מאמר שיטה

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

DOI:

10.3791/53379

⸱

31 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2Department of Medicine, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים אסטרטגיית מיון עבור זרעונים של עכברים באמצעות זרימה ציטומטרית. הזרעונים ממוינים לארבע אוכלוסיות טהורות ביותר, כולל עגולות (שלבי זרע 1-9), התארכות מוקדמת (שלבי זרע 10-12), התארכות מאוחרת (שלבי זרע 13-14) וזרעונים מוארכים (שלבי זרע 15-16). צביעת DNA, גודל וגרגיריות משמשים כפרמטרים לבחירה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידול של spermatids העכבר הוא תהליך קריטי אחד לייצור תא מין זכרי פונקציונלי עם הגנום שלם כדי להיות מועבר לדור הבא. עד כה, מחקרים מולקולריים של מעבר מורפולוגיים זה כבר הקשו על ידי חוסר שיטה המאפשרת הפרדה נאותה של צעדים החשובים אלה של בידול spermatid לניתוחים שלאחר מכן. הניסיונות קודמים בgating התקין של תאים אלה באמצעות cytometry זרימה ייתכן שהיו קשים בגלל עלייה מוזרה בקרינת ה- DNA בspermatids עובר שיפוץ הכרומטין. המבוססים על התבוננות זו, אנו מספקים פרטים של זרימה פשוטה cytometry תכנית, המאפשרים טיהור שחזור של ארבע אוכלוסיות של spermatids עכבר קבוע עם אתנול, המייצג כל מדינה אחרת בתהליך שיפוץ הגרעיני. העשרת אוכלוסייה אישרה באמצעות סמני צעד ספציפי וקריטריונים מורפולוגיים. Spermatids המטוהר יכול לשמש להגנומי וproteomIC ניתוחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרעונים עגולים הפלואידים מתמיינים לזרעונים בתהליך הנקרא spermiogenesis. זה כרוך בשלבים רבים ושונים כולל רכישת דגל, שיפוץ כרומטין ושלד ציטו, עיבוי הגרעין וכן אובדן רוב הציטופלזמה. אירועים תאיים ייחודיים אלה חייבים להיות מווסתים היטב על מנת לייצר גמט פונקציונלי בוגר עם גנום שלם המתאים להפריה. בקושי ניתן לחקור את הזרע במבחנה מכיוון שאף מערכת תרבית תאים אמינה לא הצליחה עד כה לתמוך בהתקדמות בשלבים השונים של התהליך. יתר על כן, טכניקות מבחנה בפועל מובילות לתשואה גרועה1,2. in vivo, מעברים נכונים דרך השלבים השונים של הזרע הם חיוניים לשלמות התפקודית הטבעית של הגמט הגברי. טיהור מוצלח של זרעונים על פי שלבי ההתמיינות שלהם מעולם לא הושג ברמת העשרה מספקת כדי לאפשר אפיון מולקולרי של הזרע. לדוגמה, טיהור שלבי המפתח של התמיינות הזרע יהיה שימושי במיוחד לחקר האקרוזום המתפתח, היווצרות האמצע3, דינמיקת צומת התאים4, דינמיקת RNA5, תהליך שיפוץ כרומטין6,7 או יציבות גנומית8. טיהור הזרעונים נפגע על ידי השינוי המורפולוגי המתקדם שלהם, היעדר סמנים ביולוגיים חיצוניים ספציפיים לשלב וצורתם וגודלם הייחודיים.

למרות שרוב תאי הנבט הזכריים מציגים קשר ישיר בין צביעת DNA לפלואידיה (תכולת DNA), שמנו לב שמתאם חיובי כזה אינו ישים עוד לזרעונים. זה נובע מהתצפית המוקדמת שלנו כי קטעי צינוריות זרע מראים עוצמה משתנה של צביעת DNA לאורך שלבי הזרע השונים. למרות שצביעת ה-DNA עולה בקנה אחד עם מערך הכרומוזומים הפלואידים שלהם משלבי הזרע 1 עד 7 (זרעונים עגולים), ראינו עלייה חדה בעוצמת הקרינה עם DAPI או SYTO 16 סביב תחילת הארגון מחדש הגרעיני ועיצוב מחדש של כרומטין (שלב 8 של זרע) שהגיעו לשיא בתחילת העיבוי הגרעיני (שלבי הזרע 11-12). לאחר עיבוי הגרעין, עוצמת צביעת ה-DNA פוחתת עד לזרע (שלב 16 של זרע). שיערנו שזה ככל הנראה קשור להיווצרות המעבר הייחודי שלהם למבנה הכרומטין שבו היסטונים מוחלפים בפרוטמינים. לכן פיתחנו שיטת זרימה ציטומטרית אמינה המאפשרת הפרדת זרעונים באמצעות וריאציה של עוצמת ה-DNA של זרעונים כפרמטר בחירה עיקרי.

מתוארת גישה פשוטה להפרדת זרעי עכבר עם טוהר גבוה (95-100%) על סמך תכולת ה-DNA לכאורה שלהם (צביעת SYTO16), גודל וגרעיניות. הזרעונים מופרדים לארבע אוכלוסיות; שלבים 1-9, 10-12, 13-14 ו-15-16. זרעונים מטוהרים מתאימים לניתוח גנטי/גנומי, כמו גם ליישומים פרוטאומיים כמתואר בפרסום שפורסם לאחרונה מקבוצה9 שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בבעלי חיים היה בהתאם לועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש Université de שרברוק.

1. Tube הכנה

  1. היום לפני מיון תא, להוסיף 1-2 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת (FBS) עד 5 צינורות עגולים תחתון מיליליטר פוליפרופילן, ועד 15 מיליליטר ו -50 מיליליטר צינורות חרוטי פוליפרופילן.
    צעד קריטי: ודא שכל צינור המשמש בפרוטוקול הוא מצופה.
    הערה: ציפוי FBS מונע בתאי נבט מלהידבק לקירות צינור.
  2. לאט לאט לערבב O / N על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למעייל הצינורות אחידות באמצעות הכתף.
  3. למחרת, להסיר FBS מצינורות מצופים באמצעות אחסון.
    1. * צעד קריטי: ודא שצינורות עגולים תחתון פוליפרופילן 5 מיליליטר ו -15 ו -50 מיליליטר הצינורות המשמשים להכנת תא (פרוטוקול הצעדים 2.1-2.11) הם רוקנו לחלוטין של FBS למנוע פנינג (כלומר, סטייה מדויקת של הזרמים בצד). להשתמש pipet P200 להסיר FBS.
      הערה: FBS שיורי בצינורות לפני המיון עלול להוביל לאובדן של תאים או זיהום של צינורות אחרים המשמשים במיון תא,
    2. השאר נפח שייר קטן של FBS (על 100-200 μl) בפוליפרופילן 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון המשמשים לאיסוף תאים מטוהרים.

2. תא הכנה

  1. להקריב עכבר אחד גברים בהרדמה באמצעות O 2 / isoflurane (אינדוקציה 5% ולאחר מכן שמרו על 2%) ואחריו CO 2 מחנק.
  2. בלו וdecapsulate שני האשכים ובררו עם מספריים קטנים ב500 μl מיון חיץ לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  3. תאי נבט סומק מtubules seminiferous ידי pipetting למעלה ולמטה העדין בצינור 1.5 מיליליטר, ראשון עם טיפ μl קטוע 100-1,000, ולאחר מכן עם קצה 100-1,000 μl שלם.
  4. להסיר שאריות וגושים אחרים צעד סינון אחד באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ולאסוף תסנין לתוך קודם צינור חרוטי 50 מיליליטרiously מצופה FBS בשלב 1.
  5. שטוף את המסנן פעם אחת עם המיון עד נפח כולל של 3 מיליליטר ותסנין העברה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המצופה בעבר בשלב 1 חיץ.
  6. להוסיף 16 μl של 50 מ"מ EDTA pH 8 למיליליטר של השעיה תא (48 μl ל3 מיליליטר) כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ"מ EDTA.
  7. כדי לתקן תאי נבט, לאט להוסיף 3 כרכים של אתנול 100% קרים כקרח באמצעות pipet 10 מיליליטר עם תסיסה עדינה (מערבולת במהירות נמוכה), אשר יפיק השעיה חלבית.
    צעד קריטי: הוספת אתנול לאט לאט הוא חיוני וחשוב לשמירה על שלמות תא ההכנה. אנחנו ציינו כי בנוסף מהירים של אתנול גורם תמוגה תא וכתוצאה מכך לירידה גדולה של מיון יעילות. להשעית תא 3 מיליליטר, 9 מיליליטר של אתנול יש להוסיף בכ 1 דק '.
  8. דגירה תאים על קרח למשך 15 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך.
  9. ההשעיה צנטריפוגה התא ב 800 XG במשך 5 דקות ולהסיר ברורsupernatant.
  10. בעדינות resuspend תאי נבט הקבוע ב 2 מיליליטר של חיץ מיון.
  11. הוסף 4 μl של צבע SYTO16 DNA (פתרון 1 מ"מ בDMSO) ודגירה של לפחות 30 דקות (מוגנות מפני אור).
    הערה: תוצאות המיון הטובות ביותר מתקבלות באמצעות SYTO16 שכן הוא צבע DNA חדיר שמשולב בקלות לתוך הגרעינים דחוסים מאוד של spermatids.

סדרן 3. תא הגדרה

הערה: הנה, 4-לייזר (ננומטר 405 - סגולה, 488 ננומטר - הכחול, 561 ננומטר - ננומטר צהוב-ירוק, 633 - אדום) 20-פרמטר סדרן תא BDFACSAria III משמש. תוכנת BD FACSDiva 6.1.3 משמשת כדי לחזות ולנתח את הנתונים. ההגדרות עשויות להשתנות בהתאם לסוג של סדרן בשימוש.

  1. לעקר את סדרן FACS ידי הפעלת 70% אתנול כנוזל נדן במהלך הליך כיבוי fluidics (תפריט "Cytometer" בתוכנה) לפני המיון. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ולבחור "sh fluidicutdown ". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
  2. הכן ולסנן 1x PBS עם מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לחסל את כל גבישים ומזהמים. מלא את מיכל הנדן לקו הריתוך העליון בצד הפנימי של הטנק.
  3. הפעל את התוכנה ולהתחבר. התחל סדרן FACS להתחמם הלייזרים לפחות 30 דקות לפני המיון. להפעיל שני תהליכי הפעלת fluidic כדי לשטוף את אתנול מfluidics. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ובחר "הפעלת fluidic". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
    הערה: זו משחזרת fluidics עם נוזל נדן רגיל (1x PBS).
  4. נקה את בלוק המיון וצלחות סטייה במים מזוקקים ומייבש אותם ביסודיות. Sonicate זרבובית 100 מיקרומטר להציב צינור של מים מזוקקים למשך 2 דקות באמבט sonication. נגב את הזרבובית ביסודיות.
  5. הכנס את זרבובית 100 מיקרומטר לתוך תא הזרימה ולהפוך את כיוון השעון ידית נעילה-חרירים ל -12עמדת שעות. הגדר את לחץ הנדן עד 20 psi.
  6. הפעל את הזרם ולהתאים את המשרעת להשיג ערכי יעד לתדר (כ -30), ירידה של 1 (כ -150) וגאפ (סביב 12) ולהקים דפוס breakoff אגל יציב (טיפות כמה לווין). כבה את הנחתה.
  7. ודא שהזרם ישר ופוגע במרכז aspirator הפסולת על ידי שינוי הזווית של בלוק הסוג. הערה: זרבובית 130 מיקרומטר ב 10 psi גם נבדקה ולא נמצאים הבדל ברור נמצא.
  8. עיכוב הגדר לייזר ל0 ל-77.39 הכחולים, לאדומים, 37.33 לסגולים ו-39.85 ללייזרים צהובים-ירוקים.
  9. אזורי סט קנה מידה ל1.14 ל1.0 הכחול, לאדום, 0.75 לסגול ו0.96 ללייזרים צהובים-ירוקים.
  10. באמצעות מיון מבחן (בחלון "צד הזרם" של התוכנה), לוודא שזרמי הצד אינם מלבים. בחלון "צד הזרם", להתאים את מחווני המתח של כל זרם בצד, כך שהם פגעו בmiddlדואר של צינור איסוף מבחן. אם זרם המרכז הוא לא חזק, להתאים את nd 2, 3 rd, ו -4 הגדרות ירידה ה כדי להגביל את הזרם המרכזי.
  11. התחל התקנת Cytometer ויישום המעקב (CS & T) בתוכנה (תפריט "Cytometer").
  12. השתמש בחרוזי ההתקנה ומעקב cytometer בירידה של 1 לμl 350 כדי להפוך את האפיון והמעקב של ביצועי cytometer באמצעות הוראות יצרן.
  13. צא יישום CS & T. להחיל הגדרת CS & T, לוודא הפרמטרים הזרם עדיין לאפשר דפוס breakoff אגל יציב, ולהפעיל את כפתור ספוט המתוק כמתואר בהוראות יצרן (ב" חלון Breakoff ").
  14. לייעל את הערך זרוק העיכוב באמצעות חרוזי ניאון (ראה טבלה של חומרים).
    1. התקן את צינורות האיסוף בבעל. פתח את הדלת לחסום סוג. בחלון "צד הזרם", להפעיל מתח ולאחר מכן בחר "סוג מבחן "ולחץ על לחצן aspirator המגירה כדי לפתוח את המגירה ויש להם גישה לצינורות האיסוף.
    2. לייעל את זרמי הצד ולכן הם הולכים למרכז של הצינור. התאם ערכים ומחוונים בהתאם לצורך.
    3. סגור את הדלת לחסום סוג ולוודא להתאים את חיוג מיקרומטר להשיג נקודת חרוז הבהירה במרכז. מגירה בטל פסולת, סוג מבחן ומתח. הסר את צינורות האוסף.
    4. לייעל את עיכוב הירידה בהתאם להוראות יצרנים.
      1. בקצרה, לנער בקבוקון חרוז במרץ ולדלל 1 טיפה של חרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS.
      2. שימוש בהוראות יצרנים, להגדיר את עיכוב הירידה באמצעות תבנית ניסוי טיפת העיכוב זמינה בתוכנה. לחלופין, השתמש בתכונת Auto גלילת העיכוב להגדיר את עיכוב הירידה.
      3. טען את השפופרת של חרוזי ניאון ולהתאים את קצב הזרימה עד שיעור הסף הוא ~ 3,000 ל- 4,000 אירועים / שני. הגדר את דיוק סוג ל" ראשוני "ואחרוןly ל" מנגינת פיין "בחלון" פריסת מיין ". בחר את המסנן האופטי ולמיין חרוזים. התאם את העיכוב בגלילה עד ~ 100% מסודרים משמאל.
        הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לוודא שתאים מסוג הריבית לזרם צד. חרוזים והמסנן האופטי המשמשים להשגה קרובה לסטייה טיפת 100%.
  15. הנח ND מסנן FSC 1.5 (צפיפות ניטראלית) בקצה השמאלי של בלוק גלאי FSC. הגדר את הארכת החלון עד 2.00 מייקרו-שני ואת קנה המידה פינת FSC ל1.00 (בכרטיסייה "הלייזר" בחלון "Cytometer").
  16. לפני טעינת צינור מדגם, מקום בשורת מסנן מדגם של 50 מיקרומטר בסוף קו המדגם, כדי למנוע בצעדים כבדים. כדי לעשות זאת, בחר באפשרות "שנה סינון לדוגמא" בתפריט "Cytometer".
  17. בדוק את הרכב נוזל המדגם כדי להשיג הפרדה טובה בלי ללבות בין זרם צד ולמנוע את התאים יידבקו לpolypropyleצינורות ne.
    1. טען את צינור המדגם, להדליק את צלחות הסטייה ובחר "סוג המבחן" עם המגירה סגורה. תראה זרמי צד אם הפרדה מתרחשת בלי יותר מדי פנינג.
      הערה: פנינג הוא כנראה עקב ריכוז גבוה של חלבון במאגר המדגם.
  18. טען את צינור המדגם לתוך מכשיר FACS. בחר תסיסה מדגם של 300 סל"ד וטמפרטורת מדגם של 4 מעלות צלזיוס. בחר "רוכשת את הנתונים" ב" רכישת לוח המחוונים ".
  19. במידת צורך, לדלל את המדגם כדי להשיג קצב אירוע מתאים למקסימום של 5,000 אירועים / שניות (בקצב זרימה מקסימאלי של 3.0). בהחלט מכבד את הגבולות האלה כדי לשמור על טוהר התאים הממוינים.
  20. כדי לנתח ולמיין את התאים, לייעל את ערך סף FSC לחסל פסולת בלי להתערב עם האוכלוסייה של עניין. בסולם לוגריתמים, להתאים את המתח של גלאי צינור צילום מכפיל (PMT) עם מסנן 530/30 על מנת להפוך אתבטוח שאות הקרינה מכלל האוכלוסייה מתאימה בקנה המידה, ושער על האוכלוסייה החיובית (איור 1, שער 1).
  21. לייצר קדימה פיזור-אזור / פיזור-שטח צד (FSC-) עלילה (SSC-) של האוכלוסייה החיובית SYTO16 ולהתאים את FSC-לכ 110 V בקנה המידה ליניארי, וSSC-לכ -150 V בקנה מידת לוגריתמים כדי להמחיש את כל האירועים תוך נטרול תאים מאוד גדולים ואגרגטים תא.
  22. ב" מיין פריסה "החלון, להגדיר את" מיין Precision מצב "ל" טוהר 4-דרך" (מסכת תשואה: 0, מסכה טוהר: 32 מסכה שלב,: 0). בחר באפשרות "רציף" מתפריט "אירועי יעד" למיון רציף.
  23. להוסיף אוכלוסיות למיין בתחום המתאים לצינורות (ב" מיין פריסה "החלון). אוכלוסיות מקום עם תדרים גבוהים יותר באמצע ואלה עם תדרים נמוכים בקצוות. הגדר את צלחות המתח עד 2500 V. במיון, לשמור t אוסף המדגםubes על קרח.

4. מיון תא

  1. מייד לפני המיון, תאי סינון באמצעות מסנן 50 מיקרומטר פוליפרופילן 5 מיליליטר מצופה בעבר סיבוב צינור תחתון.
  2. שטוף את המסנן בהרחבה עם 1-2 מיליליטר של חיץ מיון.
  3. תאי נבט מיין קבועים באמצעות סדרן תא 488 ננומטר מצויד לייזר הבא תכנית gating המפורטת באיור 1. לאסוף את השברים מטוהרים בצינורות עגולים תחתון 5 מיליליטר פוליפרופילן המצופה בעבר בסעיף 1 על קרח.
    1. ודא ש100-200 μl של FBS נשמר בצינורות האיסוף, כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לקיר הצינור.
    2. ודא כי ריכוז SYTO16 הוא להרוות כדי למנוע תנודות הקרינה במהלך תקופת המיון. SYTO16 הוא להרוות כאשר אין וריאציה נוספת של עוצמת מכתים תא ב488 פרמטר (מכתים DNA) אלקסה פלואוריד בגרפיקה המיון. במידת צורך, להוסיף 1 μl שלSYTO16 לצינור המיון להגיע לרוויה.
    3. הצג את האירועים הכולל על גרפי המציג את הפרמטרים הבאים: מספר האירועים לעומת אלקסה פלואוריד 488-A.
    4. בחר את תאי צביעת DNA החיוביים עם שער 1, כפי שמוצג באיור 1.
      1. תאי תצוגה מהשער 1 בגרפי באמצעות SSC-לעומת FSC-כפרמטרים
        1. בחר את התאים עם שער 2, כהראה באיור 1.
        2. תאי תצוגה משער 2 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
        3. בחר תאים עם שער 5 ושער 6 בשער 2 גרפיים, כהראה באיור 1.
        4. להציג בנפרד שער 5 ושער 6 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
        5. spermiogenesis בחר צעדים 1-9 spermatids על גרפי שער 5 וspermiogenesis צעדים 10-12 spermatids על גרפיקת 6 השער, כפי שהראה באיור 1.
      2. לְהַצִיגתאים מהשער 1 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים
        1. בחר תאים עם שער 3 ושער 4, כהראה באיור 1.
        2. להציג בנפרד שער 3 ושער 4 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
        3. spermiogenesis בחר צעדים 13-14 spermatids על גרפי שער 3 וspermiogenesis צעדים 15-16 spermatids על גרפי שער 4, כהראה באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרטגית gating שימוש עם cytometry הזרימה

איור 1 מייצג את אסטרטגית gating המשמשת בcytometry הזרימה למיין ארבע אוכלוסיות spermatid טהורות ביותר. בקצרה, תאים עם מכתים DNA חיובי (אלקסה פלואוריד 488-A) נבחר ראשון עם שער 1. Spermatids מspermiogenesis מרתיע 1-12 נבחרים (שער 2) על מגרש נקודה מראה granulosity (SSC-) לעומת גודל (FSC -A) מהש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי זרע ראשוניים תמיד היו מאתגרים ללמוד בהתחשב במורכבות של אפיתל seminiferous, כמו גם ההצלחה המוגבלת של תרבות במבחנה. במהלך השנים, גישות רבות כדי לטהר תאי נבט ממינים שונים פותחו. טכניקות שקיעה באמצעות טיהור הכבידה עם Percoll או הדרגתיים אלבומין בסרום שור בדרך כלל מספקות תשואה טובה של תאים נבטי שלמים, אבל חוסר הגדרה ראויה בין כמה סוגי תאים כמו תאי tetraploid meiotic וspermatids 10. יתר על כן, טכניקות אלה דורשים מכשירים מיוחדים (לעתים קרובות תוצרת בית), שעשויה לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לד"ר לאוניד וולקוב ואריק Bouchard לייעוץ הטכני שלהם בנוגע למיקרוסקופיה epifluorescence.

תמיכה כלכלית

ממומן על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (מענק # MOP-93,781) לGB

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IsofluraneABBOT05260-05להרדמת עכבר לפני המתת חסד
סרום בקר עובריWisent90150לציפוי צינור
1x PBS
EDTABioShopEDTלהכנת מאגר מיון
HEPESSigmaHלהכנת מאגר מיון
100% אתנולLes alcools de commerce092-09-11Nלקיבוע תאים
SYTO 16Life TechnologiesS7578מכתים DNA
5 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגוליםBD Falcon352063אוסף תאים ממוינים
15 מ"ל צינורות תחתונים חרוטיים מפוליפרופילןPROgene1500
50 מ"ל צינורות תחתונים חרוטיים מפוליפרופילןPROgene5000
וופורייזר הרדמה TEC4Ohmeda1160526להמתת חסד
של עכבר CO2 מיכל גזPraxairC799117902להמתת חסד של עכבר
O2 מיכל גזPraxairO254130501להמתת חסד של
עכבר תא גזלהמתת חסד של עכבר
40 ומיקרו; מסננת תאי פלקוןm Corning Incorporated352340
50 μ m מסנני קו דגימהBD Biosciences649049
מערבל מערבולתLabnet International, inc.S0200לקיבוע תאים
צנטריפוגה דינאקקליי אדמס101
Celltrics 50 ומיקרו; m מסנניםPartec04-004-2327
488 ננומטר מיישן תאים בלייזרBD BiosciencesFACSAria III
Accudop חרוזים פלואורסצנטייםBD Biosciences345249
מאגר מיון: 1x PBS, 1 מ"מ EDTA pH 8.0, 25 מ"מ HEPES pH 7.0, 1% FBSFBS מושבת בחום. הכינו תמיסה טרייה, 0.22 μ מ 'מסונן ושומר על 4 מעלות צלזיוס.
עכבר תוצרת בית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  2. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472(2011).
  3. Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
  4. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
  5. Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
  7. Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
  8. Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
  9. Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
  10. Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
  11. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
  12. Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
  13. Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
  14. van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
  15. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
  16. Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
  17. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  18. Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAAlexa Fluor 488

מאמרים קשורים