Method Article

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

DOI:

10.3791/53415

⸱

January 5th, 2016

1Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies, UCL Institute of Neurology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של אלפא-סינוקלאין (α-syn) שהופך ליותר ויותר בלתי מסיס/מצטבר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות ניצול חוצצים עם חוזק חומר ניקוי הולך וגובר וטכניקות אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה, ניתן לבחון את המאפיינים המשתנים של צבירת α-syn ברקמות חולה ולא חולות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלפא-סינוקלאין חלבון (α-syn) בא לידי הביטוי בשפע בעיקר בתאי עצב, וקיים במספר צורות שונות - מונומרים, tetramers, oligomers וסיבים. במהלך מחלה, α-syn עובר שינויי קונפורמציה כדי ליצור oligomers ואגרגטים משקל מולקולריים גבוהים שנוטים לעשות החלבון מסיס יותר. באופן חריג α-syn מצטבר היא תכונת נוירו של מחלת פרקינסון (PD), דמנציה עם הגופיפים לואי (DLB) וניוון מרובה מערכת (MSA). אפיון וניתוח של מאגרים באמצעות-כנסת, α מסיסים עם כוח חומר ניקוי הגדלת וultracentrifugation במהירות גבוהה ביוכימיים מספק כלי רב עוצמה כדי לקבוע את הפיתוח של פתולוגיה α-syn קשור עם התקדמות מחלה. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של α-syn מסיס יותר ויותר / מצטבר מרקמת המוח אנושית פוסט-מורטם. מתודולוגיה זו ניתן להתאים עם שינויים ללימודים של α הנורמלי ולא נורמליהביולוגיה -syn במודלים של בעלי חיים מהונדסים מחסה מוטציות-כנסת, α שונים, כמו גם במחלות ניווניות אחרות שכוללות פיקדונות סיביים חריגים של חלבונים הקשורים למחלות שלהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד המאפיינים פתולוגיים המפתח הנפוץ בקרב כמה מחלות ניווניות היא ההיווצרות של אגרגטים חלבון חריגים שמתרחשת בחלבון / מחלה אופן ספציפי 1. לפיכך, יש לוחות האופייניים extraneuronal עמילואיד-ביתא ופיקדונות טאו hyperphosphorylated מצטברים בתוך תאי עצב במחלת אלצהיימר (AD); פיקדונות α-syn מצטברים בגופיפים לואי (LBS) אשר תכלילים intraneuronal, וגם בתוך התהליכים dystrophic עצבי נקראים neurites לוי (LNs) בPD, שיטיון PD ודמנציה עם הגופיפים לואי (DLBs) 2-4. פיקדונות α-syn נורמליים נראים גם בנגעי סימן היכר של תכלילים cytoplasmic גליה בMSA 5. במחלת הנטינגטון, יש פיקדונות פולי-Q האופייניים, ולא נורמלי טאר DNA מחייב חלבון-43 והתמזגו בחלבוני סרקומה (FUS) מופקד בdementias פרונטוטמפורל. חשוב לציין לPD, מוטציות גנטיות α-syn נמצאו Cauאוטוזומלית דומיננטי se PD 6-11. בנוסף, triplication α-syn הגן 12 ושכפול 13 גם גורם PD המשפחתי ובכך מקשרים ביטוי α-syn עלה ל pathomechanisms של PD. יש לציין, מקרי פ"ד שני סדירים ומשפחתיים נמל פיקדונות חריגים של פתולוגיה α-syn 14. טיפולים זמינים נוכחיים לPD הם רק פליאטיבי ואין להם השפעה על עצירה או עיכוב התקדמות מחלה בלתי נמנעת.

α-syn מתבטא בשפע במוח האנושי ומהווה כ 1% מכלל החלבון במוח. הוא קיים באופן ספציפי יותר בתוך תאי העצב אבל יכול להתקיים אם כי בכמויות נמוכות יותר בתוך תאי גליה. נקודת מחלוקת היא מבנה יליד α-syn אשר יכול להתקיים כמונומר אקראי 15 או כtetramer מקופל 16. במהלך מחלה, α-syn משנה קונפורמציה שמאפשרת לה לקבל misfolded והוא חשב שתהליך זה להיות הגורם למחלה pathogeNesis. למרות כמה שנים של חקירות היבטי pathophysiological של α-syn ומחלה, הגורמים למנגנוני מחלה המדויקים נותרו חמקמקים 14.

מחקרים באמצעות ניתוח שלאחר המוות של מוח פרקינסון עד כה סיפקו רמזים חשובים לגבי ביולוגיה רגילה ונורמלית של α-syn הן בPD סדיר וגם PD הקשורים מוטציות בגן LRRK2 17-22. כאן, פרוטוקול חילוץ ביוכימי (ראה תכנית מוצגת באיור 1) לפיקדונות α-syn מסיסים יותר ויותר מרקמת מוח PD שלאחר מות אדם שנמל אגרגטים α-syn בדרגות שונות תואר. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאמת עם שינויים בהרכבים חיץ ללמוד חלבונים מצטברים ממחלות ניווניות אחרות 23,24 וגם מרקמת המוח בבעלי חיים מהונדסים 25-27. השיקול העיקרי לעיבודים הם ההבדלים בsolubility והסכומים הכולל של החלבונים המתאימים שחלקם הם בעיקר גרעיניים וייתכן שיצטרך מאגרים גבוה מלח למיצוי אופטימלי כפי שמוצג לFUS 28.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת המוח לאחר המוות נתרמה לבנק מוח כיכר מלכה להפרעות נוירולוגיות, אוניברסיטת קולג 'בלונדון, המכון לנוירולוגיה תוך שימוש בפרוטוקולים ואושרו אתי מאוחסן למחקר במסגרת רישיון שהונפק על ידי רשות הרקמה האנושית (פח"ע) בריטניה (לא. 12,198). ראה רשימה של מקרים המשמשים לפרוטוקול זה (טבלה 1).

1. הכנת חוצצים

  1. הכן חיץ 1X TBS (נאגר מלוח-טריס):
    1. הכן 10X TBS כפתרון מניות עם 500 מ"מ טריס-HCl pH 7.4 ו1,500 מ"מ NaCl.
      1. שוקל 60.5 מתוך גרם טריס-Cl pH 7.6 ו87.6 גרם של NaCl ב800 מיליליטר של מים טוהר גבוהים. התאם את ה- pH עם 1 M HCl ולהפוך סופי מניית נפח 1 ל '
    2. הכן את הריכוז הסופי של TBS 1X על ידי דילול המניה 10 פעמים במים מזוקקים.
    3. מעכבי פרוטאז להוסיף (PI), (לוח 1 לכל 50 מיליליטר חיץ) וטבליות מעכב phosphatase Phos הפסקה (1 לוח לכל 10 מיליליטר של חיץ) ללבטל את ההשפעות של פעולות אנזימטיות הלא ספציפיות של פרוטאזות וphosphatases.
      הערה: כאן השתמשנו אנזים מעכב טבליות מרוש אבל מעכבים זמינים מסחרי אחרים באותה מידה ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן.
  2. הכן חיץ TBS-SDS ידי הוספת 5% w / v נתרן סולפט dodecyl (SDS) ל1X TBS (pH 7.4) חיץ. מחממים את הפתרון עד 60 ° C עם ערבוב מתמיד באמצעות stirrer מגנטי לsolubilize SDS.
  3. הכן חיץ TBS-SDS-אוריאה על ידי הוספת אוריאה לריכוז סופי של 8 מ 'w / v לחיץ 1X TBS-SDS (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד 60 ° C עם ערבוב מתמיד על בוחש מגנטי לפזר אוריאה.

2. Homogenization הדוגמה ודיפרנציאל ultracentrifugation

הערה: החלק מהעבודה הבא כרוך טיפול ברקמת המוח אנושי על פי הכללים של HTA בריטניה. נהלי הפעלה סטנדרטיים המקומיים אחריו בכל tiMES. דגימות מוח הם גזורים מלוקים קפואים מוח וחומר רקמה הומוגני בmicrocabinet נשמר בלחץ שלילי. כפפות חלוקים חד פעמיים, מסיכות פנים, מגינים על נעליים ומשקפי בטיחות שחוקות לאורך כל ההליך. פסולת רקמה אנושית היא מושלכת לאחר המעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לסילוק בטוח. חדים (להבי אזמל) מתבצעים במכל חדים מתאים לבלימה וסילוק בטוח.

  1. קח נתח של רקמה אנושית קפוא (כ 0.5 גרם במשקל מאזור הגרעינים הבזליים) ומהירות ברר לרסיסים קטנים (כ 1 מ"מ 2) על קרח באמצעות צלחת פטרי קטנה ולהב אזמל סטרילי. השתמש בצלחת פטרי, נפרדת ולהב סכין מנתחים עבור כל דגימה. אסוף את הרקמות טחונות בצינור 15 מיליליטר ולהוסיף 10 כרכים של חיץ 1XTBS קר כקרח לצינור.
  2. Homogenize הדגימות באמצעות homogenizer מכאני ב -20,000 סל"ד במשך 10 שניות. מגניב על קרח למשך 2 דקות. חזור על פעולה שלוש פעמים זהים.
    הערה: זה נעשה כדי שהדגימות לא התחממו תוך homogenizing.
  3. להבהיר ידי צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל גלולה של חומר שאינו הומוגני.
  4. קח supernatant (homogenate הגולמי), להוסיף לפוליקרבונט צינורות צנטריפוגה (גודל של צינור תלוי בגודל הרוטור) ולאזן בזהירות. צנטריפוגה ב 100,000 XG במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. שמור supernatant כמו זה החלק TBS-המסיס.
  6. לשטוף גלולה פעמיים בחמישה כרכים של חיץ 1X TBS ו צנטריפוגות בכל פעם ב100,000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מחק את supernatants.
    1. Resuspend גלולה הסופי על ידי sonicating גלולה במשך 10 שניות ב 20 קילוהרץ בכ 5 כרכים של 1X TBS-SDS ב RT.
      הערה: לפני תוספת של דגימות מאגר המכילות SDS יש להביא ב 10 מעלות צלזיוס, כדי למנוע משקעים SDS.
    2. Ultracentrifuge ב100,000 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס.
  7. שמור supernatant כמו זה הדואר SDS חלק מסיס.
    1. לשטוף גלולה פעמיים ב 5 כרכים של חיץ 1X TBS-SDS ב RT. צנטריפוגה בכל פעם ב100,000 XG במשך 15 דקות במהירות של 25 מעלות צלזיוס.
    2. Solubilize גלולה הסופית ב -50 μl של חיץ TBS-SDS-אוריאה 1X באמצעות sonicator נקבע על 20 קילוהרץ במשך 10 שניות להגיע לsolubilization מלא; זה נקרא החלק מסיס האוריאה.
  8. Assay כל חלק לתכולת חלבון כולל באמצעות ערכת assay החלבון מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. לדלל דגימות TBS-SDS-אוריאה 1: 1 עם חיץ 1X TBS כדי לאפשר תאימות עם ריאגנטים assay החלבון. דגימות הקפאת aliquots הקטן (20 μl) ב -80 ° C כדי להפחית להקפיא להפשיר מחזורים.
    הערה: הוספת גליצרול 10% לדגימות מומלצת לאחסון לטווח ארוך ב -80 ° C.

3. immunoblotting של דוגמאות וניתוח תוצאות

  1. דגימות לרוץ מTBS, TBS-SDS ותמציות TBS-SDS-אוריאה על 10-גם 4-12% ג'ל polyacrylamide Bis-טריסעם מגבים כחיץ פועל באמצעות טכניקות סטנדרטית. ראה גלאגר וצ'אקראבאטי (2008) 29 לפרוטוקול כתם מערבי מפורט.
  2. עומס 10 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם על כל מסלול יחד עם סמן משקל מולקולרי לTBS וSDS ושברים אוריאה.
  3. הפעל ג'ל ב 200 V עבור שעה 1 או עד הצבע הכחול ממאגר הטעינה הגיע התחתון של ג'ל.
  4. העבר את החלבונים מג'לי electrophoretically על קרומי ניילון 28, רטוב מראש ראשון במתנול 100% ולאחר מכן למאגר המכיל מתנול העברה 20%. לספק סימן זיהוי על הכתם כדי לקבוע את צד חלבון ואת הכיוון של הסמנים מולקולרי גודל-משקל.
    1. כריך ג'ל עם הקרום לצד נייר סינון רטוב. מיקום נכון של קרום הוא קריטי עם הקרום בין הג'ל והאנודה. לבצע ההעברה לשעה 2 ב 40 V.
    2. איפור 1X PBS-tween (1X PBS-T) חיץ: ממיסים לוח 1 של PBS ב200 מיליליטרמים להניב 0.01 חיץ M פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי ו0.137 כלוריד M נתרן, pH 7.4.
    3. חסום את הקרום בפתרון 5% BSA ב1X PBS-T למשך 30 דקות עם הרעד ב 70 סל"ד. זה מונע שאינו ספציפי מחייב של נוגדן ראשוני על הקרום.
  5. לחקור את כתם החלבון עם 6 מיליליטר של α-syn נוגדן ראשוני SYN-1 (Biosciences BD; נוגדנים חד שבטי עכבר) בשעת 1: 750 דילול (N O / 4 ° C) ואחריו סדרה של שוטף עם 1X PBS-T ( 3 x 5 דקות בכל פעם) 28.
  6. דגירה הכתם עם HRP המתאים מצומדות נוגדנים משני בשעת 1: 2,000 דילול למשך 30 דקות. לבצע סדרה של שוטף (3 x 5 דקות בכל פעם) עם 1X PBS-T.
    1. לטבול את הכתמים בפתרון chemiluminescence משופר עבור 15 שניות בחדר חשוך. כתמי כיסוי עם ניילון נצמד ומקום סרטי autoradiography נגד הכתם עם צד עד חלבון בקלטת אור-הוכחה כדי ללכוד את האותות המתאימים (להקות גודל מתאימות).
    2. לפתח סרטי autoradiography במפתח אוטומטי.
      הערה: ניתן גם פיתחו "כתמים ידני באמצעות מפתח וסדר ממקור מסחרי במקרה מכונה מפתח אוטומטי אינה זמינה.
  7. דגירה הכתם המערבי עם 6 מיליליטר של כתם מערבי הפשטת חיץ במשך 10 דקות עם קבוע רועד להתפשט הכתם של אות נוגדן α-syn. בצע את שלבים 3.43 עד 3.6.2 באמצעות נוגדן ראשוני ביתא אקטין (חד שבטי עכבר) בשעת 1: 8,000 דילול.
  8. סריקה ולהמיר את התמונה הסופית לצפיפויות תמונה ומידת Tiff באמצעות NIH ImageJ למטרות כימות (תוכנה להורדה בחינם).
    הערה: התוכנה מאפשרת קריאה של צפיפות של אזור היחסי של ריבית (להקות הגודל המתאימות) ויכול לבוא לידי ביטוי גם כיחס של צפיפות / β-α-אקטין syn (גן בית שמירה) כיחידות שרירותיות או על נתונים שלה כאשר גן שמירה על הבית הוא לא חוקי (כמו במקרה של דגימות אוריאה מסיסה).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TBS, SDS וחלבוני אוריאה מסיסה המופקים מגרעינים הבזליים הבאים הפרוטוקול מוצג באיור 1 היו לרוץ על ג'לים וimmunoblotted עם חד שבטי עכבר SYN-1 α-syn נוגדן ראשוני. שברים המסיסים TBS מוצגים הנוכחות של α-syn monomeric (~ 14 מיני KDA) במקרי PD ושליטה שנבדקו (איור 2 א). שברים המסיסים SDS גם הראו α-syn monomeric בשפע בכל שלושת תת-הסוגים של המקרים שנחקרו כמוצג בכתם החשיפה הנמוך (איור 2 ג). מקרי PD הראו גם מינים גבוהים יותר משקל מולקולרי (MW)-כנסת, α כפי שנראה בכתם החשיפה הגבוה, אשר עשוי להיות oligomers (איור 2 ג). שברים מסיסים האוריאה ממקרי PD הראו כמויות גבוהות של מונומרים α-syn, oligomers ומינים מצטברים לעומת שליטת מקרים. מקרי PD אידיופטית neocortical להפגין כמויות גדולות יותר של aggreg ated α-כנסת, מינים, תוך מקרים הלימבית מראים רמות ביניים של α-syn מסיס. שני השברים SDS ואוריאה ממקרי PD אידיופטית להפגין רמות משתנה של מוצרי α-syn קטועים ב 12 kDa ו -6 kDa כמתואר 20. לעומת זאת, מקרי שליטה לא הראו שום α-syn מסיס או מצטבר (איור 2E). צעדי צפיפות חצי כמותית משקפים את כמות עומס LB כcategoriesd באמצעות אימונוהיסטוכימיה α-syn מדגימה את האופי מסיס של α-syn מצטבר (איור 2, 2D, 2F) במקרי PD neocortical והלימבית.

figure-results-1
איור 1. תרשים סכמטי של הליך חילוץ -syn α מסיס.r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. immunoblots נציג של רמות -syn α מPD ולשלוט רקמה אנושית. TBS, SDS ושברים מסיסים אוריאה מגרעיני בסיס (אזור שמטפח פתולוגיה α-syn במקרי PD) של מקרי PD אידיופטית ונורמליות נוירולוגית (שליטה) המוח נותח לנוכחות של α-syn באמצעות immunoblot המערבי. 10 מיקרוגרם של חלבון הועמסו על כל מסלול. ב TBS שברים (), בעיקר מונומרים α-syn נמצאים בכל המקרים. בSDS שברים (C), כמה oligomers של α-syn נראה יחד עם מונומרים בעיקר ברקמות PD. בשברי אוריאה (C), מונומרים, oligomers וα-syn מצטבר לידי ביטוי variably בreflectin מקרי PDז עומס LB שלהם. דגימות הבקרה נורמליות נוירולוגית להראות הנוכחות של רק כמויות קטנות של α-syn monomeric. לתשומת לבך מוצרים פגומים אפשריים של α-syn נראים בחלק מהמקרים עם עומס LB גבוה. ראש החץ המוצק מייצג את צורת monomeric של α-syn. * אולי מייצג צורת C-סופני קטועים של α-syn כפי שתואר קודם לכן 20,26. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כיסוי מגן מִין גיל בyrs המוות עיכוב שלאחר המוות (שעות) pH של רקמות
1 neocortical M 82 40 6.3
2 neocortical F 75 35.3 6.4
1 הלימבית M 81 28.5 6.2
2 הלימבית F 79 36.5 6.2
בקרת 1 M 80 38 6.1
בקרה 2 F 83 32.5 6.3

נתונים דמוגרפיים מוגבל טבלת 1. מהמקרים משמשים

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר פרוטוקול יוכימיים להפקה ובדיקה של מאפייני מסיסות ההפרש של monomeric, oligomeric וα-syn מצטבר ממוח החולה באמצעות תנאי ריצת ג'ל denaturing. זוהי טכניקה מבוססת היטב ללמוד α-syn מצטבר 17, 18, ​​20, 21 חלבון שהוא בדרך כלל מסיס בצורה המקורית שלו, אבל לזכות בנכסי צבירת amyloidogenic או גדלו עם התקדמות מחלה או עם מוטציות גנטיות. עם זאת, חלק מהקבוצות השתמשו בשינויים קלים בריכוזי SDS במאגרים שלהם (8% או 10% במקום 5%) 21,22, 30. SDS הוא חומר ניקוי anionic וsolubilises α-syn oligomers שיכול לכלול צורות קרום מחויבת של α-syn, ואילו אוריאה, מגיב chaotropic denatures צורות מצטברות וסיביות או amyloidogenic מסיסה של α-syn 20. בהקשר זה מחקר שיטתי על ידי אל Paleologou et 31 בחן את היציבותשל oligomers-כנסת, α וסיבים עם ריכוזים שונים של אוריאה (6.5-8 M) או SDS (0.25-2%) ודיווח כי oligomers יציב בריכוזי SDS, אבל לא עם ריכוז גבוה של אוריאה. נוגדן FILA-1 שלהם, ספציפי לoligomers-כנסת, α וסיבים זוהה ריכוזים גבוהים יותר של סיבים על 6.5 M ריכוזי אוריאה בתנאי denaturing שאינם. ריכוזי חיץ שימוש בפרוטוקול זה מקרוב מראות מה שתואר באל Culvenor et. (1999) 32.

האזורים במוח אנטומי להפקה ביוכימיים של α-syn מסיס יש לבחור בזהירות וזה צריך לשקף עומס LB וLN-כנסת, α בהתאם להתקדמות מחלה 33,34. מקרים המשמשים כאן הם דגימות הגרעינים הבזליים מתת neocortical והלימבית של PD משקפים שלבים מאוחרים וביניים של התקדמות PD לפי McKeith ctriteria 34. בבנק מוח כיכר המלכה, מחצית מהמוח היאקבוע באופן שיגרתי בפורמלין לניתוח histochemical ואת החצי השני הוא גזור בקפידה לאזורים אנטומיים שונים ובזק קפוא ומאוחסן במקפיאי C -80 o ללימודים / ניתוח RNA נוספים ביוכימיים ו- DNA. בעקבות קיבעון פורמלין של המוח ועל ידי נתיחת neuropathologists, אימונוהיסטוכימיה מבוצעת באמצעות נוגדן α-syn ותוצאות בארכיון. גם כנוהל שגרתי, את ה- pH של רקמת המוח נמדד בעת הגעה כמדד למצב האגונאלית של רקמת המוח. זה מהווה בסיס איתן לאיכות שימור רקמות לאנליזה ביוכימית.

הנתונים שלנו כאן מראה שיש יותר SDS מונומר α-syn המסיס במקרי PD השוואה לקבוצת ביקורת; בפרט מקרי PD neocortical יש עומס α-syn גבוה יותר בהשוואה למגוון PD הלימבית. מקרי neocortical מייצגים התקדמות גדולה יותר של פתולוגיה α-syn PD באזורי neocortical כגון cor הקדמי והקודקודיתפרקטיקות 33,34. יש מקרי PD הלימבית ציונים גבוהים יותר LB באזורי המוח הקדמי / אזורים הלימבית הבסיסיים כגון האמיגדלה, transentorhinal ואזורי cingulate. לנתונים משמעותיים וניתוח סטטיסטי, אחד חייב לרוץ לפחות 4 מקרים מכל קבוצה. כמו כן יש לנו לא ניסיתי ניתוח סטטיסטי של נתוני הכתם שהוצגו כאן.

זה חייב להיות גם ציין כי ייתכן שנוגדנים שונים להכיר צורות שונות / הרכב oligomers-כנסת, α סדר גבוה יותר וכל ייתכן שיש לה רגישות היחסית והעדפה. הדבר ניכר מן התוצאות של טונג et al. 29 שבו הם מראים כי 4 נוגדנים שונים α-syn (SYN-1, SS, אונקו וLB509) לתת תוצאות לשינוי לפחות לoligomers / אגרגטים α-syn. מונומרים α-syn הוכרו בהיקפים דומים על ידי כל 4 הנוגדנים אם כי אלה יכולים להיות וריאציה תלוי אם epitope נוגדן α-syn ממוקם גם בN-המסוף או C-terminal 29. באופן דומה, נוגדנים ספציפיים לphospho-אלפא סינוקלאין לקבוע משקל מולקולרי גבוה מובחן סינוקלאין α-מיני 20,21. בפרוטוקול המתואר כאן, הנוגדן המאופיין ביותר SYN-1 כבר בשימוש 19-21.

עם זאת, חשוב לשקול אימות כל נוגדן חדש על כתמים מערביים באמצעות ניסויי preabsorption נוגדן וגם ביטוי יתר ומציאה של החלבון בתאים.

חשוב לקחת בחשבון וריאציות אחרות שיושמו על ידי חוקרים כדי לקבוע שברים קטנים של צורות α-syn ולא יציב או tetrameric α-syn. זה יכול לכלול קל-קיבעון של קרומים עם 0.4% PFA בPBS לשמור על צורות הקטועות של α-syn 35 או טיפול במדגם homogenates עם linkers הצלב לייצב tetramers 36.

הערכה ביוכימיים מדויקת של חלבונים באמצעות ti שלאחר המוותssue דורש מזעור של פירוק חלבונים האנזימטית ושינוי. לכן מומלץ להשתמש רקמות עם העיכובים שלאחר המוות הקצרים ו / או בחר דגימות מתאימות בתוך תיק הקבוצות. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים סטנדרטיים אימונוהיסטוכימיה α-syn צריכה להתבצע לפני תחילת פרוטוקול הבידוד. הפתולוגיה α-syn המידה משתנה מאוד ויכולה להשתנות בהתאם לאזורים הנבחרים. מומלץ לבחור אזורים עם פתולוגיה בשפע כביקורת חיובית לתשואה אופטימלית עם כל ריצה. השימוש במעכבי פרוטאז ואם מעכבי phosphatase ההכרחי כדי למנוע השפלה האנזימטית לא רצויה לאחר שחרורו של פרוטאזות או phosphatases תאיים המתרחשת במהלך תמוגה תא ושמירה על הדגימות ב 4 ° C הוא קריטי.

חשוב שכל הדגימות בתוך הקבוצה של ניסויי מטופלות באופן שווה ובעקביות כדי למנוע וריאציות התוך משתמש; fre מרובהיש להימנע מחזורי Eze ההפשרה כזה פוטנציאלי עלול לחזור לאחר translational שינויים כגון זרחון. נקודה קריטית לזכור כאשר בוחנים מספר גדול של דגימות הוא שהנתונים מimmunoblots צריכים להיות מנורמלים למדגם אחד, שאמורה לפעול במקביל לכל דוגמאות האחרות בג'לים, ואת כל הנתונים בהפניה למדגם ש. הדבר נעשה כדי להבטיח נורמליזציה של נתונים immunoblot בין כמה כתמים. זוהי השיטה שאומצה במחקר שנערך לאחרונה שלנו 22.

יש לציין כי על מנת לשמור על ECL הרקע נמוך, לא צריכים להיות מותר הכתמים להתייבש בכל עת במהלך פרוטוקול הכתם המערבי. בנוסף, יש להימנע חשיפות ארוכות מאוד (> 10 דקות) על סרטי autoradiography כמו זה יוביל לרוויה של אות ECL ויוביל לכימות מדויק.

פרוטוקול לעיל זוהי טכניקה פשוטה יחסית באמצעות מעבדה משותפת ובstruments ויכול להיות כלי רב ערך לחקירת הפתופיזיולוגיה חלבון α-syn של במחקר PD. מתודולוגיה זו לא יכולה להיות מורחבת עם שינויים מתאימים לחקר הביולוגיה α-syn בבעלי חיים מהונדסים α-syn אלא גם למחלות ניווניות אחרות שמציעות פיקדונות חריגים של חלבונים מצטברים כגון הספירה, MSA, DLB, HD וfrontotemporaldementias בלבד. עם זאת נתונים הכתם המערביים תוארו כאן יכולים גם להיות מאומתים באמצעות מבחני immunosorbent צמוד אנזים באמצעות נוגדנים לצורות מסוימות של α-syn 31.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר יש מה למסור.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אני מודה לד"ר אדמנטיוס מאמאיס על חילוץ α-סינוקלאין מרקמה אנושית והפעלת כתמים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק MRC (MR/L010933/1) ובחלקה על ידי פרס Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) לקונסורציום מחלת הפרקינסון הבריטי (UKPDC) שחבריו הם מהמכון לנוירולוגיה של UCL, אוניברסיטת שפילד ויחידת זרחון החלבון MRC באוניברסיטת דנדי. RB קיבלה מימון מקרן MJFox לעבודה זו וממומנת גם על ידי קרן Reta Lila Weston.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris-HCLSigmaT5912
נתרן כלוריVWR27800.291
SDSFluka71727
אוריאהסיגמאU5378
טבליות מעכב פרוטאז Roche04 693 116001
טבליות מעכב פוספטאז רוש 04 906 837001
טבליות מי מלח חוצץ פוספט סיגמא P4417
Tween-20 SigmaP9416
NuPAGE MOPS SDS מאגר הפעלהInvitrogenNP0001
מאגר העברת NuPAGEInvitrogenNP0006-1
ממברנת Hybond-P GE HealthcareRPN303F
נייר סינון Whatman 3 מ"מסיגמאWHA30306185
ביס-טריס ג'ל 4-12% Invitrogen 
NP0322BOX Supersignal West Pico ChemiluminescentSubstrate Pierce34080
Bio-RAD DC ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad500-0112
צינורות פוליקרבונט Thickwall BeckmanBeckman355630
מאגר הפשטת כתמים מערבייםThermo scientific46430
Syn-1 נוגדן ראשוני (חד שבטי של עכבר)BD Biosciences610786
נוגדן ראשוני בטא-אקטין (חד שבטי של עכבר SigmaA5441
HRP מצומד עז אנטי עכבר נוגדן משניסנטה קרוזsc-2031
אלבומין סרום בקרסיגמאA7030
חברת מכשיריםרוטור / דגם no 
אולטרה צנטריפוגה ספסלית, אופטימה מקסבקמןMLA-80
סוניקטורמערכות חוםXL20-20
הומוגנייזרג'נקה וקונקלTP18/10
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
  2. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  3. Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
  4. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
  5. Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
  6. Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
  7. Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
  8. Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
  9. Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
  10. Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy? Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
  11. Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
  12. Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, 841(2003).
  13. Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
  14. Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
  15. Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
  16. Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
  17. Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
  18. Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
  19. Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
  20. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  21. Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
  22. Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
  23. Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
  24. Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
  25. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  26. Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
  27. Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
  28. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  29. Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759(2008).
  30. Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
  31. Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
  32. Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
  33. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
  34. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  35. Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939(2011).
  36. Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alpha Synuclein ExtractionSoluble Insoluble FractionUltracentrifugation ProtocolTBS SDS Urea BuffersWestern Blot AnalysisPost Mortem Brain TissueProtein Isolation MethodNeurodegenerative Disease ResearchParkinson Disease BiomarkersSequential Protein Extraction

Related Articles