מאמר שיטה

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 בדצמבר 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pH פגוזומי משפיע על התבגרות הפגוזומים, ייצור מחמצן, הרג פגוזומי וכן הצגת אנטיגן. כאן אנו מתארים שיטה רציומטרית למדידת שינויי pH במהלך הזמן ובנקודת הקצה בפאגוזומים בודדים בפגוציטים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagocytosis הוא תהליך בסיסי שדרכו תאים חיסוניים מולדים לבלוע חיידקים, תאים אפופטוטיים או חלקיקים זרים אחרים כדי להרוג או לנטרל את חומר בליעה, או להציג אותה כאנטיגנים וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית. PH של phagosomes הוא פרמטר קריטי המסדיר ביקוע או היתוך עם endomembranes והפעלה של אנזימי מפרקי חלבונים, אירועים המאפשרים vacuole phagocytic להתבגר לתוך אברון נגרע. בנוסף, טרנסלוקציה של H + נדרשת לייצור רמות גבוהות של מינים תגובתי חמצן (ROS), שהם חיוניים להרג יעיל ואיתות לרקמות מארח אחרות. פתוגנים תאיים רבים לחתור תחת הרג phagocytic ידי הגבלת החמצת phagosomal, המדגיש את חשיבותו של ה- pH בביולוגיה phagosome. כאן אנו מתארים שיטה למדידת pH ratiometric phagosomal בנויטרופילים באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) -labeled zymosan כטארג phagocyticETS, וLive- תא הדמיה. Assay מבוסס על תכונות הקרינה של FITC, שהוא הרווה ידי pH חומצי כאשר נרגש ב 490 ננומטר, אך לא כאשר נרגש ב 440 ננומטר, המאפשר כימות של יחס pH תלוי, ולא הקרינה מוחלטת, של צבע אחד. פרוטוקול מפורט לביצוע בכיול צבע אתר והמרה של יחס לערכי pH האמיתי הוא גם סיפק. שיטות ratiometric חד צבע נחשבות בדרך כלל עדיפה על אורך גל בודד או פרוטוקולים פסאודו-ratiometric כפול צבע, כפי שהם פחות רגישים להפרעות כגון הלבנה, להתמקד שינויים, וריאציות לייזר, ותיוג אחיד, המעוותים את האות הנמדדת. שיטה זו ניתן לשנות בקלות למדוד pH בסוגי תאי phagocytic אחרים, וzymosan יכול להיות מוחלף על ידי כל חלקיקים המכילים אמין אחרים, מחרוזי אינרטי למיקרואורגניזמים חיים. לבסוף, בשיטה זו ניתן להתאים לעשות שימוש בבדיקות ניאון אחרים רגישות לטווחי pH שונים או phagosom האחרפעילויות אל, מה שהופך את פרוטוקול כללי להדמיה התפקודית של phagosomes.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagocytosis, התהליך שבו תאי חיסון מולדים בולעים חלקיקים גדולים, התפתח ממנגנון האכילה של אורגניזמים חד-תאיים, וכולל קשירה למטרה, עטיפתה בממברנה וצביטה של הממברנה ליצירת ואקואול בתוך הציטוזול הנקרא פגוזום. בעוד שהקרום הפגוזומלי נגזר מקרום הפלזמה, מיון חלבון פעיל ושומנים, כמו גם היתוך עם אנדומברנות במהלך היווצרות הפגוזום, הופכים את הפגוזום לאברון מובהק בתוך התא בעל תכונות השפלה המאפשרות הריגה, נטרול ופירוק של החומר הנבלע1-3. תהליך זה, הנקרא התבגרות פגוזומלית, מסתמך על אספקה של שורה של אנזימים פרוטאוליטיים וקוטלי חיידקים, כולל ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) אוקסידאז המעביר אלקטרונים לפאגוזומים המייצרים את המחמצן החזק O2- ומיני החמצן התגובתי הנגזרת שלו (ROS) 2,4.

ל-pH הלומינלי של פגוזומים יש השפעה עמוקה על מספר אירועים הנדרשים לתפקוד הפגוזומים. ראשית, pH משפיע על סחר באנדומברנות באופן כללי, שכן שינויים קונפורמטיביים תלויי pH של מווסתי סחר טרנסממברני משנים את הגיוס של גורמי סחר כגון Arfs, Rabs וחלבוני מעטפת שלפוחית, אשר בתורם מגדירים אילו שלפוחיות עשויות להתמזג עם פגוזומים 5-8. שנית, ההרכב היוני של הלומן הפגוזומלי משתנה גם עם התבגרות הפאגוזומים, וכמה מובילי יונים, כגון מחליף Na+/H+ או אנטיפורטרים ממשפחת ClC Cl-/H+, המקדמים תפקוד פגוציטי, מסתמכים על טרנסלוקציה H+ 9,10. באופן דומה, ייצור ROS קשור קשר הדוק ל-pH פגוזומלי. ROS ותוצרי הלוואי החמצונים הרעילים שלו הוכרו זה מכבר כחיוניים להרג פגוזומי בנויטרופילים 4,11,12, והוכח כי הם ממלאים תפקידים קריטיים בפגוציטים אחרים כולל מקרופאגים, תאים דנדריטיים (DCs) ואמבה 13-16. ה-NADPH אוקסידאז הוא אנזים אלקטרוגני המשחרר H+ בציטוזול כאשר NADPH נצרך, וזה דורש העברה בו זמנית של H+ דרך תעלות HVCN1 נלוות לצד האלקטרונים המועברים ללומן הפגוזומלי, על מנת להקל על הדפולריזציה המסיבית שאחרת תוביל לעיכוב עצמי של האנזים 17-21. לבסוף, למספר אנזימים מפרקי חלבון יש פעילות אופטימלית ב-pH שונה, כך ששינויים ב-pH פגוזומי תלויי זמן יכולים להשפיע על אילו אנזימים פעילים ומתי. חשיבות ה-pH הפגוזומלי מודגשת על ידי אורגניזמים כמו Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis ו-Salmonella typherium החותרים תחת הרג פגוציטי, לפחות בחלקו, על ידי שינוי ה-pH הפגוזומלי 22-24.

ביונקים הפגוציטים העיקריים הם נויטרופילים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים, ובהתאם לסוג התא, שינויי pH פגוזומיים תלויי זמן יכולים להשתנות מאוד, ונראה שהם ממלאים תפקידים שונים. במקרופאגים, החמצה חזקה ומהירה המתווכת על ידי משאבת הפרוטונים התלויה ב-ATP VATPase (V-ATPase) היא אחד הגורמים המרכזיים המתווכים להרג 25-27, בדומה למנגנונים הקיימים באמבה המשתמשים בפגוציטוזיס כמנגנון אכילה 28. בתאים אלה מאמינים כי הפעלת פרוטאזות חומציות ממלאת תפקיד מפתח. לעומת זאת, הריגת נויטרופילים מסתמכת יותר על ROS כמו גם HOCl המיוצר על ידי מיאלופרוקסידאז (MPO)11, וה-pH נשאר ניטרלי או בסיסי במהלך 30 הדקות הראשונות ומחמיץ רק מאוחר יותר 29,30. הוצע כי pH ניטרלי מעדיף את הפעילות של פרוטאזות חמצון כגון קטפסינים מסוימים. ב-DCs ה-pH הפגוזומי שנוי במחלוקת, כאשר חלקם מדווחים על החמצה ואחרים על pH ניטרלי או אלקליין 31,32, אך ROS ו-pH עשויים להשפיע עמוקות על יכולתם של תאים אלה להציג אנטיגנים לתאי T, אחד מתפקידיהם העיקריים 33.

חשוב לציין, הורמונים, כימוקינים וציטוקינים עשויים לייצר אירועי איתות הגורמים להתבגרות ולשינויים בהתנהגות הפגוציטים, ובתורם להשפיע על pH פגוזומי 34,35. באופן דומה, תרופות, למשל כלורוקווין נגד מלריה, הנחשבת גם לטיפולים אנטי-סרטניים 36, עשויות להשפיע על ה-pH הפגוזומלי ולכן על התוצאות החיסוניות. לפיכך, מגוון ביולוגים של תאים, אימונולוגים, מיקרוביולוגים ומפתחי תרופות עשויים להתעניין במדידת pH פגוזומי כאשר הם מבקשים להבין את המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות של הפרעה גנטית מסוימת, תרכובת ביו-אקטיבית או מיקרואורגניזם על תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות.

כאן אנו מתארים שיטה למדידת pH פגוזומי בנויטרופילים שאפשרה לנו להראות את החשיבות של תעלת HVCN1 בוויסות pH 19 של נויטרופילים. השיטה מבוססת על המאפיין היחסי של פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) שפליטת הקרינה שלו ב-535 ננומטר רגישה ל-pH כאשר היא נרגשת ב-490 ננומטר אך לא 440 ננומטר 37. כאשר צבע זה מחובר כימית למטרה, במקרה זה זימוזן, ניתן לעקוב אחריו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב, שבו תאים מצולמים כשהם פגוציטוז, ושינויי pH פגוזומיים נמדדים בזמן אמת כאשר הפגוזום מתבגר. לאחר מכן נאסף ה-pH בפועל על ידי ביצוע ניסוי כיול שבו תאים שעברו פגוציטוז נחשפים לתמיסות בעלות pH שונה המכילות את היונופורים ניגריצין ומוננסין, המאפשרים שיווי משקל מהיר של ה-pH בתוך פגוזומים עם התמיסה החיצונית. לאחר מכן משווים את ערכי היחס ל-pH הידוע של התמיסות, עקומת כיול נבנית על ידי רגרסיה לא ליניארית והמשוואה המתקבלת משמשת לחישוב ה-pH מערך היחס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: כל המניפולציות של בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות קפדניות של ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'נבה.

1. הכנת יעדי phagocytic

  1. הוסף 20 מ"ג של zymosan המיובש 10 מיליליטר שנאגרו מלוח פוספט סטרילי (PBS). מערבולת וחום באמבט מים רותח למשך 10 דקות. מגניב ו צנטריפוגות XG ב 2000 במשך 5 דקות.
  2. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מיליליטר PBS וsonicate במשך 10 דקות באמבט המים sonicator. העבר את 500 μl לשני צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות.
  3. חזור על לשטוף עם 500 μl PBS. Zymosan מבושל יכול להיות aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  4. לשטוף zymosan פעמיים ב500 μl מוכן טרי 0.1 M Na 2 CO 3, pH 9.3 כאמור לעיל (שלב 1.2).
  5. גלול ב490 μl לאחר השטיפה הסופית. הוסף 10 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​מומס FITC בsulfoxid דימתילדואר (DMSO), מערבולת, מכסה בנייר כסף, ודגירה עם תסיסה במשך 4 שעות ב RT.
  6. כדי להסיר צבע מאוגד, לשטוף כאמור לעיל (שלב 1.2), ראשון עם 0.5 מיליליטר DMSO + 150 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 300 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 450 μl PBS, אז PBS לבד.
  7. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer. הוסף 1 μl של zymosan 500 μl PBS, מערבולת, ולאחר מכן להוסיף 10 μl לקצה תא haemocytometer, שבו הוא פוגש את coverslip הניח על הרשת המרכזית. הר haemocytometer על מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד מטרת 20X.
  8. להתמקד בפינה השמאלית העליונה מכילה 16 ריבועים ולספור את כל חלקיקי zymosan בתחום זה באמצעות דלפק יד נקודות. חזור עם הפינה הימנית התחתונה. חשב את ריכוז zymosan באמצעות המשוואה הבאה: ריכוז Zymosan = רוזן / 2 x 500 x 10 4 zymosan / מיליליטר. zymosan שכותרתו ניתן aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  9. Opsonize Wi zymosan הכותרתth נוגדן אנטי zymosan ארנב ב 1: 100 דילול. מערבולת דגירה עבור שעה 1 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl PBS כאמור לעיל (שלב 1.2).
    הערה: Sonication מומלץ מאוד, במיוחד לאחר opsonization, כzymosan נוטה ליצור גושים שיכולים לעשות ניתוח קשה יותר בהמשך. Opsonization עם 65% חולדה V / V או סרום אדם עשוי לשמש כחלופה.
  10. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer כפי שמתואר בשלבים 1.7-1.8, ולדלל עד 100 x 10 6 מיליליטר / חלקיקים. Opsonization עם גירוי phagocytic אחר, כגון השלמה או לא opsonization, ניתן לבצע לחלופין.

2. חיים מיקרוסקופית וידאו

  1. לבודד נויטרופילים עכבר עיקריים כפי שתואר בפירוט במקום אחר 38.
    1. לחלופין, להשתמש בכל סוג תא phagocytic. שמרו נויטרופילים על קרח ברוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 בתוספת 5% בסרום עגל עוברי (V / V), 200 פניצילין U / streptomycin, בריכוז של 10 x 10 6 תאים / מיליליטר עד מוכן לשימוש. סוגי תאים אחרים יכולים להיות שנזרעו 1-4 ימים לפני.
  2. הוסף 2 x 10 5 (20 μl) של נויטרופילים למרכז צלחת זכוכית תחתונה 35 מ"מ, להפיץ את הירידה על ידי הוספת 50 μl של מדיום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.
  3. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) חימם עד 37 ° C המכיל hydrazide מעכב 4-aminobenzoic MPO הספציפי (4-ABH, 10 מיקרומטר). גם מעכבי MPO שאינם ספציפיים, כגון אזיד הנתרן (5 מ"מ), ניתן להשתמש אך הוצעו לאחרונה להפעיל אפקטים שאינם ספציפיים נוספים על pH 39.
  4. הר הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield מצויד במערכת חימום 37 ° C ואובייקטיביים שמן 40X. דגירה תאים בלי הדמיה במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים וציוד לאזן.
  5. התאם את הגדרות מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונת שידור בהיר שדה [PHAse או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אם קיימים] עם 440 ננומטר או 490 ננומטר עירור ופליטת 535 ננומטר כל 30 שניות.
  6. התאם זמן חשיפה ותדירות רכישה בהתאם למערכת מיקרוסקופ כדי למנוע photobleaching יותר מדי וphototoxicity ובהתאם לשאלות הניסיוניות שהתבקש. בגין רכישת תמונה.
  7. אחרי 2 דקות, להוסיף 10 x 10 6 (50 μl) opsonized FITC-zymosan למרכז הצלחת. התאם יעד: יחסי תא בהתאם לסוג של תָא בַּלעָן ויעד בשימוש.
  8. המשך הדמיה למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להפסיק את רכישת הזמן לשגות ולהתחיל טיימר. הזז את הבמה וללכוד 10 או יותר תמונות בתחומים שונים של נוף לphagosomes אחר התמונה, כל זאת במסגרת 5 דקות.

3. ניסויי כיול והבקרה

  1. הכן את פתרונות כיול pH (מתכונים מתוארים בטבלה 1) לפני היום של ניסוי ולהקפיא בaliquots 10 מיליליטר.להפשיר את פתרונות כיול וחמים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בדוק את ה- pH עם מד pH ולהקליט את ה- pH בפועל של פתרונות.
  2. הר משאבת peristaltic על צלחת תחתית הזכוכית לפני רכישת תמונה ולבצע מיקרוסקופיה וידאו החי כפי שתואר לעיל (סעיף 2).
  3. בתום תקופת הרכישה 30 דקות להפוך את המשאבה בלהסיר את הפתרון בתוך הצלחת, להוסיף 1 מיליליטר של פתרון הכיול הראשון ולעצור את המשאבה.
  4. חכה עד שהאות תתייצב, בדרך כלל 5 דקות. חזור עם כל פתרון כיול.
    1. לבצע כיול לפחות אחת ליום ניסיוני, ולכייל מתחיל עם pH הגבוה ביותר ועובד ברצף לרמה הנמוכה ביותר, כמו גם החל מה- pH הנמוך ביותר ועובד ברצף לקראת הגבוה ביותר.
  5. כביקורת, להוסיף של יודיד propionium diphenyl מעכבי מונואמין NADPH 100 מיקרומטר 100 μl (DPI) בדילול מלא בHBSS לתאים ב900 μl HBSS בצלחת תחתית הזכוכית, ודגירה של 10 דקות.
  6. התחל רכישה ולהוסיף zymosan כאמור לעיל (שלב 2.7). לאחר 15 דקות של phagocytosis, להוסיף 10 μl של 10 מיקרומטר מעכב V-ATPase concanamycin (קונקה) בדילול מלא HBSS ולהמשיך הדמיה ל-15 דקות נוספות.

4. ניתוח

  1. ניתוח של הזמן לשגות סרטים ותמונות phagosome.
    הערה: ההוראות הבאות הן ספציפיות לImageJ. צעד אחר צעד הוראות עשויות להשתנות במידה רבה בהתאם לתוכנה בשימוש, אבל הפונקציות מתוארות בסעיף זה זמינות ברוב תוכנות ניתוח תמונה מקצועיות.
    1. פתח את התמונות עם תוכנת ניתוח תמונה מקצועית. הפחת את הרקע בערוץ 490 על ידי ציור ROI כיכר קטן עם כלי בחירת מצולע מרובעים באזור שבו אין תאים, ולחיצה חיסור התוספים> BG מהחזר על ההשקעה. לאחר מכן להעלות אותו ההחזר על ההשקעה בערוץ 440 בעריכה> בחירת לחיצה> שחזור בחירה וחזור.
    2. הפוך תמונת יחס 32 סיביות של הערוץ 490 מחולק בערוץ 440 על ידי לחיצה על תהליך> מחשבון תמונה ..., בחירת התמונות המתאימות בתפריטים הנפתחים Image1 וImage2, ולאחר מכן בחירה "הפרד" בתפריט הנפתח מבצע , ובדיקה של 32 סיביות (לצוף) תיבת סימון תוצאה.
    3. שנה את הטבלה להסתכל למעלה קידוד הצבע לצבע-קידוד יחס תואם על ידי לחיצה שולחנות תמונה> בדיקה> קשת RGB. סף את תמונת היחס לחסל 0 ואינסוף פיקסלים על ידי לחיצה תמונה> התאם> סף .... התאם את פסי הגלילה כך zymosan שמופיע באדום ולחץ על החל, ולוודא פיקסלים רקע הסט לתיבת סימון נאן הוא נבחר.
    4. לשלב ערימת יחס זה עם הערוץ הבהיר שדה למרוכבים רב-ערוצים על ידי לחיצה תמונה> צבע> מיזוג ערוצים, ובחירת התמונה הבהיר השדה בתפריט הנפתח ערוץ האפור ותמונת היחס בתפריט הנפתח הערוץ הירוק, ו בחירהשמור את תמונות מקור תיבת סימון. סרוק את הזמן לשגות סרטים או תמונות כדי לקבוע אילו phagosomes הן להיות מנותח. הערוץ בהיר השדה הוא שימושי עבור זה.
    5. לצייר אזורים של העניין (ROI) באמצעות כלי בחירת מצולע הסגלגלים סביב phagosomes, ולהוסיף אותם למנהל את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה לנתח> כלים> מנהל ROI> להוסיף. למדוד יחס עוצמת zymosan על ידי לחיצה נוסף> Multi-מדוד ודה-בחירת השורה אחת לכל תיבת סימון פרוסה.
    6. לזמן לשגות סרטים, מסלול phagosomes אחד בכל פעם על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה, הקלדת Ctrl + M כדי למדוד כל נקודת זמן, ונע ההחזר על ההשקעה בעת צורך לעקוב אחר ערכי עוצמה לאורך זמן. העתק את המדידות מחלון התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
      הערה: ניתוח של 15 (5 קורסי זמן לניסוי x 3) ניסויים בלתי תלויים היא אידיאלית, אבל פחות או יותר עשוי להידרש בהתאם להשתנות נצפתה. שמירת ROIs תמיד מומלץ. כמה חבילות תוכנה מאפשרות Regi תמונהstration ועדכון דינמי של ROIs, להקל בחלק זה של הניתוח.
  2. המרה מקרינה לערכי pH
    1. מדוד את היחס 490/440 לphagosomes בזמן לשגות סרטי הכיול, כמתואר בסעיף 4.1.
    2. בגיליון אלקטרוני, להתוות ערכי היחס לאורך זמן, ולחשב את ערכי יחס הממוצע מכל phagosomes בתוך שדה הראייה (בדרך כלל, בין 5-20) מ -5 נקודות זמן בתוך אמצע תקופת הזמן המתאים לכל כיול pH פִּתָרוֹן. (ראה גם את התיבות האדומות באיור 5 א.)
    3. עלילה ערכים אלה ממוצע 490/440 יחס נגד pH נמדד בפועל. לשלב לפחות 3 כיולים עצמאיים לגרף אחד. השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית או מספרית לבצע רגרסיה ליניארית (עקומה בכושר הטובה ביותר), בדרך כלל למשוואת sigmoidal.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה השתמשה הייתה sigmoidal ולצמן [Y = + תחתון ((למעלה-למטה)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], שבו ערכי Y הם 490/440 יחסים, X הם ערכי pH ולמעלה, למטה, פרמטרים V50 ומדרון מחושבים על ידי התוכנה.
    4. השתמש במשוואה שהתקבלה להפוך ערכי יחס לpH.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה שהתקבלה עבור עקומת הכיול בנוכחות אזיד הנתרן היא 490/440 יחס = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . פתרון לpH נותן את המשוואה הבאה: pH = 6.993-.9291 * [LN ((1.178 / (יחס-1.103)) - 1))].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הם הבאים תוצאות נציג לניסוי שבו ה- pH phagosomal של נויטרופילים עכבר העיקריים מבודדים ממח העצם של פרא-סוג או Hvcn1 - / - עכברים הושוו. לניסוי מוצלח, חשוב להשיג מספיק phagosomes בתוך שדה הראייה בכל משך סרט הזמן לשגות, תוך הימנעות phagosomes רב מדי, שמאוחר יותר יהיה קשה יותר למגזר במהלך ניתוח התמונה. איור 1 מציג דוגמאות של confluencies הטוב והרע. לתלוי זמן ותמונת הניתוחים, חלקיקי zymosan חיצוניים יש להבחין בין phagosomes ונכללים בניתוח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות זמן רב יותר מאשר שיטות חלופיות, כגון ספקטרוסקופיה וFACS, אשר מעסיקות אסטרטגיה דומה של שימוש בצבע רגיש pH מצמידים את המטרות אבל למדוד את ה- pH הממוצע של אוכלוסיית phagosomes, מיקרוסקופיה מציעה מספר יתרונות. הראשון הוא שפנימי וחיצוני קשורים, אבל לא הפנים, חלקיקים יכולים בקלות להיות מכובדים מבלי להוסיף כימיקלים אחרים, כגון כחול או נוגדני trypan, כדי להרוות או תווית חלקיקים חיצוניים, בהתאמה. שני הוא שלאחר התאים בזמן אמת מאפשר לחוקרים לבחון היבטים שונים של תהליך phagocytic בו זמנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים נתמכים כספית על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע באמצעות מענק תפעולי מס' 31003A-149566 (ל-N.D.), וקרן הצדקה של סר ג'ולס ת'ורן בחו"ל באמצעות סובסידיה לחוקרים צעירים (ל-P.N).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת Zymosan ASigma-AldrichZ4250קיימים ספקים שונים
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250קיימים ספקים שונים
נוגדנים אנטי-זימוזניים (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 הוא מוצר שווה ערך. לחלופין, 25% סרום יכול לשמש כמגיב אופסוניזציה.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)Santa Cruzsc-204107רעיל, השתמש בכפפות, קיימים ספקים שונים
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)Sigma-AldrichD2926רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים
Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים
ניגריציןסיגמא-אולדריץ'N7143רעיל, השתמש בכפפות, קיימים ספקים שונים
MonensinEnzoALX-380-026-G001רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים
מלח חוצץ פוספט (PBS)Life Technologies14200-075רעיל, השתמש בכפפות, ספקים שונים קיימים
תמיסת מלח איזון של האנקLife Technologies14025092תמיסת המלח המאוזנת של רינגר או חוצצים פיזיולוגיים ברורים אחרים עשויים להיות מוחלף.
נתרן פחמתי (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795קיימים ספקים שונים
2-(N-Morpholino)חומצה אתנסולפונית (MES)Sigma-AldrichM3671 קיימים ספקים שונים
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (HEPES)סיגמא-אולדריץ'H3375קיימים ספקים שונים
N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG)סיגמא-אולדריץ'M2004 קיימים ספקים שונים
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית (EGTA)סיגמא-אולדריץ'3777קיימים ספקים שונים
טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן (טריס)סיגמא-אולדריץ'T1503 קיימים ספקים שונים
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP9333קיימים ספקים שונים
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653קיימים ספקים שונים
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM8266קיימים ספקים שונים
אתנול מוחלט (EtOH)Sigma-Aldrich2860קיימים
ספקים שוניםצלחות פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית (פלואורודיש)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ-clear כלים או כיסויים עם תאי הדמיה מתאימים ניתן לתלות
אמבט מים סוניקטיO. Kleiner AGניתן להשתמש בסוניקטור במקום, קיימים ספקי מכשירים שונים
HeamocytometerMarienfeld GmbHקיימים
ספקי מכשירים שוניםמיקרוסקופ הדמיה חי WidefieldCarl Zeiss AGקיימים ספקי מכשירים שונים, אך המיקרוסקופ חייב להיות מסוגל לצלם עירור/פליטה 440/535 ו-490/535 מכבדים. ניתן להחליף הגדרות קונפוקליות של דיסק מסתובב עם יכולות שדה בהיר, אך זימוזאן נוטה לצאת מהמיקוד לעתים קרובות יותר.  
משאבה פריסטלטית (Dynamax RP-1)Raininקיימים ספקי מכשירים שונים
מד pHSchott Gerate GmbHקיימים ספקי מכשירים שונים מונה
ידניMilian SAקיימים ספקי מכשירים שונים
מי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FITCpHRatio ImagingROS

מאמרים קשורים