 ו620 בRSL, ואילו שיא פחות ייחודי שראה בSL ההשעיה ceria NP בסביבות 560. הדבר מצביע על כך המטריצה ​​שבי הצירופים ומוטבעים יוצרת שינוי בספקטרום שיכול להיות משמעותי בעת בחירת הפקדים ליצור SL לניסוי ספציפי כ.

ספריות רפאים 2. הפניה איור (מטריצת רקמה) ממופות על ביקורת חיובית ורקמת עור חזירי ביקורת שלילית. נתון זה משמש כאישור של RSLs כמתאים למיפוי לדגימות ניסוי, שבכל אחד RSL (עמודה שמאלית) מפות גם לביקורת חיובית (העמודה האמצעית) המקבילה שלה ולא המפה לה מקביל בקרה שלילית (עמודה ימנית). אנא לחץ here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מיפוי היפרספקטרליות של רקמת עור חזירי ניסיונית נחשפה לחלקיקי תחמוצת מתכת. שורות מלמעלה עד למטה מתאימות לשכבות שונות של העור, משטחי לשכבה העמוקה ביותר: האפידרמיס, הדרמיס, ורקמה התת עורית, בהתאמה. השורה הראשונה מציגה את השכבה הקרנית של האפידרמיס ממדגם עור שנחשף לצירופים ואלומינה בהשעיה; בשורה השנייה נחשפה לסיליקה צירופים ובהשעיה; והשורה השלישית לceria צירופים ובהשעיה. כל עמודה מתארת ​​את אותו האזור של העור צילם בטכניקות שונות. העמודה הראשונה המתאימה למיקרוסקופיה brightfield (בר = 50 מיקרומטר mag .; קנה המידה 40X), שבו השטח המגודר בכיכר אדומה היה מוגדל (mag 100X; סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר) עם מיקרוסקופ darkfield המשופר (EDFז) בטור השני, שבו חצים לבנים מצביעים על ניגודיות הגבוהה צירופים. העמודה השלישית הושגה עם מצלמה היפרספקטראלית (HSI), המציגה את הצירופים וניגודיות גבוהה זהות (חצים לבנים). תמונות EDFM וHSI נלקחו בהגדלה 100X; בר סולם = 10 מיקרומטר. הטור הרביעי מציג את תמונת HSI הממופה נגד RSL בהתאמה לכל קבוצת חשיפה, שבו צירופים ואלומינה מוצגות בצירופים וירוקים, סיליקה באדום, וצירופים וceria בצהוב, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

ליכולים להיות מושגת על דגימות רקמה שעברו צביעה היסטולוגית קונבנציונלית, זיהוי וניתוח של חלקיקי תחמוצת מתכת באמצעות שילוב של EDFM, מיפוי HSI, וטכניקות ניתוח תמונה. אמנם יש גמישות בהכנת מדגם להיסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (למשל, באמצעות רקמות קבועות או קפוא; סוג של כתם), חשובה שהדגימות הם מחולק לעובי של 5-10 מיקרומטר להדמיה אופטימלית. דוגמאות משמשות כאן היו קבוע פורמלין ולפני חתך עם microtome סיבובי עד 6 מיקרומטר עובי מוטבע פרפין, רכוב על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית, מוכתם hematoxylin ו eosin וcoverslipped. רקמות עור חזיריות משיתוף הפעולה טוקסיקולוגיה החדירה עורית vivo לשעבר שמשו למחקר זה. הרקמות נחשפו לחלקיקי תחמוצת מתכת (אלומינה, סיליקה, ceria) במתלים מימיים. איתור של האזור (ים) של עניין (eleme ניגודיות גבוההNTS) עם EDFM הוא צעד ראשון קריטי המאפשר מיפוי HSI לאחר מכן וניתוח. דגימות בקרה חיוביות ושליליות חייבים להיות צילמו וניתחו ראשון כדי ליצור ספריית רפאים להתייחסות. הספקטרום שנאסף מהביקורת החיובית מיוצא לספריית רפאים ביקורת חיובית. לאחר מכן, כל הספקטרום מתמונות השליטה השליליות מופחתים ספריית הרפאים של הבקרה החיובית על מנת לשפר את הספציפיות (להפחית חיוביים שגוי). ספריית רפאים המסוננת וכתוצאה מכך נחשבת RSL המשמש לניתוח חומרים של עניין. כל דגימות הרקמה לעבור את אותו תהליך ההדמיה וממופות נגד RSL. התמונה המתקבלת תכיל אזורים רק עם אלמנטים של עניין על רקע שחור. תמונה זו אז יכולה להיות מנותחת עם ImageJ באמצעות פונקציות הסף וניתוח חלקיקים שלה כדי לקבל את השטח של חלקיקים ממופים לשדה הראייה. נתונים מספריים המתקבלים מImageJ יכולים להיות יצואאד לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

חשוב לקחת בחשבון כי כדגימות ביולוגיות הן שונות בהמהות מזה, ושיטות צביעה עשויות להשפיע להדמיה באמצעות EDFM וHSI, צריכה להיקבע הגדרות החשיפה בהתאם למה שמייצר את תמונת ניגודיות גבוהה הטובה ביותר עבור סוג מסוים של מדגם. למרות ירידה של תוצאות חיוביות שגויות יכולה להיות מושגת באמצעות הסינון של ספריות רפאים, זה הוא חיוני כדי להשיג פקדים שליליים אמינות שנמנעו זיהום עם האלמנט של עניין, כפי שהספקטרום המתאים לזיהום זה עלול להיות מסונן מספריית הרפאים של הבקרה החיובית , הגדלת שיעורים שליליים כוזבים. כמו כן, מגוון עוצמת הספקטרום שניתן לזהות עם תוכנת הדמיה היפרספקטראלית לא יכול לעלות את המגבלה של תוכנה המסוימת (לצורך מחקר זה, שהוא 16,000 יחידות): אזורים עם מספר גבוה של חלקיקים שנצברו המייצרים spעוצמות ectral מעל גבול עוצמת נותרות מחוץ לספריית הרפאים, בשל הסיכון של הגדלת מספר שלילית שווא.

בעוד מערכת HSI מקנה יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות, יש כמה חסרונות ומגבלות לשקול. הוא אחד שהכמות הגדולה של נתונים שנאספו אופטיים עשויים לדרוש כוח מחשוב משמעותי. נוסף הוא שHSI יכול להיות זמן אינטנסיבי, במיוחד בשלבים הראשונים כאשר ספריות רפאים התייחסות נוצרות. כמו כן, זמן הדמיה עשוי לדרוש כמה דקות ללכידת תמונה, מה שהופך את איטי יותר מאשר ההדמיה darkfield פשוטה; עם זאת, הוא עדיין מהיר יותר מביצוע הכנת דגימה והדמיה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. בנוסף, מערכות מורכבות עלולות לגרום לספקטרום אופייני מרובה, הדורש הפיתוח של בקרות מאוד מיוחדות ולהפוך את הקמת ספריות סטנדרטיות, אוניברסליות התייחסות קשה ^26. לבסוף, טקתוצאות nique ברזולוציה נמוכה יותר מאשר טכניקות probe- או אלקטרון-מיקרוסקופי, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, אשר יכול לפתור אטומים בודדים. הרזולוציה של טכניקה זו היא מוגבלת בשל האופי פוטוניים, שמונע ממנו להיות כלי דיוק גבוה למדידת גודל חלקיקים ברמת ננומטר או לאיתור חומרים בדיוק ברמה תת-מיקרון. בעוד הטכניקה עשויה להיות מסוגל להצביע חלקיקים בתוך תאי רקמה מסוימים או אברונים תאיים גדול מ -1 מיקרומטר (כגון גרעין תא), האברונים או תכונות קטנים יותר מאתגרים לדמיין בצורה מדויקת בשיטה זו. כן, יש לציין, שניתן ברזולוציה מרחבית שלה, שיטה זו לא יכולה להבדיל בין חלקיקים וagglomerates ¹¹ בודדים.

שיקולים אחרים כוללים: חומרים מסוימים (כגון מתכות אצילות) יש החזרה ופרופילי רפאים ברורים הרבה יותר גבוהות, אשר יכול לגרום להם קל יותר analyze ומפת spectrally עם הכלי הזה. אחרים, כגון תחמוצות מתכתיות למחצה נחקרו במחקר זה וננו מבוסס פחמן ^{24, 27,} עשויים להיות מאתגרים יותר בשל ההרכב, הצורה הבסיסית שלהם, ובהתאם למטריצה. בשני מחקרים שאיפה עכברי על ידי מרסר et al., מערכת דומה לזו שהועסקה במחקר זה נעשה שימוש על מנת לאתר צינורות פחמן ובריאות באיברים משני המבוססים על ניגודיות הגבוהה להפליא שלהם עם רקמות הסובבות. עם זאת, מיפוי היפרספקטראלית לא הפגין באו מחקר, ככל הנראה משום שצורתו הייחודית של סיבי פחמן הייתה תכונה מספיקה לזיהוי. שיקול נוסף נוגע באופן ספציפי לרקמות: מאז הפקדת חלקיקים של עניין לאיברים ספציפיים באמצעות תהליכי biophysical נורמלים היא בלתי צפויה (ולעתים קרובות עצמו את הנושא של מחקר), קביעת בקרה חיובית ישימה יכולה להיות קשה ודורש שיקול של איך דור של מטר השליטהight להשפיע על המצב חומרי של עניין. לדוגמא, אם ספריית רפאים נוצר מחלקיקים וטהור של עניין, זה עלול להיות קשה כדי למפות את הספרייה לאותם חלקיקים ברקמות או תאים עקב שינויים בספקטרום כתוצאה משינוי של החלקיק (למשל, כתוצאה משינוי ב pH, פירוק, מסכת, חלבון מחייב) ומייקרו-הסביבה הכללית או מטריצה. לבסוף, הטכניקה מוגבלת בטבע חצי כמותית שלה: זה יכול להיות רק כמותי כמו שיטות מיקרוסקופיה דו ממדים אחרות של החלטה דומה, מה שאומר שלא ניתן להשתמש בם בקלות לבצע משימות כגון אפיון נטל איבר כולל של חומר.

בסך הכל, EDFM וHSI לספק מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה nanomaterial ואפיון קונבנציונליות, כגון TEM, HAADF ודסק"ש. EDFM / HSI מאפשר רכישה מהירה תמונה וניתוח, אשר חוסך זמן ועלות בהשוואה לconven האינטנסיבי יותרטכניקות tional. בנוסף, הכנת מדגם לEDFM / HSI היא בדרך כלל גם מינימאלית ולא הרסני, אשר חוסך זמן וגם מאפשר ניתוח גמיש יותר של מדגם נתון שכן הוא עשוי לשמש לטכניקות אחרות. יתר על כן, HSI הוא תכליתי, המאפשר ניתוח של חומרים ננומטריים של יצירות רבות ובמגוון רחב של מטריצות. צוות המחקר הוא עובד כדי לחדד את השיטה המתוארת כאן לחומרים אחרים וסוגי מדגם, כוללים הערכה מעמיקה של הספציפיות של הטכנולוגיה. השלב הבא קריטי תחת חקירה על ידי צוות המחקר הוא אימות של טכניקות אלה נגד סטנדרטים זהב מסורתיים (למשל, ראמאן, TEM, SEM) לחומרים וסוגי רקמות של עניין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CytoViva 150 יחידה (מעבה)	CytoViva (אובורן, AL)		מותקן על מיקרוסקופ אולימפוס BX43
מיקרוסקופ אולימפוס BX43 - חריץ אנלייזר - HSI עם מטרות אוויר 10x ו-40x ומטרת טבילת שמן פי 100	המתקבלת באמצעות CytoViva (אובורן, AL)		לשימוש עם מעבה CytoViva 150 Unit
מצלמת Firewire דיגיטלית Dagexcel-M - מקוררת; כולל תוכנת	Exponent 7הושג באמצעות CytoViva (אובורן, AL)		מצלמת שדה אפל משופרת ותוכנה
מערכת הדמיה היפרספקטרלית CytoViva 1.4; כולל מצלמה היפרספקטרלית Pixelfly, בקר שלב XY, תוכנת הדמיה היפרספקטרלית ENVI	המתקבלת באמצעות CytoViva (אובורן, AL)		מצלמה היפרספקטרלית ותוכנה
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מנוקות בחדר נקי (שקופיות זכוכית B)	Schott NEXTERION	1025087	פסולת וחפצים מופחתים בהשוואה לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית קונבנציונליות להדמיה אופטימלית
כיסויי מיקרוסקופ זכוכית נקיים (#1.0; 22 מ"מ x 22 מ"מ x  1.45 מ"מ)	Schott NEXTERION	מופחת בהתאמה אישית	פסולת וחפצים בהשוואה לכיסויי זכוכית קונבנציונליים להדמיה אופטימלית
סוג A שמן טבילה במיקרוסקופיה	פישר סיינטיפיק	12368B	ספקים מרובים
70% איזופרופנול ב מים			מרובים
ספקים תוכנת ImageJ	המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)		תוכנת קוד פתוח בחינם להורדה מקוונת
של ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת	המסופקים לצוות המחקר על ידי שותפים		אלומינה, סיליקה וננו-חלקיקי סריה בתרחיפים מימיים. בשל הסכם סודיות בין המחברים לשותפים בתעשייה, לא ניתן לחשוף מידע נוסף על המוצר.