Method Article

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שלמיטוכונדריה יש מנגנון שעתוק משלהם, רק 1% מהחלבונים המיטוכונדריאלים מסונתזים בתוך האברון. החלבונים המקודדים בגרעין מועברים למיטוכונדריה בהנחיית רצפי המטרה של המיטוכונדריה שלהם (MTS); עם זאת, לרוב החלבונים המקומיים במיטוכונדריה חסר MTS הניתן לזיהוי. עם זאת, העובדה ש-MTS יכול להורות לחלבונים להיכנס למיטוכונדריה מספקת כלי רב ערך לחקר תפקודי המיטוכונדריה של חלבונים גרעיניים ו/או ציטופלזמיים בדרך כלל. לאחרונה זיהינו את קומפלקס מחזור התא קינאז CyclinB1/Cdk1 במיטוכונדריה. כדי לחקור באופן ספציפי את התפקודים המיטוכונדריאלים של קומפלקס זה, ביטוי יתר של המיטוכונדריה והפלת קומפלקס זה מבלי להפריע לתפקודיו הגרעיניים או הציטופלזמיים היו חיוניים. על ידי תיוג CyclinB1/Cdk1 עם MTS, הצלחנו להשיג ביטוי יתר מיטוכונדריאלי של קומפלקס זה כדי לחקור את המטרות המיטוכונדריאליות שלו כמו גם את התפקודים שלו. באמצעות תיוג Cdk1 שלילי דומיננטי עם MTS, עיכוב פעילות Cdk1 הושג במיוחד במיטוכונדריה. מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות של קומפלקס CyclinB1/Cdk1 זוהו באמצעות גישת פרוטאומיקה מבוססת ג'ל. בניגוד לניתוח ג'ל דו-ממדי מסורתי, השתמשנו בטכנולוגיית אלקטרופורזה של ג'ל הפרש דו-ממדי (2D-DIGE) ואחריה צביעת פוספופרוטאין כדי לתייג באופן פלואורסצנטי חלבונים זרחניים דיפרנציאלית בתאים המבטאים Cdk1 מיטוכונדריאלי. זיהוי כתמי פוספופרוטאין ששונו בסוג בר לעומת מיטוכונדריה שלילית דומיננטית הנושאת Cdk1 חשף את זהות המטרות המיטוכונדריאליות של Cdk1. לבסוף, כדי לקבוע את ההשפעה של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של CyclinB1/Cdk1 בהתקדמות מחזור התא, נעשה שימוש בבדיקת התפשטות תאים באמצעות אנלוגי תימידין סינתטי EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) כדי לנטר את התאים כשהם עוברים במחזור התא ולשכפל את ה-DNA שלהם. בסך הכל, הדגמנו מגוון גישות זמינות לחקר לוקליזציה ופעילות מיטוכונדריאלית של קינאז במחזור התא. אלה שיטות מתקדמות, אך קלות לביצוע, שיועילו לחוקרים רבים בביולוגיה של התא.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביונקים, התקדמות מחזור התא תלויה אירועים הורה מאוד בשליטת cyclins ו קינאזות תלויות-ציקלין (Cdks) 1. באמצעות ציטופלסמית שלה, גרעיני, ולוקליזציה centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 הוא מסוגל לסנכרן אירועים שונים מיטוזה כמו התפרקות מעטפת הגרעין ואת centrosome ההפרדה 2. CyclinB1 / Cdk1 ומגן על התאים mitotic נגד אפופטוזיס 3 ומקדם ביקוע המיטוכונדריה, צעד קריטי עבור חלוקה שווה של המיטוכונדריה לתאי הבת שהוקמה זה עתה 4.

בשינה מתרבה בתאי יונקים, המיטוכונדריה ATP מופק באמצעות זירחון חמצונים (OXPHOS) מכונה (שרשרת העברת אלקטרונים), אשר ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניתוק של המיטוכונדריה מ תאים בתרבית

  1. הכנת בידוד ההצפה עבור תאים (IBC) חוצץ
    1. הכן 0.1 M טריס / מגבים (טריס (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (-morpholino N) חומצה propanesulfonic): ממיסים 12.1 גרם של טריס ב 800 מ"ל מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 7.4 באמצעות אבקת מגבים, להוסיף מים מזוקקים לסך נפח של 1 ליטר ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס
    2. הכן 0.1 M EGTA (bis אתילן גליקול (2-ami....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לוקליזציה תת-המיטוכונדריה של CyclinB1 ו Cdk1

מיצוי סודיום קרבונט משמש כדי לקבוע אם חלבון נמצא בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח החיצוניים, כלומר הממברנה חיצונית. לאחר חלבון מוצג למקם בתוך המיטוכונדריה, נחישות נוספת של לוקליזציה משנה המיטוכונדריה יכולה להתבצע באמצעות mitoplasting בשילוב עם עיכול פרוטאז. כדי לציין את לוקליזציה המשנה ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו חלבונים המיועדים אברונים subcellular אחרים, החלבונים ממוקד המיטוכונדריה להחזיק אותות מיקוד בתוך המבנה הראשוני או המשני שלהם כי להפנות אותם אברון בסיוע translocating חלבון משוכלל מכונות קיפול 21,22. המיטוכונדריה מיקוד רצפים (MTS) המתקבל חלבונים תושב המיטוכונדריה בלעדי כגון COX8 ניתן להוסיף N הסופית- של כל רצף גנטי כדי למקד חלבונים ספציפיים לתוך המיטוכונדריה 11,23,24. הנה, גנים CyclinB1 ו Cdk1 היו משובטים לתוך MTS COX8 המכיל וקטורים על הביטוי, CyclinB1 רקומ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH CA133402, CA152313 ומשרד המדע של משרד האנרגיה DE-SC0001271. אנו מודים למעבדת המשאבים המשותפים של אוניברסיטת קליפורניה דייוויס עם מימון מ-NCI P30 CA0933730, ומענקי NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 ו-S10 RR 026825 ובסיוע טכני של גב' ברידג'ט מקלפלין ומר ג'ונתן ואן דייק על עזרתם בניסויי ציטומטריית הזרימה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP פרקיןאלמרBLU002001MC 
נוגדן משני נגד עכבריםInvitrogen A-11003Alexa-546
נוגדן משני מצומד נגד ארנבInvitrogen A11029Alexa-488 מצומד
ATP מחקר אורגני1166Aלבדיקת קינאז במבחנה
Cdk1 נוגדןאיתות תאים9112
Cdk1 מאגר קינאזניו אינגלנד BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת הדמיהLife TechnologiesC10337לניתוח מחזור תא עם תיוג
EdUCOX IV נוגדןאיתות תאים טכנולוגיה4844Sלצביעה חיסונית מיטוכונדריאלית
נוגדן ציקלין B1 סנטהקרוז ביוטקsc-752
קומפלקס אנזים CyclinB1 / Cdk1ניו אינגלנד BiolabsP6020Sהימנע מהקפאה / הפשרה
ערכת תיוג CyDye DIGE פלואורHealthcare מדעי החיים25-8009-83
ערכת חיץ ג'ל DIGE ו- DIGEGE בריאות מדעי החיים28-9480-26 AA
דימתילפורממיד Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004למוטגנזה מכוונת אתר
Dpn I אנזיםStratagene200519-53למוטגנזה מכוונת אתר
נוזל כיסוי רצועה יבשהGE Healthcare מדעי החיים17-1335-01משמש כשמן מינרלי
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
רכז ואקופוגה אפנדורףפישר סיינטיפיק07-748-13משמש כרכז צנטריפוגות ואקום
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01פתרון הרכבה נגד דהייה
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908למחזור התא ניתוח עם תיוג EdU
היסטון H1Calbiochem382150לבדיקת קינאז במבחנה
ערכת מיצוי ג'ל QIAquickQiagen28704לטיהור שברי DNA מג'ל אגרוז
ג'לים Immobiline DryStrip GEHealthcare Life Sciences18-1016-61רצועות IEF (מיקוד איזואלקטרי)
Immobilized GlutathioneThermo Scientific15160חרוזי גלוטתיון-אגרוז
יודואצטמידסיגמא אולדריץ'I1149IAA
IPGphor 3 יחידת מיקוד איזואלקטריתGE Healthcare Life Sciences11-0033-64מחזיקי רצועות IPGphor
איזופרופיל-b-D-תיו-גלקטופיראנוזיד RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783עבור מאגר ליזה תאים
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027מגיב טרנספקציה
ליזיןסיגמא אולדריץ'L5501עבור תיוג CyDye
LysozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker אדום/ירוקInvitrogen M7512/M7514צבעי פלורסנט מיטוכונדריאלים
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1וקטור מבטא GFP
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53וקטור מבטא GST
פנילמתיל-סולפוניל פלואורידשלטון סיינטיפיקIB01090-PMSF
פוספט חוצץמלח Life Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 צינורות דיאליזהספקטרום מעבדות132700כצינורות ממברנה נקבובית לדיאליזה
Pro-Q יהלום פוספופרוטאין כתם ג'לLife TechnologiesP-33300לצביעה של פוספופרוטאינים על ג'לים דו-ממדיים
קוקטייל מעכב פרוטאינאזCalbiochem539134למאגר ליזה של תאים
ערכת מוטגנזה מכוונת אתר QuikChangeStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104ערכת בידוד פלסמיד MiniPrep
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1 מעכב
RotenoneMP Biomedicals150154קומפלקס I מעכב
נתרן פחמתיFisher ScientificS93359
נתרן כלוריEMD כימיקליםSX0420-5עבור תאים ליזה מאגר
נתרן אורתוואנדאטMP ביו-רפואי159664עבור תאים ליזה מאגר
נתרן פירופוספט decahydrateAlfa Aesar33385עבור מאגר ליזה של תאים
נתרן ובטא;-גליצרופוספטAlfa AesarL03425עבור מאגר ליזה של תאים
SpectraMax M2e מכשירים מולקולרייםM2Eקורא מיקרופלייט
סוכרוזפישר מדעי57-50-1
מטחנת רקמות עליקימבל צ'ייס885301-0007לבידוד מיטוכונדריה
צינור מטחנת רקמותקימבל צ'ייס885303-0007לבידוד מיטוכונדריה
תמיסת חומצה טריכלורואצטיתסיגמא אולדריץ'T0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09סורק ג'ל לייזר עבור 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
טכנולוגיית GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles