שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב. ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I. פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
האופי הפולשני של קווי תאים סרטניים נחשב כמתאם עם הפוטנציאל הגרורתי שלהם. עם זאת, רוב הבדיקות המסורתיות אינן בוחנות את התכונות הפולשניות הללו בסביבה תלת מימדית והנתונים המתקבלים סובלים מיישום ביולוגי מופחת. כאן מוצגת גישה להמחשת היכולת הפולשנית של קווי תאים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. בדיקת פלישת הספרואידים של תאי הסרטן משתמשת תחילה בכוח הכבידה כדי ליצור ספרואידים בתוך טיפות מדיה התלויות מהמכסה של צלחת תרבית תאים. לאחר מכן, ספרואידים אלה משובצים במטריצה תלת מימדית המורכבת מתערובת של חומרי ממברנת מרתף וקולגן מסוג I. לאחר מכן מנוטרת הוצאת תאי סרטן מהספרואידים למטריצה שמסביב לאורך זמן. ניתן לשנות את השיטה המתוארת כאן כדי לבחון פלישה לאחר קוקולטורציה של סוגי תאים שונים, הכללת תרופות/מעכבים, או שינויים במרכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM).
מבוא
הוא קבע כי תנועתיות של תאים הסרטניים היא חזויה של פוטנציאל גרורתי, בהתחשב בעובדה שהתנהגות כזו מאפשרת פלישה דרך הקרום במרתף והכניסה למערכת דם 1. רוב המחקר על תנועתיות התמקד בדרך בה התאים מתנהגים בסביבה דו-ממדית (2D), אם כי זה הופך להיות מוכר באופן נרחב שהתנועה של תאים במטריצה תלת-ממדי (3D) הוא נציג נוסף של איך אותם תאים יהיו ממש להתנהג בvivo 2. מערכות תרבות 3D משמשות יותר ויותר ללמוד התנהגויות סלולריות הנעות בין מורפולוגיה תא, לקינטיקה צמיחה ורגישות לסמים 3. הרצון לפקח על פלישת תאים סרטנית בהקשר של סביבת 3D הוביל לסינתזה של טכניקות הוקמו בעבר מעורב הדור של אגרגטים 3D תא (spheroids) באמצעות שיטת הטיפה התלויה תרבות 4, ואחרי הטבעת spheroids אלה לתאיים 3D מטריקס (ECM) מורכב מחומרי קולגן וקרום במרתף 5. שיטה זו נועדה לשפר את ביצועי טכניקות הוקמו בעבר אלה על ידי מתן גישה יעילה שיכול להיות מנוצלת בקלות להשוות פלישה תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי.
דרכים מסורתיות יותר להעריך תנועתיות תא במבחנה הן assay-פצע השריטה וassay transwell 6. Assay לשעבר מתאר תנועתיות תא בהגדרת 2D, ולכן אינו תלוי של מגוון רחב של תכונות קריטיות לפלישת in vivo, למשל פעילות פרוטאז 7. Assay transwell יכול פלישת תא מודל טוב יותר כאשר מוסיף גם הם מצופים עם מצעי ECM אבל, רק פרמטר אחד, כלומר את המראה של תאים על פני השטח הקרום ההפוך נמדד, וניואנסים רבים של פלישת תא לכן אינם ניתנים לצפייה בקלות. בניגוד לשיטות אלה, assay פלישת אליפטית תאים הסרטניים (איור 1 </ Strong>) מאפשר לניטור בזמן אמת של פלישת תא בהגדרה שהיא לא רק מבחינה פיזיולוגית רלוונטי, אלא גם מאפשר תכונות חשובות תא קו ספציפי להיות דמיינו, כגון תא בודד מול קולקטיבי הגירה 8. שיטה זו גם מאפשרת יתרונות על פני מבחני צמיחת תרבות 3D סטנדרטיים. הדור של אגרגטים סלולריים באמצעות שיטת הטיפה התלויה בתחילה מגביל תנועת תא, כך שתאים יהיו תמריצים לפלוש לאחר אילוץ זה יוסר. יתר על כן, ברגע שהאילוץ שהרים, היציאה תא תמשיך בכיוון אחיד, כי אז יכול להיות ונרשמת בנוחות.
חומרי ECM הפופולריים ביותר המשמשים למבחני spheroids תא סרטני הם Matrigel וסוג אני קולגן, שבו כל אחד ממרכיבים אלה יש תפקידים חשובים ומובהק בהשפעה על התנהגות גרורתי. Matrigel הוא תערובת של חלבונים מופרשים מיוצרים על ידי תאי סרקומה Engelbreth-הולם נחיל עכבר, והוא מועשר בbasemeחלבוני קרום NT כגון laminin, entactin, וקולגן IV סוג 9. מסיבה זו Matrigel נקרא מעתה ואילך ל" חומרי קרום במרתף. "חומרי קרום במרתף אלה מספקים ligands החיוני נחוץ לintegrin הידבקות במהלך פלישת תאים סרטני 10 בנוסף לחלבונים רבים אחרים שמפעילים מגוון רחב של השפעות על התנהגות תא 11. לשם השוואה, הסוג אני קולגן, מוכן בדרך כלל ממעכלים חומצה של גידים ומבני collagenous צפופים אחרים 12, הוא חומר מטריצה הרבה יותר פשוט, המשמש כמרכיב מבני עיקרי של רקמות חיבור רקמות וסטרומה תמיכה ואיברי הגוף. הוכח שהמאפיינים הפיזיים של קולגן יכולים לווסת מספר התכונות של תנועתיות תא; לדוגמא, את היישור של סיבי קולגן בממשק הגידול-סטרומה מאפשר לתאי סרטן להגר לאחר מכן לאורך סיבים שבהם פולשים לתוך סטרומה 13. בassay שהוצג כאן, שניהם הסוג אני קולגן וחומרי קרום במרתף משמשים ככלים ללמוד אינטראקציות התא-סטרומה סרטן 3D.
ההשפעה של עיכוב או גירוי של מסלולים השולטים פלישה ניתן לנטר אחרי התאים כבר מוטבעים במטריצת 3D. ניתן pretreated תאים במהלך צמיחה בטיפי התלייה או על העברה לתרבות 3D, תלוי אם יידרש טיפול ממושך לווסת פלישה. לטיפולים קצרים יותר, מומלץ כי התרופה להיות מעורבבת עם ההשעיה אליפטית לאחר איסוף, כמו גם התקשורת שמקיפה את תרבויות 3D, כדי להקל על חשיפה לסמים נאותה לתאים. לאחר מכן, ניתן ונכללו תאי סטרומה רגילים או גידולים הקשורים עם חומר המטריצה להעריך את תפקידם בויסות פלישת תאים סרטניים, או כדי לקבוע כיצד השפעות איתות התנהגות תא אוטוקריני וautocrine. רעיון זה הוצג במחקר שבו coculture של colעל סרטן ותאי האנדותל בטיפות תלויות הוביל לרשת כלי דם בתוך spheroids 14. לבסוף, ניתן גם לשנות את מרכיבי ECM, כמו הפלישה של תאי הסרטן מושפעת מצעים שונים 15. כך השיטה המובאת להלן תספק מסגרת להערכת פלישת תאים סרטניים תחת מגוון רחב של תנאים. באופן כללי נמצא כי לא כל שורות התאים ייצרו spheroids בטיפין התלויות ושורות תאי אפיתל מראה בדרך כלל יוצרות כדורים רגילים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דור של Spheroids
- הכן השעיה תא בודד לתליית תרבויות ירידה בניתוק תרביות תאי הסרטן חסיד של ~ מפגש 70% באמצעות PBS לשטוף אחרי חשיפה ל0.05% פתרון טריפסין- EDTA.
- לנטרל את פתרון טריפסין עם תקשורת ותרבות תא ולספור את התאים באמצעות aliquot של ההשעיה התא. הערה: תקשורת תרבות תא הספציפית יהיה תלויה בשורת התאים נבדקות. עקוב המלצות תקשורת ATCC, שבו התקשורת ותרבות תא היא בדרך כלל DMEM + 10% FBS. ניתן למצוא מידע נוסף בלוח חומרים.
- לבצע דילול כדי לאפשר לזריעה של 500-1,000 תאים לכל 20 ירידת μl של תקשורת בתרבות התא.
- לרכוש צלחת 10 סנטימטרים ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS סטרילי לתחתית. הערה: שלב זה מגן על תליית טיפות מאידוי. עלות נמוכה יותר מנות "בקטריולוגית כיתה" ניתן להשתמש במקום של מנות כיתה תרבית תאים, תאים לא יהיו המשךלפעול משטח התרבות.
- השתמש pipet רב ערוצית להעביר 20 טיפות μl של ההשעיה התא המדולל למשטח הפנימי של המכסה.
- Pipet 40 טיפות (5 שורות של טיפות 8) על המכסה של צלחת 10 סנטימטר.
- הפוך את המכסה ומניחים על גבי צלחת התרבות. דגירה תרבויות ירידה התלויה על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות כדי ליצור spheroids.
- הפוך את המכסה באופן בטוח, עדיין בשליטה. הערה: היפוך המכסה מהר מדי או איטי מדי עלולה לגרום לטיפין להעביר. שורות תאים מסוימות עשויות ליצור spheroids ב 48 שעות או פחות, בעוד שאחרים עשויים לדרוש יותר מ -72 שעות כדי לייצר אגרגטים קומפקטיים.
2. הטבעה של Spheroids לתוך 3D מטריקס
- להפשיר aliquot של חומרי קרום צמיחה מופחת גורם מרתף על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הטבעת spheroids.
- אופציונלית: בארות שכבה עם ECM מראש כדי למנוע אינטראקציה אליפטית פוטנציאלית עם cultu הרקמהמחדש על פני שטח.
- 200 μl Pipet של ECM לכל גם בצלחת 24 גם.
- הטה את הצלחת על מנת להבטיח שECM מכסה את פני השטח היטב כולו.
- מוציא בזהירות ECM העודף עם pipet.
- דגירה את הצלחת עד הבארות יבשות: 3 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- אופציונלית: בארות שכבה עם ECM מראש כדי למנוע אינטראקציה אליפטית פוטנציאלית עם cultu הרקמהמחדש על פני שטח.
- לאסוף את spheroids על ידי הטיית המכסה של צלחת תרבית רקמה ואיגום התקשורת. העבר את התקשורת עם spheroids לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
- לאפשר 10 דקות לspheroids להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Spheroids צריך להיות גלוי לפי העין.
- שילוב של חומרי קרום במרתף 100 μl עם של (4 ° C) הקר 100 μl להקליד אני קולגן בצינור מראש צונן נפרד. שמור את התערובת על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע או ג'ל לחיזוק בטרם עת.
- השתמש בעצות pipet מראש צונן אם העברת נפחים קטנים.
- לתת טיפול כאשרערבוב סוג חומרי קרום במרתף וקולגן אני למנוע היווצרות בועת אוויר. הערה: בועות אוויר עלולות לעכב הדמיה מאוחר יותר בפרוטוקול אם הם השתרשו בג'ל.
- לשאוב spheroids מהחלק התחתון 40 μl של צינור microcentrifuge, ולשלב עם חומרי קרום במרתף / הסוג אני קולגן תערובת. להיות זהיר כדי למנוע היווצרות בועת אוויר כאשר ערבוב. הערה: התמיסה המכילה חומרי קרום במרתף 100 μl, 100 סוג קולגן μl אני, ו -40 μl של spheroids ניצור מספיק חומר ל4 תרבויות 3D עצמאיות. זה יכול להיות מדורגים למעלה או למטה.
- Pipet 40 טיפות μl של התערובת צמיגה למרכזים של בארות בצלחת 24 גם. לשמור על רמת הצלחת כדי למנוע את התערובת מפועל לצד השני של הבאר. הערה: עמודה אחת על הצלחת 24 גם - 4 בארות - מומלצת לכל מצב להיבדק.
- מניחים את הצלחת intחממת OA 37 ° C ולהשאיר ללא הפרעה במשך 30 דקות. תרבות 3D תהיה פלמר בתקופה זו.
- לאט להטביע את תרבויות 3D ב 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא.
- ודא שהמדיה היא חמה בעת הוספתו לבארות לקדם פילמור ג'ל נוסף.
- שלב קריטי: בעדינות להוסיף מדיה לתרבויות 3D. Pipetting התקשורת מהר מדי לתוך הבארות יכול להוביל לניתוק של תרבויות 3D ממשטח תרבית רקמה.
3. ניטור וניתוח ספרואיד פלישה
- פלישת תמונה מspheroids לתוך מטריצת 3D מקיפה בנקודתי הזמן החליטו על ידי החוקר. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם העדשה האובייקטיבית 20x. הערה: נקודות זמן אידיאלית תהיה שונות בהתאם לקו התא נבדק. שורות תאים יותר פולשנית תתחיל יציאתם מspheroids זמן קצר לאחר ציפוי, ולכן, לקחת תמונה ראשוניתים בתוך כמה שעות לאחר ציפוי. בדרך כלל, תצלומים שצולמו בשעה 0 (לאחר ציפוי), 24 שעות, 48 שעות ו. פלישה בדרך כלל מסכמת 24 עד 48 שעות לאחר ציפוי.
- לכמת יכולת פולשנית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כמו התמונה ג '
- לנתח פלישה כמרחק תא מקצה אליפטית.
- השתמש בכלי לצייר ישר לסמן את הרדיוס ו / או מרחק מקסימאלי פולשנית.
- לחץ על "נתח" בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על "מדוד" כדי להציג את מדידת האורך.
- לנתח פלישה כאזור פולשנית הכולל מחוץ לאליפטית.
- השתמש בכלי ציור Freehand להתחקות הגבול של אליפטית ו / או האזור פולשנית כולל.
- לחץ על "נתח" בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על "מדוד" כדי להציג את מדידת השטח.
- השתמש בתוסף כמו כלים מנהל ROI ליצור מדידות לערימה של תמונות.
- לנתח פלישה כמרחק תא מקצה אליפטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות assay פלישת אליפטית (איור 1), בהרכב של שורות תאי סרטן נבדק ליכולת שלהם ליצור spheroids, כמו גם לסכום של יציאה תא הציג לאחר השתלה במטריצת 3D המורכב מחומרי מרתף קרום והסוג אני קולגן (טבלה 1). תוצאות אלו מראות כי לא שורת תאי סרטן בכל תיצור spheroids הבנוי היטב, שבו שורות תאים בעלי מורפולוגיה אפיתל במבחנה נטו לייצר אגרגטים רגילים וחלק. היכולת של שורות תאים שונות לפלוש בassay הייתה גם משתנה. שורות תאים שהוקמו כפולשנית כמו 4T1, E0771, ו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה העריך את הביצועים של פנל של שורות תאי הסרטן בassay אליפטית פלישה (טבלה 1). בדרך כלל, אנו מוצאים כי היווצרות אליפטית מוגברת בשורות התאים יותר למראה אפיתל, שבו נוכחותו של צמתים תאי תאים מקדמת את הקמתה של ארכיטקטורה כמו-אליפטית. קווים ידועים תא שעברו מעבר אפיתל- mesenchymal, כמו מד"א MB-231 תאים לא יוצרים spheroids בתרבות הירידה התלויה ככל הנראה בשל הביטוי האלקטרוני, N-, ו- P-cadherin המופחת שלהם 16.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
נתמך על ידי CA051008 P30 מענקי NIH וT32 CA009686 (ATR).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| גורם גדילה Matrigel מופחת | קורנינג | CB-40234 | |
| קולגן סוג I, זנב חולדה, 100 מ"ג | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 בינוני | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| סרום בקר עוברי, | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 מ"מ כלים מטופלים | TC קורנינג משולב | 430167 | |
| 24 בארות צלחות מטופלות TC | NEST ביוטכניקה | 702001 | |
| אולימפוס IX-71 קווי תאים של מיקרוסקופ | |||
| נשמרו ב-DMEM + 10% FBS, עם ציפייה לתאי BT-474 ו-LNCaP, שהיו מוכנים ב-RPMI + 10% FBS. |
מקורות
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
