תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

סיכום

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תקציר

תחבורת חלבון ממברנה על רמת החלבון היחידה עדיין מתחמקת ניתוח מפורט, אם המצע translocated הוא בלתי electrogenic. מאמצים רבים נעשו בתחום זה, אך טכניקות המאפשרות ניתוח תחבורת תפוקה גבוהה אוטומטי בשילוב עם טכניקות bilayer שומנים ממסות ללא נדרשו לניתוח של מובילי הממברנה הן נדירות. מחלקה זו של מובילי אולם הוא מכריע הומאוסטזיס התא ולכן יעד מרכזי בפיתוח תרופות ומתודולוגיות כדי לקבל תובנות חדשות זקוקה נואשות.

כתב היד המוצג כאן מתארת ​​את ההקמה וטיפול של biochip רומן לניתוח תהליכי הובלה בתיווך חלבון הממברנה ברזולוציה טרנספורטר יחידה. Biochip מורכב microcavities המוקפת nanopores כי הוא מקביל מאוד בעיצובו יכול להיות יוצר כיתה תעשייתית וכמות. ליפוזומים-מחסה חלבון ניתן ליישם ישירותפני שטח השבב להרכיב bilayers שומנים נקבובי פורש עצמי התאסף באמצעות SSM-טכניקות (נתמכים מוצק ממברנות שומנים בדם). נקבובי פורש חלקים של הממברנה הם בודדים, מתן הממשק עבור טרנסלוקציה מצע לתוך או מתוך שטח החלל, אשר יכול להיות מלווה הודעת פלורסנט רב-ספקטרלי בזמן אמת. הקמת נהלי עבודה סטנדרטיות (SOPs) מאפשרת הקמה הפשוטה של ​​bilayers שומנים מחסה חלבון על פני השבב של כמעט כל חלבון הממברנה כי יינתן מחדש מבחינה תפקודית. תנאי היחיד הוא הקמת מערכת לקריאה החוצה פלורסנט מצעי תחבורה שאינו electrogenic.

ביצועי תוכן יישומי הקרנה הם מטרות משנים על ידי שימוש מיקרוסקופי פלואורסצנטי הפוכים אוטומטיים הקלטה שבבית מרובה במקביל. ערכות נתונים גדולות ניתן לנתח באמצעות תוכנת ניתוח האישית מעוצב הזמינה באופן חופשי. שלושה צבעים ניאון ספקטרלי רבלקריאה החוצה יתר על כן מאפשרת אפלית נתונים משוחדת למעמדות אירוע אחרות, ביטול תוצאות חיוביות כוזבות.

טכנולוגית השבב מבוססת כיום על משטחי SiO _2, אבל functionalization נוסף באמצעות משטחי שבב מצופה זהב הוא גם אפשרי.

מבוא

הניתוח של חלבונים בממברנה הפך של הגדלת ריבית למחקר בסיס תרופות ב -20 השנים האחרונות. פיתוח תרופות חדישות תלוי בזיהוי ואפיון מפורט של מטרות חדשות, כיום להיות אחד הגורמים המגבילים. העובדה כי כ -60% מכלל מטרות התרופה הם חלבונים בממברנה ^1, הופכת את הפיתוח של טכניקות על מנת להבהיר את תפקידם החשוב ביותר.

בעבר, טכניקות לחקר ערוצי מובילי electrogenic פותחו שפע ^{2 - 4.} מצעים ללא electrogenic בניגוד להציג משימה מאתגרת יותר. הם לעומת זאת עניין מיוחד, שכן מטרות תרופת ממשלה, כפי שהם שולטים השטף של מומסים וחומרים מזינים על פני קרום התא ותפקוד כקולטנים מפתח איתות מפלים ^5.

מאמץ ניכר כבר הכניסו לתוך הפיתוח של techniques ללמוד את תפקודם של חלבונים תחבורה הממברנה ^{6, 7.} מערכות המשתמשות ממברנות מוצקות נתמך צמחו ככלים מבטיחים ביותר בתחום זה ^{8 - 10,} כולל bilayers שומנים המוצק נתמך, bilayers הקשור ^{11, 12,} ממברנות שומנים בדם microblack ^{13, 14} ו מערכי שלפוחית ​​יליד ^{15, 16} עד כמה שם. חלקם אפילו זמינים כמו setups המסחרי ^{17, 18.} כמה דוגמאות פורסמו שילוב היכולת ללמוד חלבונים בממברנה יחידים באופן מקביל מאוד ^{14, 19,} תנאים הכרחי עבור יישומי הקרנה. עם זאת, שיטות אלו לעתים נדירות לגשר בין מחקר בסיסי כדי הסביבה התעשייתית. הקשיים בדרך כלל לשכב היכולת של המערכת להיות automatable, ייצור אינטנסיבי בעלות ו / או הכנה מפרכת. גישה o vercoming כל המכשולים הנ"ל הוא המטרה הסופית.

הטכניקה המוצגת כאן פותחה ללמוד ערוצי קרום מובילים במבחנה בסביבה מבוקרת על רמת החלבון היחידה ^{20 - 22.} כינון של חלבונים בממברנה מטוהר אל חביבי מוקם יותר הרבה יותר מאשר גישות דומות עבור GUVs ^{23 - 26} או שומנים שחורים ממברנות ^27. הם יכולים להיות מיושמים ישירות אל פני שטח השבב, שם היווצרות bilayer מתקיימת באמצעות תהליך הרכבה עצמית. עיצוב הזכוכית התחתונה של שבב nanoporous (איור. 1) מאפשר מיקרוסקופיה אוויר, המאפשרת האוטומציה הפשוטה של המערכת. בשילוב עם במה ממונעת שבבי מרובים ניתן למדוד בו זמנית, עם כל שדה הראייה המכילה אלף חללים אטומים לניתוח.

= "1">
איור 1. עיצוב של biochips nanopore המרובב. א) סיליקון על מבודד (SOI) רקיק בנוי על ידי תחריט תגובתי-יון. כ 1,150 צ 'יפס פרט מיוצר מ כל רקיק עם מאפיינים זהים ואיכות. B) כל שבב מורכב 250,000 microcavities פרט עם פתחי ננו. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר C) חלל כל למיעון דרך-אאוט לקרוא קרינה רבה-ספקטרלי. בלוקי שכבה העליונים intransparent אותות הניאון ממאגר החיץ, מה שהופכים את biochip תואם מיקרוסקופי פלואורסצנטי הפוכים. D) במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה חושפת מסודר באופן שווה פתחים נקבוביים וחספוס פני שטח של שכבת תחמוצת סיליקון של 3.6 ננומטר (n = 40) אופטימלי איחוי שלפוחית. סרגל קנה מידה:. 5 מיקרומטר E) מיקרופון אלקטרונים סורקroscopy (SEM) התמונה מראה חתך דרך nanopore המאפשר גישה החללים femtoliter בתוך שבב סיליקון. נתון זה נעשה שימוש חוזר באישור ^21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כל ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנה חופשית על מנת להבטיח גישה חופשית עבור משתמשי קצה. סדרת זמן מנותחת באמצעות תוכנת עיבוד תמונה חינם תוכנת ניתוח עקום לבנות מותאם אישית עיבוד יצווה המאפשר וקורלציה פשוטה של ​​מערכי נתונים גדולים עם ערוצים ואלף פלורסנט מרובים של עקומות.

חלבון המודל להשתמש בפרוטוקול זה הוא ערוץ mechanosensitive של מוליכות גדולות (MscL) ערוץ חלבון נגזר E. coli. הוא מתפקד כשסתום לשחרור הלם אוסמוטי בטבע, אך הוא היה שונה בצורה כזאת כי תוכננה באופן רציונלי syntפונקציות hetic ניתן לחבר קוולנטית לצד התכווצות ערוצים. ויה-הדחייה ממונית על המפעיל המחויב קוולנטית (MTSET) בערוץ מופעל לפתוח, יצירה-שסתום ננו. מולקולות קטנות כמו יונים, מים, חלבונים קטנים, אך גם fluorophores הקטן יכולות לחלחל דרך הערוץ. הנה, החלבון משמש כמודל כדי להדגים את היכולת של המערכת לזהות טרנסלוקציה חלבון בתיווך.

פרוטוקול

1. הכנה גדולה Unilamellar השלפוחית ​​(חביב)

1. נקה בקבוק תחתי עגול (נפח 10 מיליליטר) עם גז חנקן כדי להסיר כל חלקיקי אבק. יש לשטוף את הבקבוק התחתי העגול עם אתנול.
   הערה: אתנול שיורית יכול להיות נסבל ואינו להפריע בשלבים הבאים.
2. שטפי 4x מזרק זכוכית 1 מ"ל עם כלורופורם, כדי להסיר כל זיהום. הוסף 4 מ"ל SoyPC20 (25 מ"ג / מ"ל כלורופורם) אל הבקבוק תחתית עגולה וסמים הפתרון השומנים עם ^ATTO DOPE נוסף ³⁹⁰ לריכוז סופי של% mol 0.1.
   הערה: במקום DOPE ^{ATTO 390} שומנים fluorophore שכותרתו אחרים או צבעים lipophilic יכול לשמש גם, תלוי מקורות עירור זמין.
3. חבר את הבקבוק התחתי העגול כדי מאייד סיבובי. ייבש את סרט השומנים במשך 40 דקות ב 300 mbar, 30 ° C טמפרטורה מי אמבטיה ומהירות סיבוב מקסימלי, כדי ליצור סרט שומנים הומוגנית על קיר הזכוכית של הבקבוק.
4. transfאה הבקבוק כדי משאבת ואקום גבוהה ויבש סרט השומנים למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת חדר.
5. הוסף 5 מ"ל חיץ (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; סטרילי מסונן) ו -8 חרוזי זכוכית (קוטר 2.7 מ"מ, אתנול כביסה, ייבוש) אל הבקבוק. חבר את הבקבוק אל המאייד הסיבובי ולסובב ללא ואקום ב 50 מעלות צלזיוס במהירות מרבית.
   הערה: חרוזי זכוכית מכאניים לעקור את סרט שומנים מקיר הזכוכית, מוביל (multilamellar) היווצרות שלפוחית. אחרי 45 דק 'סיבוב הפתרון מופיע חלבי ולא סרט שומנים שיורית צריך להיות גלוי על קירות הבקבוק. במקום חרוזי זכוכית שיטות אחרות כמו sonicating הבקבוק בתוך sonifier באמבט מים, vortexing הבקבוק או שיטת ההתייבשות העדינה חלות גם.
6. מעבירים את הבקבוק תחת גז אינרטי (ארגון) ל אמבטיה sonicate קולי עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: גלי הלם אולטרסאונד לשבש את ליפוזומים, מה שהופך אותם unilamellar.
7. פיצול פתרון LUVלתוך 1 מ"ל aliquots.
8. בצע 5 מחזורי הקפאה / פשרה על ידי הקפאת פתרון LUV בחנקן נוזלי, ואחריו מפשיר ב 40 מעלות צלזיוס באמבט מים.
   הערה: זה מוביל להתפקע התארגנות ספונטנית של ליפוזומים פרט אחד עם השני, המוביל להגדיל את הגודל.
9. בחנות צעד ההקפאה האחרונה כל הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: החביבות יהיה יציב במשך 6 חודשים לפחות.

2. כינון חלבון

1. להפשיר 1 LUV aliquot מ"ל על הקרח. ישירות לפני הכינון מחדש, extrude ליפוזומים 17x דרך קרום מסנן פוליקרבונט 400 ננומטר באמצעות מכבש מיני.
   הערה: אגרגטים ליפידים יוסרו ואת התפלגות גודל הומוגנית סופית.
2. לערער חביבים על ידי תוספת של 4% Triton X-100 (v / v) לריכוז סופי של 0.25% (v / v) ו דגירה במשך 5 דקות ב 50 מעלות צלזיוס.
   הערה: הכמות ליפוזומים בשימוש בשלב זה תלויה במסה של ^G MscL מטוהר ^{22 C בשימוש (ראה שלב 2.3). לטהר MscL G 22 C (נגזר E. coli) כמתואר בפירוט 28.}
3. מערבבים מטוהרים MscL ^{G 22 C} ו ליפוזומים-רווי דטרגנט בשעה 1:20 (w / w) יחס דגירה במשך 30 דקות נוספות ב 50 מעלות צלזיוס.
4. למען הסר דטרגנט להוסיף ביו-חרוזים במאגר טריס (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; מסונן סטרילי) לפתרון חלבון / liposome, עם 16 מ"ג (משקל רטוב) ביו-חרוזים לכל μl חומר הניקוי לערער ליפוזומים ב צעד 2.2.
5. בצע חומר ניקוי הסרת לילה (16 שעות) בשעה 4 ° C על צלחת מסתובבת.
   הערה: ערבוב מתמיד של הפתרון מבטיח הסרת חומר ניקוי אופטימלי.
6. לאחר proteoliposomes חנות חומרי ניקוי להסרה ב 4 ° C ולהשתמש לניסויים באותו היום.

Assay 3. פעילות

1. במהלך הכינון מחדש חלבון לקחת aliquot 100 μl של detergent-פתרון proteoliposome ערער לאחר שסיים צעד 2.3.
2. הוסף 1 נפח של calcein (30 מ"מ) לפתרון חלבון-ליפוזום דגירה 5 דקות נוספות ב 50 מעלות צלזיוס.
3. סור חומר ניקוי מהפתרון כמתואר בשלב 2.4 - 2.6.
4. לאחר הסרת חומר ניקוי לאזן עמודה בגודל הדרה (נפח המיטה 20 מ"ל או יותר) עם חיץ טריס (3x נפח המיטה).
   הערה: הפרדה Proteoliposome יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, עם זאת לשמירת הדגימה הזמן ב 4 ° C מומלץ להבטיח פעילות החלבון הטוב ביותר לאחר חלוקה.
5. proteoliposomes פרד calcein בחינם על ידי החלת aliquot כולו (200 μl) לעמודת הדרת גודל. אפשר תערובת כדי לספוג לתוך הטור, ואחריו elution של proteoliposomes מהעמודה באמצעות יישום חיץ רציפה על גבי באמצעות זרימת כוח הכבידה. שים את calcein המכיל proteoliposomes כלהקה כתום דיסקרטית בחלק הקדמי elution. אסוף שברים של 500 & #181; l בהתאמה.
   הערה: צבע calcein חינם יהיה elute לאחר שבריר proteoliposome עם הפרדה מוחלטת.
6. פיפטה 80 μl של כל חלק על צלחת מיקרו-טוב ניאון לקריאה החוצה ולזהות את החלק היחסי המכיל את הכמות הגבוהה ביותר של proteoliposomes המכיל calcein באמצעות פליטת הקרינה. זיהוי הקרינה ב 520 ננומטר עם עירור ב 490 ננומטר. השתמש חלק proteoliposome עם האות הגבוה ביותר עבור assay הפעילות הבאה.
7. מערבבים 20 μl של שבריר המכילים proteoliposome עם 980 μl טריס חיץ קובט הקרינה 1 מ"ל.
8. מדוד פליטת הקרינה ב 520 ננומטר (עירור 490 ננומטר) באמצעות spectrofluorometer. שיא עבור 1 דקות ולאחר מכן להוסיף 25 μl של MTSET ([2- (trimethylammonium) אתיל] methanethiosulfonate) מפתרון המניות (160 מ"מ) ומערבבים היטב. שמור על הקלטה בזמן הערבוב. תמיד להכין את פתרון המניות טרי ישירות לפני השימוש.
   הערה: לאחר לפתור Hydrolyze חיץ MTSETהים תוך 30 דקות ויהיה הלא מגיב. MTSET יכול להישקל והמשיך aliquot אבקה יבשה כמו ב -20 ° C עד השימוש.
   הערה: לאחר הפעלת ערוץ MscL ^{G 22 C} נפתח ומשחרר את calcein בפח, מה שמוביל לירידת ריכוז מקומית של calcein כאשר effluxing proteoliposomes ו dequenching הבאה של הצבע, וכתוצאה מכך לעלייה של פליטת הקרינה.
9. לאחר פליטת הקרינה הגיעה הרמה יציבה שוב, solubilize ליפוזומים על ידי תוספת של 50 μl טריטון X-100 (4% v / v).
   הערה: באופן אידיאלי לא להגדיל קרינה נוספת ניתן לצפות, רומזת חלבון פעיל בכל liposome.

4. מדידת התפלגות גודל של חביבי ושימוש של מעקב ננו-חלקיקים

1. שים לב, רק דגימות מינימאליות של liposome או proteoliposome פתרון נחוצות ניתוח התפלגות גודל באמצעות גשש ננו-חלקיקים. לדלל פתרון liposome של 5 מ"ג / מ 'l השומנים ריכוז 1: 5,000 (v / v) במאגר (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; סטרילי מסונן) לניתוח לנפח סופי של 1 מ"ל. סנן את כל המאגרים המשמשים דילול והכנת LUV לפני והרכבתה מחדש באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל חלקיקים מרחפים כמו אבק שהיה צריך להפריע מדידות התפלגות גודל.
2. שטפו את תא זרימה עם מים טהורים.
3. השתמש בסמנים משטח להתמקד קרן אור. להזריק כ 300 μl של מדגם liposome המדולל ומייד לסגור את שסתום היציאה כדי לעצור את הזרם בתוך תא הזרימה, ללא החדרת בועות אוויר.
4. התאם את הגדרות המיקוד ואת המצלמה תריס / רווח כדי להבטיח אות פיזור נאות של המדגם לצורך זיהוי.
   הערה: 20 - 80 אותות צריכים להיות גלויים בבירור את שדה הראיה. למנוע צפיפות יתר (> 80 אותות) כתוכנה לא תוכל לעקוב אחר אותות בודדים כאשר חופפים.
5. עבור אל SCR "לכידת"een. כוונן את בקרת הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס ואת המשך ללכוד עד 90 שניות באמצעות פקדי תוכנה. לחצו על "שיא" כדי להתחיל להקליט סדרה עתית.
   הערה: עם השלמת סדרת זמן חלון חדש נפתח.
6. שמור את סדרת הזמן בפורמט הנתון (* .avi). מסיבות מעשיות במהלך הניתוח תצווה שמרו את כל הקבצים בתיקייה אחת.
7. פתח את שסתום היציאה ולהזריק עוד 300 μl לתוך תא הזרימה. סגור את השסתום וחזור על שלבי 4.3 - 4.6 פעמים.
8. לאחר השלמת כל הריצות מדגם לשטוף את התא זרימה עם 5 מ"ל מים טהורים. עבור למסך "טרום התהליך". הגדר את טמפרטורת פרמטרי כיול = 25 ° C וצמיגות = 0.91 עבור למאגר טריס בשימוש בפרוטוקול זה.
9. פתח את החלון יצווה תהליך ולטעון סדרת ההיסטוריה המתועדת (תהליך המתקדם / יצווה / גדר קובץ 1-3). לחץ "GO" כדי להתחיל את ניתוח התפלגות גודל.
   הערה: אוטומציה תוכנה אנליטייםקאלי עוקב אחר חלקיקים היחידים ומחשב בקוטר שלהם על סמך התנהגות תנועתם באמצעות הפרמטרים שנקבעו צעד 4.8.
   הערה: ניתוח התפלגות גודל וכתוצאה מכך חוסך באופן אוטומטי לתוך באותה התיקייה כמו קבצי סדרת הזמן.
10. בנוסף ליצור קובץ דו"ח לסכם את התוצאות (יצוא / צור דוח PDF).

5. הכנת צ'יפ מחזיק

1. לשקול 1.0 גרם של בסיס אלסטומר כיתה רפואי MDX4 וסוכן ריפוי 0.1 גרם MDX4 לתוך צינור התגובה 50 מ"ל. ערבבו שתי ביסודיות עם בר זכוכית.
2. שים את הצינור לתוך תא ייבוש במשך שעה 1 כדי דגה הדבקה. לאחר מכן להשתמש בו תוך 30 דקות עבור הדבקת שבב, כמו הדבק יקשיח ולהיות קשה מדי לעבוד עם.
3. במהלך degassing אלסטומר (שלב 5.1) לניקוי זכוכית שקופית המטרה ביסודיות עם כלורופורם כדי להסיר כל זיהומים לפני מליטה שבב. יש לשטוף את השקופית עם 5 מ"ל של כלורופורם באמצעות מזרק זכוכית. אסוף אתכלורופורם בתוך כוס מתחת לתפס. לאחר הכביסה ולתת יבש שקופיות.
   הערה: בצע פעולה זו תחת במנדף. חלופה כלורופורם, ממיסים אורגניים אחרים כמו אצטון יכול לשמש גם.
4. להפקיד כמות קטנה של חומר מליטה דבק על הזכוכית המכסה באמצעות קצה פיפטה (טיפים קריסטל עבור 10 טפטפות μl). זכור כי שבבי צריך להשתלב מחזיק השקופיות 8 קאמרית בהמשך, צריך להיות ממוקם בשקופית בהתאם.
5. מוציאים בזהירות שבב אחד בכל פעם מהלוח רקיק באמצעות פינצטה קצה קנס וכן להפקיד את השבב על טיפת דבק על הזכוכית המכסה. ודא שהצד המצופה של השבב פונה כלפי מעלה.
6. דחף בעדינות את השבב על זכוכית לכסות עם החלק האחורי של פינצטה PE בוטה. כדי להבטיח כי הדבק הוא חלק שווה מתחת השבב, חלק בזהירות את השבב הלוך ושוב. שלב קריטי: מוודא כי אין בועות אוויר לכודות מתחת השבב, כפי שהוא יפריע הדמיה אופטיתשל חללי השבב בהמשך. כמו כן לוודא ששום חומר הדבקה ומזהם את פני השבב.
7. לייבש את הזכוכית המכסה המוגמרת עבור שעה 2 ב 65 מעלות צלזיוס בתוך מייבש ארון.
   הערה: שבבי עדיין מכוסים שמקורו שכבת מגן מפני הייצור שלהם שצריך להסירו.
8. כדי להסיר את שכבת מגן, לבצע צעד כביסה ממס רציפים. במהלך הריפוי של שבבי, מחמם באמבט מים עד 54 ° C.
9. מניחים 3 כוסות זכוכית לאמבטיה מים, שניהם מלאים isopropanol ואחד מלא אצטון.
10. הכנס את מכסה זכוכית השבב לתוך החזיק שקופיות לצלול אותו לתוך הצלחת המלאה isopropanol הראשון במשך 10 דקות. לאחר מכן להעביר אותו בצלחת מולא אצטון, דגירה שוב למשך 10 דקות לפני העברת אותו על שלב הכביסה הסופי כדי בצלחת isopropanol השנייה דגירה עוד 10 דקות.
11. הסר את מחזיק השקופיות מצלחת ובזהירות לשטוף אותו בהרחבה ultrapurמי דואר, ואחריו ייבוש השבבי עם זרם עדין של גז חנקן.
12. קח-את סדין למינציה מן ההחלקה הדביקה 8 היטב ולשים אותו לאחור על הספסל. בזהירות להרים את שקופית הכיסוי ולחץ בעדינות על-השקופיות הדביקות עם הצ'יפס מול הבארות. תן את שאר בעל שבב המוגמר במשך כמה דקות לפני השימוש.

6. הכנת Assay

הערה: שבבי nanopore דבוק כוס כיסוי ומופרד על ידי 8-גם דביק-שקופית להחזיק את היתרון, שבבי מספר כי ניתן לטפל בטווח אחת ניסיוני, עם שבבי להיות מופרדים לחלוטין אחד מהשני.

1. לאחר הכנת בעל שבב, ולשטוף כל שבב עם אתנול טהור מכה יבשה בגז חנקן, כדי להסיר זיהומים כל כאבק.
2. נקו את משטח השבב עם אוויר, חמצן או פלזמה חנקן. בהתאם לסוג של תקופות זמן ניקוי פלזמה להשתנות: לבצע טיפול פלזמה חמצן דקות 1, אוויר ניטפלזמה רוגנת במשך 5 דקות ב 0.3 mbar בהגדרת כוח 80% (בינוני ספק RF או גבוה).
3. לאחר ניקוי פלזמת דגירה שבבית אתנול טהור במשך 10-15 דקות כדי להבטיח הרטבת חלל.
4. אתנול החליפין צעדיים עבור חיץ על ידי הוספת 400 μl של חיץ טריס (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; סטרילי מסונן), ואחריו ערבוב של הפתרון ללא החדרת בועות אוויר ופינוי הבאות של 400 μl. חזור על הליך זה 12 פעמים, כדי להבטיח הסרה אתנול.
   הערה: אתנול יהיה מזיק ליפוזומים bilayers השומנים מושעה.
5. סמים טריס חיץ (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; סטרילי מסונן) עם 5 מ"מ CaCl ₂ ו -1 מיקרומטר Oy647 לצבוע. להסיר לחלוטין את חיץ הכביסה מהשבב ומייד להוסיף למאגר המסומם עד השבב. הערה: צ'יפס יהיה מכוסה בסרט חיץ דק לאחר הסרת חיץ לשטוף, כך השבב הוא לא במגע ישיר עם האוויר, על מנת להבטיח הרטבה מתמדת של החללים ואת פני השבב.
6. הוסף 1 מ"ג / מ"ל ​​חביבי או proteo-חביבי במאגר טריס (20 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0; סטרילי מסונן) זה טוב.
   הערה: ההיקף הסופי בכל טוב הוא 300 μl. רואה בם תוספות מאוחרות יותר של הצבע המלא ואת MTSET משתנה 'הכימית במהלך בנוסף חיץ טריס מסומם.
7. עבור היווצרות bilayer שומנים פורשים נקבובית על פני שבב דגירת השבב עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם פתרון liposome. לאחר מכן לשטוף כל שבב עם 4x 400 μl של Ca ^{2 +} -חינם טריס חיץ.
8. מוסיף את הצבע המלא כל טוב, עם ריכוז סופי של 5 מיקרומטר. השבבים מוכנים כעת עבור assay טרנסלוקציה.

7. התקנת Assay

1. הר בעל שבב המיקרוסקופ epifluorescence (אובייקטיבי אוויר 20X, מרחק עבודה ארוך). דגש על השפה של השבב nanopore בקלות יותר למצוא את מישור המוקד של-חללים מיקרו. לאחר החללים הם בפוקוס לסרוק את מערך nanopore עבור אזור העל שלטי יחס איטום הגבוה ביותר.
   הערה: כל מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה ניתן להשתמש כדי לבצע מבחני השבב. בהתאם הגדלה האובייקטיבית (20X - 60X) מספר חללי assayed ישתנה, עם עד 9,000 חללים בשדה אחד מבט באמצעות גדלת 20X. מטרות אוויר עם מרחק עבודה ארוך עדיפות. השימוש של מיקרוסקופי סריקת ליזר confocal הפוכים (CLSM) הוא גם אפשרי, אבל רכישת תמונה עשויה להיות הגורם המגביל בשל העומק המוגבל של מוקד.
2. מטב את תאורת השבב.
   הערה: ודא כי שני ערוצים לצבוע אינם עולים על ערך הסולם האפור מקסימלית, כמו שינויים לא ניתן לצפות. בניסויי יצוא להתאים תאורה לצבוע translocated 90% מיכולת אות מרבי. התאם את צבע שליטת חללים פתוחים 80-90% מיכולת אות מרבי כדי לאתר את כל איטום קרום דולף בבירור.
3. לאחר כל הערוצים מותאמים להתחיל את סדרת זמן. צלמו תמונות בכל 10-20 seצלזיוס למשך 90 דקות.
   הערה: זהו נאותה גם לעקוב אחר מאורעות בזרימה ספציפיים נוקבים.
4. לאתחל בזרימה של מצע הניאון על ידי התוספת של ציסטאין ספציפי, טעונת MTSET מתחם חיובי לריכוז סופי של 3 מ"מ. אפשר לפחות 5 דקות של ריצת ניסוי לפני כן MTSET תוכל מאוחר יותר להקים אות ניאון יציבת בסיס לפני לתעל פתיחה. תמיד להכין פתרון MTSET טרי ישירות לפני השימוש.

ניתוח 8. נתונים

1. פתח את ערימת תמונת סדרות עתיות עם גרסה רגילה של ImageJ (קובץ / יבוא / רצף תמונה).
2. אם ערוצי ניאון נערמים, לפצל את הערוצים בערימות בודדות עבור כל ערוץ (תמונה / ערימות / חולין כדי תמונות).
3. שכפל את התמונה הראשונה של ערוץ המצע טרנסלוקציה עבור ROI (אזורים של עניין) זיהוי (תמונה / כפולים).
4. להמיר את התמונה תמונה בינארית (תמונה / התאם / סף). לְהַבטִיחַכי האלגוריתם המשמש מתאר אותות לכל החללים האטומים ללא חפיפת pixilation.
5. באופן אוטומטי להגדיר אזורים של עניין עם כלי Analyzer חלקיק (לנתח / לנתח החלקיקים). גדר גודל חלקיקי מינימום המוגדר, כדי למנוע רעש חלקיקים. בדקו את האפשרויות "לכלול בקצוות" ו "כולל חורים". ודא כי ROIs כתוצאה ישקף את דפוס מערך microcavity. ROIs Interjacent הם חפצים, ולכן להסיר אותם. שמור את רשימת ROI.
   הערה: פרמטר מדידה צריך להיות מוגדר "שטח" לפני ניתוח חלקיקים (לנתח / מדידות גדר / Area)
6. פתח את התוספת Analyzer סדרות עתיות (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), המשנה את גודל כל ROIs אוטומטית באותו גודל. Re-גודל כל ROIs קיים על רוחב / גובה של פיקסלים 6x6 ו צורת אליפסה (Analyzer סדרה טיימר / AutoROIProperties). סמן את האפשרות "שנת Rois הקיים". שמור את רשימת ROI לשנות את גודלן שהתקבל.
7. פתח את מנהל ROI(ניתוח / כלים / מנהל ROI) לטעון את הרשימה ROI לשנות את הגודל עבור כל ערוץ של סדרות עתיות (/ מאנגר ROI עוד / פתוח). ROIs יהיה superposed. כדי לנתח את שינוי אות לכל ROI להתחיל בכלי מדידה רב (מנהל ROI / עוד / מדוד רב), בחר "מדוד כל פרוסות" ו "שורה אחת לכל פרוסה" ולהתחיל למדוד רב.
   הערה: פרמטר מדידה צריך להיות מוגדר "אומר ערך אפור" עבור שלב זה (ניתוח / מדידות Set / Mean ערך אפור)
8. שמור השולחן וכתוצאה מכך, נותן את הערך האפור הממוצע עבור כל ROI ב * .txt או * בתבנית xls.
9. ייבא את ניתוח ROI של כל ערוץ הדמיה לתוך NanoCalcFX באמצעות האפשרות "קובץ ייבוא". גדר "השתמש בשורה הראשונה למתן שמות סדרה". הגדר את גודל הצעד בין תמונות בהתאם לתקופות רכישת תמונת סדרת הזמן לבחור את העמודה המתאימה ואת המפריד עשרוני.
10. השתמש באפשרות "דף הכולל מספר" כדי לתאם את הגרפים אוטומטיים של fluo הפרטערוצי rescent.
    הערה: אירועי כעת ניתן לנתח ומסווג שימוש במידע שניתן על ידי מידע ספקטרלי 3 צבעים.
11. התאם עקום שנבחר באמצעות פונקציה בכושר-in לבנות (האפשרות בכושר).
    הערה: המשוואה בזרימה ואת זרם המיושם מתאימה לכל אירועי monoexponential מונחה דיפוזיה והגבולות בכושר ניתן להגדיר. ניתן להתוות כתוצאה קבועה קצב השימוש באפשרות היסטוגרמה או מיוצא עידון נתונים נוספים.

תוצאות

ממברנות נקבוביות פורש ניתן ליצור בקלות על פני שבב nanostructured באופן עצמי התאסף. אולם תהליך הבסיסית היא עדיין עדין המושפע מפרמטרים רבים כמו גודל liposome, monodispersity של האוכלוסייה liposome, lamellarity, lipid- ומלח-הריכוז ועל התכונות הכימיות השטח. רוב הפרמטרים אלו מתאפיינים בזהירות טופלה בפרוטוקול לעיל. פרמטרים אחרים אולם צריך להיבדק במהלך כל הכנות חדשות, על מנת להבטיח בניסוי מוצלח. אלו הם התפלגות גודל liposome והאוכלוסייה dispersity ...

דיון

הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת בדיקה מקבילה מאוד תחבורת חלבון הממברנה. מערכות חלבון הממברנה מחדש ניתן ליישם ישירות biochip, מה שהופך את ההתאמה של תיאורטית כל טרנספורטר קרום או ערוץ אפשרי. ניתוח תחבורה מוגבל רק על ידי הקמת מערכת לקריאה החוצה פלורסנט, בין אם באמצעות שינוי קרינה ישיר (טרנסלוקציה של fluorophores או מצעים שכותרתו fluorescently) או שינוי קרינה עקיף (צבעים-רגיש pH, תגובות אנזימטיות משניות). השני, לעומת זאת עדיין לא נקבע, הוקמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנט
[2-(טרימתילאמוניום)אתיל] מתאנטיוסולפונאט	טורונטו מחקר כימיקלים בע"מ.	T792900	MTSET; הידרוליזה על ידי מים. יש לשמור כפודר יבש בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. יש להשתמש מיד (30 דקות) לאחר המסה במאגר.
1 מ"ל מזרק אטום לגז	המילטון	#1001
בקבוק עגול 10 מ"ל	שוט דוראן
2.7 מ"מ חרוזי זכוכית	רוט	N032.1
2-פרופנול	רוט	9866.5
30 ס"מ צינור הארכה Luer-Lock	Sarstedt	744304
אצטון	רוט	5025.5
חרוזי ביו SM-2	את הסופח Bio-Rad	152-3920	לפני השימוש הראשון
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	לאחסן כהה ב-20 מעלות; C
מגיב כלורופורם כיתה	VWR כימיקלים	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	אחסן כהה ב-20 מעלות; C
אתנול מוחלט	Sigma-Aldrich	32205
Injekt מזרק חד פעמי	בראון	460 60 51V
Injekt-F מזרק חד פעמי	בראון	91 66 017V
קק קליפסים	Schott	KC29
L-α-פוספטידילכולין, 20% (סויה)	Avanti Polar Lipids	5416016	לאחסן תחת גז אינרטי ב-20 מעלות; C
NaCl 99.5% לשנה	Roth	3957.2
Nanopore E100 רקיק/שבבים	Micromotive (מיינץ/גרמניה)		זמין על פי בקשה
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µ m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	חנות כהה ב-20 מעלות; C
Oy647	Luminartis (Mü nster/גרמניה)	OY-647-T-1mg	חנות כהה ב-20 מעלות; C
סינון מזרק רוטילבו, לא סטרילי, גודל נקבוביות 0.22 ומיקרו; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	חומר עמודה לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל סילסטי
MDX4-4210	דאו קורנינג		לקיבוע שבב על כיסוי תמיכת זכוכית
דביקה-שקופית 8 בארות	ibidi	80828	תא רב בארות להרכבה על שקופיות זכוכית (מחזיק שבב)
תלת כיווני תא עצירה כחול	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 & micro; m מסנן ממברנה חנקתית תאית	רוט	NH69.1
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
><חזק>ציוד
Bü chi 461 אמבט מים	Bü
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü
chi Cary Eclipse ספקטרופטומטר פלואורסצנטי	Varian
LiposoFast מיני אקסטרודר	Avestin
	Vaccubrand	15430
Nanosight ננו-חלקיקים מעקב מיקרוסקופ	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE מיקרוסקופ	Synentec		זמין לפי בקשה
בקרת משאבה	Vaccubrand	CVC 2II
סוניקטור אמבט Sonorex RK100H	Brandelin	אלקטרוני 31200001107477
משאבת ואקום RC5	Vaccubrand	1805400204
אמבט מים W13	Haake	002-9910
מנקה פלזמה PDC-37G	האריק פלזמה	PDC-37G
<חזק>שם	<חזק>חברה	><חזק>מספר קטלוגי	<חזק>תגובות
<חזק>תוכנה
ImageJ	קוד פתוח		תוכנת עיבוד תמונה http://imagej.nih.gov/ij/ מדעית
NanoCalcFX	תוכנה חינמית	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	תוכנת ניתוח/הערכת נתונים לתחבורה מסיבית
NTA 2.3 תוכנה אנליטית	Nanosight		למעקב אחר ננו-חלקיקים מיקרוסקופ
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		בקרת טמפרטורה תוכנה למיקרוסקופ מעקב אחר ננו-חלקיקים