Method Article

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שלמיטוכונדריה יש מנגנון שעתוק משלהם, רק 1% מהחלבונים המיטוכונדריאלים מסונתזים בתוך האברון. החלבונים המקודדים בגרעין מועברים למיטוכונדריה בהנחיית רצפי המטרה של המיטוכונדריה שלהם (MTS); עם זאת, לרוב החלבונים המקומיים במיטוכונדריה חסר MTS הניתן לזיהוי. עם זאת, העובדה ש-MTS יכול להורות לחלבונים להיכנס למיטוכונדריה מספקת כלי רב ערך לחקר תפקודי המיטוכונדריה של חלבונים גרעיניים ו/או ציטופלזמיים בדרך כלל. לאחרונה זיהינו את קומפלקס מחזור התא קינאז CyclinB1/Cdk1 במיטוכונדריה. כדי לחקור באופן ספציפי את התפקודים המיטוכונדריאלים של קומפלקס זה, ביטוי יתר של המיטוכונדריה והפלת קומפלקס זה מבלי להפריע לתפקודיו הגרעיניים או הציטופלזמיים היו חיוניים. על ידי תיוג CyclinB1/Cdk1 עם MTS, הצלחנו להשיג ביטוי יתר מיטוכונדריאלי של קומפלקס זה כדי לחקור את המטרות המיטוכונדריאליות שלו כמו גם את התפקודים שלו. באמצעות תיוג Cdk1 שלילי דומיננטי עם MTS, עיכוב פעילות Cdk1 הושג במיוחד במיטוכונדריה. מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות של קומפלקס CyclinB1/Cdk1 זוהו באמצעות גישת פרוטאומיקה מבוססת ג'ל. בניגוד לניתוח ג'ל דו-ממדי מסורתי, השתמשנו בטכנולוגיית אלקטרופורזה של ג'ל הפרש דו-ממדי (2D-DIGE) ואחריה צביעת פוספופרוטאין כדי לתייג באופן פלואורסצנטי חלבונים זרחניים דיפרנציאלית בתאים המבטאים Cdk1 מיטוכונדריאלי. זיהוי כתמי פוספופרוטאין ששונו בסוג בר לעומת מיטוכונדריה שלילית דומיננטית הנושאת Cdk1 חשף את זהות המטרות המיטוכונדריאליות של Cdk1. לבסוף, כדי לקבוע את ההשפעה של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של CyclinB1/Cdk1 בהתקדמות מחזור התא, נעשה שימוש בבדיקת התפשטות תאים באמצעות אנלוגי תימידין סינתטי EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) כדי לנטר את התאים כשהם עוברים במחזור התא ולשכפל את ה-DNA שלהם. בסך הכל, הדגמנו מגוון גישות זמינות לחקר לוקליזציה ופעילות מיטוכונדריאלית של קינאז במחזור התא. אלה שיטות מתקדמות, אך קלות לביצוע, שיועילו לחוקרים רבים בביולוגיה של התא.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביונקים, התקדמות מחזור התא תלויה אירועים הורה מאוד בשליטת cyclins ו קינאזות תלויות-ציקלין (Cdks) 1. באמצעות ציטופלסמית שלה, גרעיני, ולוקליזציה centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 הוא מסוגל לסנכרן אירועים שונים מיטוזה כמו התפרקות מעטפת הגרעין ואת centrosome ההפרדה 2. CyclinB1 / Cdk1 ומגן על התאים mitotic נגד אפופטוזיס 3 ומקדם ביקוע המיטוכונדריה, צעד קריטי עבור חלוקה שווה של המיטוכונדריה לתאי הבת שהוקמה זה עתה 4.

בשינה מתרבה בתאי יונקים, המיטוכונדריה ATP מופק באמצעות זירחון חמצונים (OXPHOS) מכונה (שרשרת העברת אלקטרונים), אשר מורכבת של 5 מתחמים רב למקטע; אני מורכב - V המורכבת (CI-CV). Dinucleotide אדנין Nicotinamide (NADH): oxidoreductase ubiquinone או מורכב אני (CI) הוא הגדול והמובן פחות מחמשת מתחמי 5. ג המורכבonsists של 45 יחידות משנה, 14 מתוכם מהווים את הליבה קטליטי. לאחר הרכבה, במתחם מניח מבנה בצורת אות עם זרוע אחת בולט לתוך המטריצה ​​ואת היד השנייה המוטבעת 6,7 הקרום הפנימי. מוטציות יחידות משנה CI הם הגורם במגוון הפרעות המיטוכונדריה 8. CI יעילה פונקציונלי OXPHOS נדרשה לא רק עבור נשימה המיטוכונדריאלי הכולל 9, אלא גם עבור התקדמות מחזור תא מוצלח 10. Unravelling המנגנונים העומדים בבסיס התפקוד מורכב אנזים קרום נכנס זה בבריאות ובחולי יכולים לאפשר הפיתוח של הליכי אבחון חדשניים אסטרטגיות טיפוליות מתקדמות. במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו כי המתחם CyclinB1 / Cdk1 translocates לתוך המיטוכונדריה בשלב (גאפ 2) G2 / (מיטוזה) M ו- phosphorylates יחידות משנה CI להגביר את ייצור האנרגיה במיטוכונדריה, פוטנציאל לקזז הצרכים אנרגיה מוגברת של תאים במהלך התא מחזור 11. כאן אנו showcase נהלים אסטראטגי הניסיונות, שניתן להשתמש בם כדי ללמוד טרנסלוקציה המיטוכונדריה של קינאזות ציטופלסמית גרעינית / אחר, המצעים המיטוכונדריה שלהם, כמו גם השלכות תפקודיות של לוקליזציה המיטוכונדריה שלהם באמצעות CyclinB1 / Cdk1 כדוגמא.

הממצא כי מתחם CyclinB1 / Cdk1 translocates לתוך המיטוכונדריה בעת צורך יתבקש המחקרים של ביטוי יתר המיטוכונדריה ספציפי מציאה של מורכבות זו. כדי להשיג ביטוי המיטוכונדריה ספציפי של חלבונים, אפשר להוסיף רצף מיקוד המיטוכונדריה (MTS) ב N- הסופית של החלבון של עניין. המיטוכונדריה מיקוד רצפים לאפשר מיון של חלבונים המיטוכונדריה לתוך המיטוכונדריה שם הם בדרך כלל מתגוררים 12. השתמשנו רצף מיקוד 87 המיטוכונדריה בסיס נגזר מבשר של 8A למקטע מונואמין ג האנושי ציטוכרום (COX8) ו משובטים אותו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged CyclinB1 או פלורסנט האדוםחלבון (RFP) -tagged Cdk1 המכילים פלסמידים מסגרת. שיטה זו אפשרה לנו למקד CyclinB1 ו Cdk1 לתוך המיטוכונדריה, שינוי הביטוי המיטוכונדריה במיוחד של חלבונים אלה מבלי להשפיע בריכת הגרעין שלהם. על ידי fluorescently תיוג חלבונים אלה, הצלחנו לפקח לוקליזציה שלהם בזמן אמת. באופן דומה, יש לנו הצגנו MTS לתוך פלסמיד המכיל דומיננטי-tagged RFP השלילי Cdk1, אשר אפשר לנו לדפוק במיוחד במורד הביטוי המיטוכונדריה ותפקידי Cdk1. זה חיוני כדי להבחין בין פונקציות המיטוכונדריה וגרעיניות של קינאזות שיש localizations כפול כמו Cdk1. הנדסת MTS לתוך הטרמינל N של קינאזות הפונקציונלי הכפול אלה מציעה אסטרטגיה גדולה כי הוא קל להיות מועסק ויעיל.

מאז Cdk1 הוא קינאז מחזור התא, והוא תהליך יסודי כדי לקבוע את התקדמות התא מחזור כאשר Cdk1 הוא מקומי לתוך המיטוכונדריה. כדי להשיג זאת, יש לנו מנוצל metho חדשד לפקח על תוכן DNA בתאים. שיטות מסורתיות כוללות שימוש BrdU (bromodeoxyuridine), אנלוגי thymidine סינטטי, אשר משלב לתוך ה- DNA המסונתז החדש בשלב S של מחזור התא להחליף thymidine. ואז התאים כי הם משכפלים DNA שלהם באופן פעיל ניתן לאתר באמצעות נוגדנים נגד BrdU. אחד חסרונות של שיטה זו הוא בכך שהיא דורשת denaturation של ה- DNA כדי לספק גישה של נוגדן BrdU בשיטות קשות כמו טיפול בחומצה או חום, דבר אשר עלול לגרום אי התאמה בין תוצאות 13,14. לחלופין, השתמשנו בגישה דומה כדי לפקח על תאים המתחלקים באופן פעיל עם אנלוגי thymidine שונה, edu. זיהוי edu אינו מחייב denaturation DNA קשה כטיפול ניקוי עדין מאפשר מגיב זיהוי לגשת EDU ב- DNA המסונתז חדש. שיטת edu הוכיחה להיות יותר אמין, עקבי עם פוטנציאל לניתוח תפוקה גבוהה 15.

לבסוף, to לקבוע מצעים המיטוכונדריה של Cdk1, השתמשנו בכלי פרוטאומיקה בשם 2D-DIGE, אשר היא גרסה מתקדמת של ג'ל אלקטרופורזה קלאסית דו מימדי. שני אלקטרופורזה ממדי מפרידה חלבונים על פי נקודת isoelectric שלהם במימד הראשון ועל משקל מולקולרי של השני. מאז שלאחר translational שינויים כגון זרחון וישפיע על נקודת isoelectric ועל משקל מולקולרי של חלבונים, ג'לים 2D יכול לזהות את ההבדלים בין סטטוסים זרחון של חלבונים בתוך מדגמים שונים. הגודל (שטח ועוצמה) של חלבון כתמים שינויים עם רמת הביטוי של חלבונים, המאפשר השוואה כמותית בין דוגמאות רבות. באמצעות שיטה זו, הצלחנו להבחין בין החלבונים פוספורילציה סוג בר לעומת תאי מבטאים המיטוכונדריה במיקוד מוטצית Cdk1. כתמי החלבון המסוימים שהראו את הסוג הבר אבל היו חסרים בהכנת Cdk1 המוטציה המיטוכונדריה במיקוד בודדושזוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה.

ג'ל 2D המסורתי, צבעי triphenylmethane משמשים כדי להמחיש את החלבונים על הג'ל. 2D-DIGE משתמשת תוויות חלבון פלואורסצנטי עם השפעה מזערית על ניידות electrophoretic חלבון. יכולות להיות מתויגות דגימות חלבון שונות עם צבעי ניאון שונים, מעורבבים יחד מופרד על ידי ג'ל הזהה, המאפשרים-אלקטרופורזה השיתוף של דגימות מרובות על ג'ל בודד 16. הדבר מצמצם את וריאציות ג'ל אל-ג'ל, אשר מהווה בעיה קריטית במחקרים פרוטאומיקה מבוסס ג'ל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניתוק של המיטוכונדריה מ תאים בתרבית

  1. הכנת בידוד ההצפה עבור תאים (IBC) חוצץ
    1. הכן 0.1 M טריס / מגבים (טריס (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (-morpholino N) חומצה propanesulfonic): ממיסים 12.1 גרם של טריס ב 800 מ"ל מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 7.4 באמצעות אבקת מגבים, להוסיף מים מזוקקים לסך נפח של 1 ליטר ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס
    2. הכן 0.1 M EGTA (bis אתילן גליקול (2-aminoethyl האתר) חומצה tetraacetic) / טריס: ממיסים 38.1 גרם של EGTA ב 800 מ"ל מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 7.4 באמצעות אבקת טריס, להוסיף מים מזוקקים כדי בהיקף כולל של 1 ליטר ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס
    3. הכן 1 M סוכרוז: ממיסים 34.23 גרם של סוכרוז 100 מ"ל מים מזוקקים, לעשות 20 מ"ל aliquots, ולאחסן ב -20 מעלות צלסיוס
    4. הכן חיץ ג IB: הכן 100 מ"ל של IB ג הצפת על ידי הוספת 10 מ"ל של 0.1 מ 'טריס / מגבים ו 1 מ"ל של 0.1 M EGTA / טריס 20 מ"ל; של 1 M סוכרוז. מוסיפים מים מזוקקים כדי בהיקף כולל של 100 מ"ל. התאם ל- pH 7.4.
  2. הכנת תא הצפת תמוגה
    1. הכן את החיץ תמוגה המכיל 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA (אתילן diamino חומצה tetraacetic), 1 מ"מ EGTA, 1% Triton-X-100, 2.5 פירופוספט נתרן מ"מ, 1 מ"מ β- glycerophosphate, 1 orthovanadate נתרן מ"מ. להוסיף מעכבי proteinase 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​leupeptin ו -1 מ"מ PMSF (פלואוריד phenylmethylsulfonyl) ממש לפני השימוש.
  3. בידוד של המיטוכונדריה
    1. קציר 3 x 10 7 תאים עם PBS 1x קר כקרח (בופר פוספט), pH 7.4 ו צנטריפוגות תאים ב 600 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 מ"ל חיץ ג IB קר כקרח.
    2. Homogenize התאים באמצעות מטחנת רקמת זכוכית / זכוכית במשך כ -10 דקות. מעבירים את homogenate אל צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 600 XG במשך 10 מילn ב 4 מעלות צלסיוס עבור המיטוכונדריה תפקודית, להשתמש צימוד זכוכית / טפלון כפי שהוא פחות מזיק המיטוכונדריה מאשר מטחנת רקמת זכוכית / זכוכית.
    3. איסוף supernatant לתוך צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות ב 7,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מ"ל ולשמור כמו חלבון cytosol.
    4. קר כקרח IB ג חיץ צנטריפוגות שטפו את הכדור (המיטוכונדריה) פעמיים עם 200 μl ב 7,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    5. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה במאגר תא תמוגה ולהשתמש בו מיד או לאחסן ב -80 o C לשימוש עתידי. אם המיטוכונדריה תפקודית נדרשת, מחדש להשעות הגלולה במאגר הנותר לאחר שלכת supernatant. דילול השבר המיטוכונדריה נוסף עלול לגרום לאובדן של פונקציה של המיטוכונדריה. חנות על קרח ולהשתמש ההכנה 1 - 3 שעות עבור התוצאות הטובות ביותר.
    6. Sonicate גלולה resuspended במשך שלושים פרצי 3-שניות במהלךבאמבט קרח, צנטריפוגות ב XG 10,000 במשך 5 דקות, ולשמור supernatant ככל השבר המיטוכונדריה.

2. Co-immunostaining של Cdk1, CyclinB1 ו COXIV, חלבון Resident מיטוכונדריאלי

  1. לגדול 5 x 10 4 תאים על coverslips ב O 24 גם צלחות / N או עד 70% מפגש. לשאוב בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μl קר כקרח 1 x PBS, pH 7.4.
  2. תקן תאים עם 500 paraformaldehyde μl קר כקרח 4% ב RT במשך 10 דקות. לשאוב את הפתרון קיבוע לשטוף את התאים עם 500 μl 1 x PBS 3 פעמים, 5 דקות כל אחד עם רעד עדין ב RT.
  3. Permeabilize את התאים עם 0.2% Triton X-100 ב 500 μl של PBS במשך 5 דקות ב RT. לשאוב את הפתרון לשטוף את התאים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד עם 500 μl PBS. מוסיפים את הפתרון חוסם (500 μl, 1 BSA% (אלבומין בסרום שור) ב- PBS המכיל 1% Tween 20) למשך 30 דקות ב RT.
  4. לדלל את הנוגדנים הראשוניים 1: 250 (v: v) 5001; l של חסימת פתרון דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים רצויים וגדלו מינים שונים כדי למנוע איתות צלב (CyclinB1 (עכבר) COXIV (ארנב) או Cdk1 (עכבר) COXIV (ארנב) ב RT במשך 30 - 60 דקות או O / N ב 4 מעלות צלסיוס
  5. שטפו את coverslips עם 500 μl של 1 x PBS 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים משני בדילול 1: 1,000 ב 500 μl פתרון לחסימת ב RT עבור שעה 1 ואחריו כביסה עם 500 μl PBS 3 פעמים, 5 דקות כל אחד.
  6. הר coverslips עם 20 μl של פתרון גובר אנטי לדעוך ולאטום את השקופיות עם לק. תמונה שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיד או לשמור בחושך ב 4 o עבור 1 - 2 שבועות.

3. הפקת סודיום קרבונט של המיטוכונדריה Intact

  1. לגדול כ 20 x 10 7 תאים, הקציר, לשטוף פעם אחת עם PBS ולבודד המיטוכונדריה כמתואר המיטוכונדריה Divide סעיף 1. מבודד לשתי בנותts לפני צנטריפוגה האחרון גלולות המיטוכונדריה (לפני שלב 1.3.4); להציל את מחצית לשמש המיטוכונדריה הכולל (שלב 3.2), השתמש החצי השני להפקת סודיום קרבונט (ביצוע השלבים 3.3-3.6) להפריד חלבונים מחויב מסיסים הממברנה.
  2. Lyse המיטוכונדריה הכולל גלולה עם 30 μl של חיץ תא תמוגה ולאחסן את lysate ב -80 o C עד בשימוש immunoblotting.
  3. הוסף 250 μl של 0.1 M Na 2 CO 3 (סודיום קרבונט), pH 11.0, אל החצי השני של גלולת המיטוכונדריה דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  4. צנטריפוגות ב 100,000 XG במשך 20 דקות. אסוף את supernatant והמשך לשלב 3.5. Lyse גלולה באמצעות 30 μl של חיץ תא תמוגה sonicate כמו בשלב 1.3.6. חנות ב -80 מעלות צלסיוס עד המשמשים immunoblotting.
  5. הוסף נפח שווה של 20% חומצת trichloroacetic טרי (TCA) כדי supernatant כדי לזרז את החלבונים ולשמור על קרח למשך 30 דקות.
  6. CentrifUge ב 15,000 XG במשך 10 דקות. בטל supernatant, לפזר את הגלולה ב 80 μl של חיץ תמוגה תא ולאחסן ב -80 o C עד בשימוש immunoblotting.

ההפרדה 4. הפנימיים והחיצוניים ממברנות של המיטוכונדריה (בידוד של Mitoplasts)

  1. לגדול כ 20 x 10 7 תאים, קציר, לשטוף פעם אחת עם PBS ולבודד המיטוכונדריה כמתואר בסעיף 1. שברי המיטוכונדריה נפרדים ל -10 חלקים שווים בפני צנטריפוגה האחרון גלולות המיטוכונדריה (לפני שלב 1.3.4).
  2. ממיסים כל גלולה ב 30 μl של ריכוז המצוין של חיץ סוכרוז hypotonic (1 mM EDTA, 10 מ"מ מגבים / KOH (הידרוקסיד אשלגן), pH 7.2; ריכוז סוכרוז בין 25 - 200 מ"מ) עם או בלי 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​טריפסין ( ראה טבלה 1) ו דגירה 30 דקות על הקרח.
  3. הוסף 3 μl של 10 מ"מ PMSF (כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"מ PMSF) כדי טריפסין המכיל בקבוקונים להפסיק tהוא טריפסין עיכול דגירה על קרח למשך 10 דקות.
  4. צנטריפוגה ב 14,000 XG ב 4 o צלזיוס למשך 10 דקות. העברת supernatant לתוך צינור חדש, lyse גלולה ב 30 μl של חיץ תמוגה התא, sonicate כמו בשלב 1.3.6, ולאחסן ב -80 מעלות צלסיוס

5. בניית המיטוכונדריה במיקוד GFP / RFP-tagged CyclinB1 / Cdk1 וקטורים ואישור של לוקליזציה מיטוכונדריאלי שלהם

  1. Clone המיטוכונדריה מיקוד רצף (MTS; נגזר מבשר של 8A למקטע מונואמין ציטוכרום C האדם (COX8) בין נוקלאוטידים 76 - 161) ב מסגרת לתוך N- הסופית של ה- GFP או RFP ב NheI ו BamHI האתרים של pEGFP-N1 או pERFP וקטורי -N1 שימוש בטכניקות שיבוט מולקולריים רגילות.
  2. בעת תכנון פריימרים PCR עבור גני CyclinB1 ו Cdk1, להוסיף אתרי הכרת אנזים הגבלת BamHI (מודגשות) 5 'של פריימרים PCR.
    קדימה Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    הפוך ATT CTG AAT CTT CTT CAT TG C ATC GG T CTG 'Cdk1 BamH1 5
    קדימה CyclinB1 BamH1 5 עטא TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    הפוך CyclinB1 BamH1 5 עטא TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. הגבר את הגנים Cdk1 ו CyclinB1 באמצעות פריימרים אלה הבאים טכניקות סטנדרטיות. תקציר המוצרים PCR עם 1 μl של אנזים הגבלה BamHI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הפעל את המוצרים העיכול על ג'ל 1% agarose. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את קטעי דנ"א קטן בגודל הנכון החוצה לטהר את ה- DNA מן ג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל.
  4. תקציר 1 מיקרוגרם של MTS-pEGFP-N1 ו פלסמידים MTS-pERFP-N1 עם 1 μl של אנזים BamHI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הוסף 1 μl של עגל-Intestinal אלקליין phosphatase (CIP) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הפעל את המוצרים העיכול על ג'ל 1% agarose ולטהר פלסמידים לינארית מן ג'ל כמו בשלב 5.3.
  5. הגדרת התגובה קשירת ידי הוספת 1 ​​μl של פלסמיד משלב 5.4 ו -5 μl של Cdk1 או CyclinB1 משלב 5.3 כדי 3 μl של חיץ האנזים, 0.5 μl של האנזים T4, ו 20.5 μl של DH 2 O. דגירה O / N ב 4 ° C.
  6. Transform Escherichia coli DH5α תאים המוסמכות עם 10 μL של תערובת קשירת הבאים טכניקות סטנדרטיות לגדל את החיידקים על 10 מ"ג / מ"ל kanamycin המכילים צלחות אגר LB O / N ב 37 ° C כדי להשיג מושבות.
  7. בחרו מושבת מ- O / N צלחות מבוגרות באמצעות קצה פיפטה סטרילית, והכניסו את הקצה לתוך 5 מיליליטר של kanamycin-LB המכיל צינור דגירת O / N. לבודד את הפלסמיד באמצעות ערכות miniprep פי הפרוטוקול של היצרן, ורצף הפלסמיד באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
  8. Transfect MCF1 גדל באופן אקספוננציאליתאים 0A (1.5 x 10 4 תאים שנזרעו על 96-גם הצלחות) עם פלסמידים MTS-Cdk1-RFP או MTS-CyclinB1-GFP משלב 5.7 על ידי הכנת יחס מגיב פלסמיד / transfection של 1: 2 (w: נ, 100 ננוגרם : 0.2 μl) ב 100 μl serum- ובינוניים ללא אנטיביוטיקה.
  9. דגירת התאים בתמהיל פלסמיד / מגיב במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור עם בקרת לחות (5% CO 2, 95% לחות יחסית).
  10. כן פתרון מניות 1 מ"מ של צבעי ניאון אדום המיטוכונדריה והירוק ידי המסת 50 מיקרוגרם של אבקה ב 100 μl של DMSO. לדלל את פתרונות המניות 1: 400 ב 1x PBS להשיג 2.5 מיקרומטר לעבוד פתרונות. פתרונות המניות יכולים להיות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס למשך שנה.
  11. מערבבים 2 μl של 2.5 מיקרומטר של צבע אדום עם 98 μl של המדיום תרבות להכין ריכוז סופי 50 ננומטר.
  12. החלף את מדיום תרבית תאים של CyclinB1-GFP נושאת תאי MCF10A (שנוצרו בשלב 5.8) עם צבע אדום המכיל בינוני למשך 2 דקות. חזור עלהליך אותו עם צבע ירוק עבור תאי MCF10A הנושאות Cdk1-RFP.
  13. שטפו פעמיים עם 100 μl 1 x PBS להיפטר הפתרון מכתים עודף, להוסיף 100 μl 1x PBS על צלחת 96-היטב.
  14. דמיינו את מיטוכונדריה CyclinB1-GFP (עירור על ידי 488 ננומטר פליטה ב 494 - 536 ננומטר) Cdk1-RFP (עירור על ידי 560 ננומטר פליטה ב 565 - 620 ננומטר) על 96-גם הצלחות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 40X.

6. זיהוי של חלבונים דיפרנציאלי פוספורילציה באמצעות 2D-DIGE

  1. לדוגמא הכנה
    1. לבודד מיטוכונדריה lyse שברים המיטוכונדריה כמו בשלב 1.3. הוסף נפח שווה של 20% TCA (חומצת trichloroacetic במים) לדגום כל מערבולת במשך 15 שניות. דגירה על דגימות קרח למשך 30 דקות כמו החלבונים לזרז מתוך פתרון.
    2. צנטריפוגה דגימות ב 9,300 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להסיר supernatant, ולהוסיף 60 μl אצטון קר (100%) ואחריוצנטריפוגה ב 9,300 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. חזור על השלב לשטוף אצטון (שלב 6.1.2) עוד פעם אחת, להסיר supernatant מחדש להשעות את דגימות 50 חיץ תיוג μl DIGE (7 אוריאה M, 2 M thiourea, 4 בחורים%, 30 מ"מ טריס, pH 8.5).
  2. הכן את צבעי ניאון
    1. כן פתרון מניות: ממסי הצבעים (5 nmol) ב 5 μl של לפוראמיד דימתיל טרי (DMF) לריכוז סופי של 1 nmol / μl. אחסן את הפתרון לצבוע המניה ב -20 o C עד השימוש במשך כמה חודשים.
    2. כן פתרון עבודה: אפשר צבעים להגדיר ב RT במשך 5 דקות. לדלל 1 μl של צבע עם 4 μl של DMF לריכוז סופי של 200 pmol / μl. שמור על הקרח במהלך השימוש. הערה: הפתרון עובד יכול להיות כל הזמן ב -20 מעלות צלסיוס למשך 3 שבועות.
  3. חלבונים לייבל
    1. מערבבים 1 μl של פתרון עובד לצבוע לכל 12.5 מיקרוגרם חלבון. בהיקף של עד לפי הצורך. עבור סטנדרטים נקווה, להוסיף 61; l של הפתרון עובד Cy2 300 מיקרוגרם ונקווה חלבון.
    2. וורטקס למשך 30 שניות ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ב g x 12,000. לדגור על הקרח בחושך במשך 30 דקות. עצור את תיוג על ידי הוספת 1 μl של ליזין 10 מ"מ לכל 1 μl של פתרון עובד בשימוש. מערבבים היטב דגירה על הקרח בחושך במשך 10 דקות.
    3. בריכת בנפרד שכותרתו דגימות ומערבבים עם חיץ להחזרת נוזלים (7 אוריאה M, 2 M thiourea, 4 בחורים%, 1.2% destreak, 1% pharmalytes, כחול bromophenol). הנפח הכולל יהיה 125 μl.
    4. דגימות וורטקס למשך 30 שניות ולאפשר דגימות להגדיר ב RT במשך 30 דקות. טען 125 μl של דגימות על 7 ס"מ pH 4 - 9, התמקדות isoelectric רצועות (IEF).
  4. אלקטרופורזה מימד ראשון
    1. מניח את מחזיקי רצועה (ארונות קבורה) על צלחת אלקטרודה, מוודא המחזיקים בעירום נקיים ויבשים לחלוטין. פיפטה 125 דגימות μl לתוך הארון, מתפשט באופן שווה על פני הארון כולו.
    2. שימוש טוויזrs, להרים את רצועת IEF, להסיר בזהירות את כיסוי מגן פלסטיק, ולמקם אותו (צד ג 'למטה) למאגר הארון / להחזרת נוזלים. הימנע השמנת בועות אוויר. לאט למלא הארון (1 - 1.5 מ"ל) עם שמן מינרלי ומקום הארון מכסה על הארונות.
    3. בגין איזואלקטרית התמקדות בעקבות הפרוטוקול בטבלה 2:
      הערה: לאחר הריצה תושלם, הרצועות ניתן לאחסן צינורות פלסטיק ב -80 מעלות צלסיוס או ישירות עבר איזון והממד השני.
  5. הממד השני - נתרן Dodecyl ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide (SDS-PAGE)
    1. אִזוּן
      1. ההפשרה חיץ איזון SDS (8 מ"ל לכל רצועה, 6 M אוריאה, 30% גליצרול, 2% SDS). תשקלי dithiothreitol (DTT; 10 מ"ג DTT לכל 1 מ"ל של חיץ איזון SDS). ממיסים DTT למאגר איזון 4 מ"ל SDS.
      2. תשקלי רשות העתיקות (iodoacetamide, 25 מ"ג רשות העתיקות לכל 1 מ"ל של חיץ איזון SDS).ממיסים רש"ת למאגר איזון 4 מ"ל SDS.
      3. ממיסים 1 מ"ל איטום פתרון agarose באמבט מים לשימוש מאוחר יותר.
      4. אם הרצועות הוקפאו, ולאפשר להם להפשיר לחלוטין. מקום רצועות צד ג 'עד למגש reswelling. הוסף 4 מ"ל של חיץ איזון SDS עם DTT לכל רצועת דגירה במשך 15 דקות עם רעד עדין.
      5. יוצקים מעל את כל חיץ איזון SDS עם DTT. הוסף 4 מ"ל של חיץ איזון SDS עם רשות העתיקות לכל רצועת דגירה במשך 15 דקות אחר עם רעד עדין. לאחר איזון עם למאגר רשות העתיקות, יוצקים של למאגר איזון SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. לגולל ג'לים מיני, להסיר את המסרק ולשטוף את הג'ל ואת בארות עם DDH 2 O. הסר את הסרט הלבן בחלק התחתון של הג'ל לפני ההפעלה. אוריינט הרצועה על הג'ל כראוי, נטיית ג'ל היא קריטית לחיתוך במקום.
      2. הנח את ג'ל על דלפק עם הצלחת הקטנה למעלה ומלמעלה ג'ל דואר מולxperimenter. הנח את הרצועה לצלחת הגבוהה עם סוף anodic (++ לסיים עם ברקוד) מול הצד השמאלי של ג'ל. בעזרת סרגל מדידה, לאט לדחוף את הרצועה מטה אל פני שטח ג'ל. הימנע השמנת בועות אוויר בין הרצועה הג'ל. Stand למעלה ג'ל עמדת צלחת זכוכית.
      3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת agarose איטום חם פתיחת קלטת. ודא שכל בועות האוויר נלחצות החוצה באמצעות סרגל שטוח. הרכב את המנגנון ולהפעיל את הג'ל על V 125 קבוע למשך 90 דקות.
      4. כאשר הג'ל מסיים את פעולתו, למקם את הג'ל על תרמי biomolecular עם 2 מ"ל DDH 2 O ולסרוק את הג'ל במצב הרכישה הקרינה עם לייזר עירור 635 ננומטר 665 מסנן פליטה ננומטר.
    3. phosphoprotein מכתים
      1. תקן את הג'ל עם 50% מתנול 10% תערובת חומצה אצטית (10 מ"ל) למשך 30 דקות פעמיים. לשטוף עם 10 מ"ל של מים במשך 10 דקות שלוש פעמים ואת הכתם עם 10 מ"ל phosphoprotein כתם במשך 60 - 90 דקות, ואחריוdestaining עם 10 מ"ל destain פתרון במשך 30 דקות שלוש פעמים.
      2. לשטוף עם 10 מ"ל מים 5 דקות פעמיים ותמונה ג'ל עם סורק ג'ל לייזר עירור ננומטר 532 ננומטר / 560 / פליטה.
    4. עיכול חלבון וזיהוי
      1. בלו כל דיפרנציאלי הביע כתמים חלבון מן הג'ל לתוך בארות microplate באמצעות נקודה-בורר רובוטית על פי מפרט היצרן, ולהוסיף 100 אמוניום ביקרבונט מ"מ (2 מ"ל) במשך שעה 1 ב RT כדי destain החלקים ג'ל. מייבשים עם 2 מ"ל 100% אצטוניטריל ולשטוף פעמיים ויבש בתוך concentrator ואקום למשך 30 דקות.
      2. רעננותם חתיכות ג'ל עם 100 μl של 13 ng / טריפסין חזירי שונה μl ב אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatants ובהמשך לחלץ את החלבונים עם 100 μl של חומצה 5% trifluoroacetic ב אצטוניטריל 50% למשך 30 דקות.
      3. תתרכז פפטידים עד 5 μl ידי concent צנטריפוגות ואקוםrator ולנתח עם מטריקס בסיוע יינון Desorption לייזר - זמן של טיסה - טנדם ניתוח ספקטרומטריית מסה (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. ב assay קינאז Vitro

  1. הכנת מצעים
    1. יחידות משנה Sub-שיבוט קומפלקס אני (CI) (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, ו NDUFA12), אשר מזוהים כמטרות Cdk1 פוספורילציה דיפרנציאלי, לתוך וקטור pGEX-5X-1 כדי ליצור גלוטתיון-S-transferase (GST) -tagged ביטוי חיידקי פלסמידים 11. לטהר יחידות משנת CI באמצעות עמודות גלוטתיון גבוהה זיקה בעקבות הפרוטוקול להלן.
      1. תרבות GST-tagged למקטע CI המכיל Escherichia coli זן BL-21 ב לוריא- Bertani (LB) מרק עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין שייקר ב 37 מעלות צלסיוס עד צפיפות אופטית (OD) של 0.6 הושג. הוספת איזופרופיל- BD-thio-galactopyranoside (IPTG) לפולחןיור בריכוז סופי של 0.1 מ"מ, ו דגירה במשך שעה 3 נוספת.
      2. צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות כדי לאסוף את החיידקים מחדש להשעות ב 5 מ"ל של 1 x חיץ PBS המכיל 5 מ"מ של DTT, 1 x מעכב proteinase קוקטייל, ו -0.1% ליזוזים. Lyse את התאים על ידי sonication במשך עשרים 5 ים התפרצויות, ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות.
      3. איסוף supernatant ו דגירה עם חרוזים 4B agarose-גלוטתיון ביחס נפח של 4: 1 (supernatant: חרוז) במשך שעה 1 ב RT.
      4. Elute החלבונים-היתוך GST מן החרוזים עם 3 מ"ל של חיץ elution גלוטתיון (10 מ"מ מופחת הגלוטתיון 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) ובכפוף החלבונים eluted לדיאליזה בצינור קרום נקבובי מולקולרית (משקל מולקולרי חתוכים 12 -14 kiloDaltons) עם 1 x PBS / 1 mM EDTA. אחסן את החלבונים המטוהרים ב - 80 מעלות צלסיוס
  2. Assay קינאז Cdk1
    1. לפני תחילת תחת קינאזאיי, להגדיר אבני חימום עד 30 מעלות צלזיוס ו 100 מעלות צלזיוס. מסחר CyclinB1 / Cdk1 אנזים הפשרה מורכב מצעים על קרח.
    2. מכינים את תערובת התגובה על הקרח. מאז 32 איזוטופ P ATP מעורב, להכין את כל תערובות התגובה ב 1.5 מ"ל דוגמיות עם פקקי הברגה המכיל טבעת O כדי למנוע התפשטות של רדיואקטיביות.
      זהירות: פעל על פי כללי הגנת חומר רדיואקטיבי. השתמש פרספקס עבה 8 מ"מ מגן ולעבוד לפחות כאורך זרוע. נגב את כל שטח מזוהם עם מים.
    3. הכן חיץ התגובה 30 μl המכיל 1 x חיץ Cdk1 (50 mM Tris-HCl, 10 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ DTT, 1 מ"מ EGTA, 0.01% בריג 35, pH 7.5), 0.6 מ"מ ATP קר, 0.1 ATP μCi 32 P, 2 יחידות של CyclinB1 / Cdk1 ו -6 מיקרוגרם של חלבון המצע. כוון את עוצמת הקול עד 30 μl עם DDH 2 O. לקבלת תגובת בקרה חיובית, להחליף את המצע עם 0.01 מ"מ היסטון H1, מצע ידוע CyclinB1 / Cdk1.
      1. עבור מערכות בכל שליליותl תגובות, (1) להחליף את המצע עם חלבון GST בלבד (2) להחליף את המצע עם 0.01 מ"מ היסטון H1 + 0.5 מיקרומטר RO-3306, מעכב Cdk1 סלקטיבית.
    4. מערבבים היטב עם פיפטה צנטריפוגות להביא את כל הנוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
    5. הוסף 6 μl של חיץ מדגם 5x SDS כדי לעצור את התגובה ו לפגל ב 100 מעלות צלסיוס למשך 10 דקות. הפעל דגימות על ג'ל 10% SDS-PAGE 160 V עבור שעה 2, או עד בחזית לצבוע הגיע לסוף של הג'ל. העבר ג'ל על גבי נייר כרומטוגרפיה ועוטפים בניילון נצמד.
      זהירות: כל הנוזל במגע עם רדיואיזוטופים יש להתייחס כאל פסולת רדיואקטיבית מסולק קרונית פולי 5 ליטר הניתנת על ידי שירותי בריאות ובטיחות הסביבה בהתאם להנחיות מוסדיות.
    6. לחשוף את הג'ל אל הסרט רנטגן עבור 1 יום או עד 1 שבוע ב -20 o C בהתאם לפעילות הספציפית של radioisotope המשמשואת האנזים.

8. אתר המכוון mutagenesis כדי ליצור Cdk1 השלילי הדומיננטי (D146N)

  1. פריימרים mutagenesis עיצוב; שני פריימרים, משלימים אחד את השני, המכיל באתר המוטציה (G יוחלף נוקלאוטיד לקידוד N במקום חומצת D אמינו) מוקפת 20 בסיסים בכל צד 11.
  2. הכן תגובת שרשרת פולימראז 50 μl תערובת (PCR) המכיל מאגר התגובה 1x, 2.5 מ"מ dNTPs, 10 מיקרומטר של פריימרים (שניהם קדימה הפוכה), 40 ng של התבנית, ו DDH 2 O. להוסיף 2.5 U של פולימראז ה- DNA לתוך התגובה.
  3. הפעל את תוכנית ה- PCR הבאה: 95 ° C 3 דקות, 95 ° C 30 שניות, 55 ° C 30 דקות, 68 ° C 6 דקות; 16 מחזורים (הערה: 68 ° C זמן דגירה נקבעים על ידי הגודל של ה- DNA 1 דקות / kb נדרש DNA ≤ 10 kb עבור DNA הגדול, 2 דקות / kb פלוס 10 שניות בכל מחזור..). עקוב על ידי 68 ° C 7 דקות והחזיקו על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
  4. לְהוֹסִיף2 μl של אנזים הגבלה DPN אני (10 U / μl) ו -5.7 DPN μl אני חיץ, ומערבבים היטב עם טפיחה קלה באצבע דגירה התגובה על 37 מעלות צלסיוס במשך שעה 1.
  5. העברת 10 μl DPN שאני שטופלתי מוצרי ה- PCR לתוך 50 μl של תאים מוסמכים DH5α לטרנספורמציה. דגירה על קרח למשך 30 דקות, ואחריו 45 שניות חום זעזוע 42 מעלות צלסיוס ו -5 דקות על קרח. הוסף 500 μl של LB ולנער ב 37 o צלזיוס במשך שעה 1. לפני ציפוי לצלחות LB-אגר. דגירה O / N ב 37 o C.
  6. פיק מושבה מן O / N גדל צלחות אגרו באמצעות קצה פיפטה צהוב סטרילי, ושחרר את הקצה לתוך שפופרת המכילה 5 מיליליטר של LB, ולגדול O / N שייקר C 37 o. לבודד פלסמיד באמצעות ערכת miniprep ורצף הפלסמיד כדי לאשר את המוטציה על פי פרוטוקול של היצרן.

9. קביעת אורכי שלב מחזור התא עם Assay התאגדות edu

  1. מיון תא
    1. Transfect 2 x 10 5 תאים עם וקטורים המצוין (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-RFP או MTS-Cdk1-DN-RFP) בצלחת 6-גם באמצעות 1: 2 (w: נ היחס בין ה- DNA 5 μl): 2.5 מיקרוגרם תערובת מגיב transfection ערוכים 2.5 מ"ל serum- ומדיה תרבות חופשית אנטיביוטי במשך 48 שעות. תאים מסוג חי ביציבות המבטא את Cdk1 ו RFP-tagged GFP-tagged חלבונים CyclinB1 באמצעות זרימת cytometer.
      1. שטוף תאים עם 1 x PBS, להוסיף 100 μl של טריפסין לתוך הצלחת לדגור על 37 מעלות צלסיוס למשך 5 דקות. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות לאסוף התאים ולהעביר אותם דרך מסנן 70 מיקרומטר כדי ליצור השעית תא בודדת. שטוף את השעית התא הבודדה עם 500 μl של 1% עוברי עגל בסרום PBS (FCS / PBS) לפני טעינתם על cytometer זרימה.
      2. הגדרת פרמטרי המיון הבא פרוטוקולים הוקמו 18 gating עבור תאים חיוביים כפולים מוכתמים הוא GFP ו RFP. אוספים את התאים מסודרים יוצא של cytometer לתוך contai צינורתרבית תאים בינוניים נינג ולהשתמש תאים אלה לניתוח של התקדמות מחזור התא עם תיוג הדופק מרדף edu כמו בפרוטוקול 9.2.
  2. מדידת אורך מחזור התא באמצעות assay cytometry זרימת edu התיוג
    1. זרע מסודר תאים 6 צלחות גם בצפיפות של 2.5 x 10 5 תאים לכל טוב והתרבות O / N ב 37 מעלות צלסיוס ב CO 2 באינקובטור. להוסיף edu עד בינוני התרבות בריכוז סופי של 25 מיקרומטר. לדגור על 37 מעלות צלסיוס ב CO 2 באינקובטור במשך שעה 1.
    2. שטפו תאים עם BSA 1% ב 500 μl PBS ולאסוף אותם צינור 1.5 מ"ל ב 2 מרווחי hr עבור סכום כולל של 10 - 12 שעות.
    3. תאים צנטריפוגה ב XG 350 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant. לעקור את הכדור על ידי הוספת 100 μl של פתרון תיקון (המסופקים על ידי היצרן בתוך ערכת תיוג EDU) במשך 15 דקות ב RT ומערבבים היטב.
    4. שטפו תאים עם 1 מ"ל של BSA 1% ב שלוש פעמים PBS. תקן אתהתאים שוב עם 0.5 מ"ל של אתנול 70% O / N ב 4 מעלות צלסיוס
      הערה: תיקון אתנול הוא קריטי כדי להרוות את קרינת GFP / RFP הפנימי בשל ביטוי חלבון רקומביננטי מתויג.
    5. צנטריפוגה התאים שוב ב XG 350 במשך 5 דקות לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל של 1 BSA% ב PBS פעם. Re- להשעות את התאים 1 מ"ל של חיץ permeabilization (0.1% Triton-X-100, 1% BSA, 0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase ב PBS) במשך 20 דקות ב RT.
    6. שטפו תאים עם 1 מ"ל של BSA 1% PBS פעם. הוסף 0.5 מ"ל של קוקטייל התגובה לתוך צינור אחד ומערבבים היטב. דגירת תערובת תגובה ב RT במשך 30 דקות בחושך.
    7. לשטוף עם 1 מ"ל של BSA 1% PBS פעם ו- DNA כתם עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​propidium יודיד (PI) ב BSA 1 מ"ל של 1% ב PBS.
    8. לנתח את התאים על ידי cytometry זרימה לעקוב האוכלוסייה חיובית-EDU. עלילת נקודת הפיזור נוכחית של תאים שכותרתו edu מוכתמים עבור תוכן DNA (מכתים PI, ציר ה- X) ו EDU (Alexa 647 מכתים, ציר Y).
      1. השתמש בערוץ APC עבור אלכסa647-EDU ניצול מסנן מעביר פס 670/30 עם כל האור הקיים פחות מ 685 ננומטר להכות מסנן; ו Phycoerythrin (PE) ערוץ PI עם מסנן מעביר פס 581/15 מול זה עם כל האור הקיים פחות מ -600 ננומטר להכות מסנן זה.
      2. הכנס את התאים המכילים הצינור הראשון לתוך זרם cytometry ולהשתמש אסטרטגיה gating תקן הרכישה: מגרש FSC-פינת X SSC-Area עבור מורפולוגיה ואחריו PI (ערוץ PE) X Alexa647-EDU (ערוץ APC) עבור מכתים התא. נתוני שיא לכל צינורות האחד אחד רכישת 10,000 אירועים לדגימה.
      3. קבע את חלוקת השלב במחזור התא של התאים ואורך שלב באמצעות זרימה cytometry תוכנה לניתוח הנתונים הבאים פרוטוקולים הוקמו 11,30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לוקליזציה תת-המיטוכונדריה של CyclinB1 ו Cdk1

מיצוי סודיום קרבונט משמש כדי לקבוע אם חלבון נמצא בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח החיצוניים, כלומר הממברנה חיצונית. לאחר חלבון מוצג למקם בתוך המיטוכונדריה, נחישות נוספת של לוקליזציה משנה המיטוכונדריה יכולה להתבצע באמצעות mitoplasting בשילוב עם עיכול פרוטאז. כדי לציין את לוקליזציה המשנה ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו חלבונים המיועדים אברונים subcellular אחרים, החלבונים ממוקד המיטוכונדריה להחזיק אותות מיקוד בתוך המבנה הראשוני או המשני שלהם כי להפנות אותם אברון בסיוע translocating חלבון משוכלל מכונות קיפול 21,22. המיטוכונדריה מיקוד רצפים (MTS) המתקבל חלבונים תושב המיטוכונדריה בלעדי כגון COX8 ניתן להוסיף N הסופית- של כל רצף גנטי כדי למקד חלבונים ספציפיים לתוך המיטוכונדריה 11,23,24. הנה, גנים CyclinB1 ו Cdk1 היו משובטים לתוך MTS COX8 המכיל וקטורים על הביטוי, CyclinB1 רקומ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH CA133402, CA152313 ומשרד המדע של משרד האנרגיה DE-SC0001271. אנו מודים למעבדת המשאבים המשותפים של אוניברסיטת קליפורניה דייוויס עם מימון מ-NCI P30 CA0933730, ומענקי NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 ו-S10 RR 026825 ובסיוע טכני של גב' ברידג'ט מקלפלין ומר ג'ונתן ואן דייק על עזרתם בניסויי ציטומטריית הזרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP פרקיןאלמרBLU002001MC 
נוגדן משני נגד עכבריםInvitrogen A-11003Alexa-546
נוגדן משני מצומד נגד ארנבInvitrogen A11029Alexa-488 מצומד
ATP מחקר אורגני1166Aלבדיקת קינאז במבחנה
Cdk1 נוגדןאיתות תאים9112
Cdk1 מאגר קינאזניו אינגלנד BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת הדמיהLife TechnologiesC10337לניתוח מחזור תא עם תיוג
EdUCOX IV נוגדןאיתות תאים טכנולוגיה4844Sלצביעה חיסונית מיטוכונדריאלית
נוגדן ציקלין B1 סנטהקרוז ביוטקsc-752
קומפלקס אנזים CyclinB1 / Cdk1ניו אינגלנד BiolabsP6020Sהימנע מהקפאה / הפשרה
ערכת תיוג CyDye DIGE פלואורHealthcare מדעי החיים25-8009-83
ערכת חיץ ג'ל DIGE ו- DIGEGE בריאות מדעי החיים28-9480-26 AA
דימתילפורממיד Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004למוטגנזה מכוונת אתר
Dpn I אנזיםStratagene200519-53למוטגנזה מכוונת אתר
נוזל כיסוי רצועה יבשהGE Healthcare מדעי החיים17-1335-01משמש כשמן מינרלי
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
רכז ואקופוגה אפנדורףפישר סיינטיפיק07-748-13משמש כרכז צנטריפוגות ואקום
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01פתרון הרכבה נגד דהייה
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908למחזור התא ניתוח עם תיוג EdU
היסטון H1Calbiochem382150לבדיקת קינאז במבחנה
ערכת מיצוי ג'ל QIAquickQiagen28704לטיהור שברי DNA מג'ל אגרוז
ג'לים Immobiline DryStrip GEHealthcare Life Sciences18-1016-61רצועות IEF (מיקוד איזואלקטרי)
Immobilized GlutathioneThermo Scientific15160חרוזי גלוטתיון-אגרוז
יודואצטמידסיגמא אולדריץ'I1149IAA
IPGphor 3 יחידת מיקוד איזואלקטריתGE Healthcare Life Sciences11-0033-64מחזיקי רצועות IPGphor
איזופרופיל-b-D-תיו-גלקטופיראנוזיד RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783עבור מאגר ליזה תאים
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027מגיב טרנספקציה
ליזיןסיגמא אולדריץ'L5501עבור תיוג CyDye
LysozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker אדום/ירוקInvitrogen M7512/M7514צבעי פלורסנט מיטוכונדריאלים
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1וקטור מבטא GFP
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53וקטור מבטא GST
פנילמתיל-סולפוניל פלואורידשלטון סיינטיפיקIB01090-PMSF
פוספט חוצץמלח Life Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 צינורות דיאליזהספקטרום מעבדות132700כצינורות ממברנה נקבובית לדיאליזה
Pro-Q יהלום פוספופרוטאין כתם ג'לLife TechnologiesP-33300לצביעה של פוספופרוטאינים על ג'לים דו-ממדיים
קוקטייל מעכב פרוטאינאזCalbiochem539134למאגר ליזה של תאים
ערכת מוטגנזה מכוונת אתר QuikChangeStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104ערכת בידוד פלסמיד MiniPrep
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1 מעכב
RotenoneMP Biomedicals150154קומפלקס I מעכב
נתרן פחמתיFisher ScientificS93359
נתרן כלוריEMD כימיקליםSX0420-5עבור תאים ליזה מאגר
נתרן אורתוואנדאטMP ביו-רפואי159664עבור תאים ליזה מאגר
נתרן פירופוספט decahydrateAlfa Aesar33385עבור מאגר ליזה של תאים
נתרן ובטא;-גליצרופוספטAlfa AesarL03425עבור מאגר ליזה של תאים
SpectraMax M2e מכשירים מולקולרייםM2Eקורא מיקרופלייט
סוכרוזפישר מדעי57-50-1
מטחנת רקמות עליקימבל צ'ייס885301-0007לבידוד מיטוכונדריה
צינור מטחנת רקמותקימבל צ'ייס885303-0007לבידוד מיטוכונדריה
תמיסת חומצה טריכלורואצטיתסיגמא אולדריץ'T0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09סורק ג'ל לייזר עבור 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
טכנולוגיית GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341(2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles