מאמר שיטה

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 בנובמבר 2015

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסלולים מטבוליים ספציפיים מוכרים יותר ויותר כסימני היכר קריטיים של תת-קבוצות מקרופאגים. בעוד שמקרופאגים M1 או M(LPS) המופעלים באופן קלאסי המושרים על ידי LPS הם פרו-דלקתיים, IL-4 גורם להפעלת מקרופאגים חלופיים ואלה המכונים M2 או M(IL-4) תומכים בהעלמת דלקת וריפוי פצעים. עדויות עדכניות מראות את התפקיד המכריע של תכנות מחדש מטבולי בוויסות קיטוב מקרופאגים M1 ו-M2.

בכתב יד זה, מנתח שטף חוץ-תאי מיושם כדי להעריך את המאפיינים המטבוליים של מקרופאגים נאיביים, M1 ו-M2 מקוטבים מעצם עכבר. מכשיר זה משתמש בחיישני pH וחמצן כדי למדוד את קצב החמצה החוץ-תאית (ECAR) וקצב צריכת החמצן (OCR), שיכולים להיות קשורים למטבוליזם חמצוני גליקוליטי ומיטוכונדריאלי. ככזה, ניתן למדוד גם גליקוליזה וגם מטבוליזם חמצוני מיטוכונדריאלי בזמן אמת בבדיקה אחת.

באמצעות טכניקה זו, אנו מדגימים כאן כי מקרופאגים M1 דלקתיים מציגים חילוף חומרים גליקוליטי משופר ופעילות מיטוכונדריאלית מופחתת. לעומת זאת, מקרופאגים M2 אנטי דלקתיים מראים זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי גבוה (OXPHOS) ומאופיינים ביכולת נשימה רזרבית משופרת (SRC).

הבדיקה הפונקציונלית המוצגת משמשת כמסגרת לחקירת האופן שבו ציטוקינים מסוימים, תרכובות פרמקולוגיות, נוק-אאוט של גנים או התערבויות אחרות משפיעים על הפנוטיפ המטבולי של המקרופאג ועל המצב הדלקתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי כמעט בכל מחלות, המנגנונים המולקולריים המווסתים את הפנוטיפ שלהם הם עדיין לא פרומים באופן מלא. המקרופאגים להציג גבוהה ההטרוגניות ובתגובה למייקרו-הסביבה לאמץ פנוטיפים שונים 1. LPS (+ IFNγ) -induced מופעל קלסי מקרופאגים M1 או M (LPS) לקדם ולהגן על דלקת המארח נגד סוגים שונים של איומי חיידקים 2. אחרים משתמשים IFNγ לבד או בשילוב עם TNF כגירויים לעורר קיטוב M1. IL-4 ו / או IL-13 גורם הפעלת מקרופאג חלופית וM2 אלה או M (IL-4) תאי מדכאי ובקרים של תגובות חיסוני מתמשכות 3 חזקים. מקרופאגים מקוטבים להציג רגולציה שונה של חילוף חומרים תאיים עם מקרופאגים M1 מופעלים-LPS עוברים מתג חילוף חומרים לגליקוליזה המשופרת 4-6. חמצון של חומצות שומן לעומת זאת, משופרים (FAO) וoxidativ המיטוכונדריהזירחון הדואר (OXPHOS) מספק אנרגיה מתמשכת במקרופאגים M2 מושרה-IL-4 7-9. לפיכך, חילוף חומרים משתנים הוא לא רק מאפיין של תת מקרופאג מקוטב, הוא גם תנאי מוקדם לקיטוב נכון ורגולציה דלקתית. חשוב לציין, העיכוב של גליקוליזה או OXPHOS / FAO הודגם לפגוע בהפעלת M1 או M2, בהתאמה 8,10. ככזה, שינויים מטבוליים זיהוי במקרופאגים יכולים להיות מיושמים ככלי להערכת מצב הקיטוב שלהם ופוטנציאל דלקתי.

Assay עקבי המודד את חילוף החומרים מקרופאג לכן יכול לשמש כדי לחזות אם תרופה, גן להפיל או טיפול אחר משפיע על קיטוב מקרופאג ותפקוד. בסרטון הזה, מנתח שטף תאי משמש כדי לאפיין את פרופילי bioenergetics של מקרופאגים הנאיביים, M1 ו- M2.

כתב יד זה מפרט פרוטוקול מותאם המאפשר המדידהשל כל הפרמטרים הרלוונטיים גליקוליזה (גליקוליזה, גליקוליזה המקסימלי ומילואים glycolytic) ומאפיינים של המיטוכונדריה פונקציה (נשימה כוללת, נשימה המיטוכונדריאלי בסיסית, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלי ויכולת נשימה חילוף) בassay אחד. השימוש בהגדרת ניסוי זה, ניתן להשוות בין bioenergetics שליטה ו'שינה '(למשל גן להפיל, ביטוי יתר מהונדס או טיפול תרופתי) תאים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. המקרופאגים נגזר מח Culturing ומקטב עצם

  1. יום 0: עצם ירך לבודד ושוקת עצמות מעכברים ישנים 6-10 שבוע של עניין (C57Bl / 6 בassay זה).
  2. הסרה של רקמת שריר מהעצמות ומניחים את העצמות בצלחת פטרי 9 סנטימטרים מלאים PBS קר כקרח.
  3. העבר את העצמות לצלחת 9 סנטימטרים פטרי מלא עם 70% אתנול ונער בעדינות את הצלחת למשך 30 שניות.
  4. העבר את העצמות בצלחת פטרי טרי 9 סנטימטר המלא PBS סטרילי קר כקרח.
  5. חותך את עצם הירך ועצם שוק בשני הקצוות עם מספריים סטרילי.
  6. לשטוף את העצמות עם 10 סטרילי PBS קר כקרח מיליליטר באמצעות מזרק 10 מיליליטר ומחט 25 G. לאסוף את מח העצם בשפופרת 50 מיליליטר.
  7. להעביר את תאי מח עצם לצינור 50 מיליליטר חדש באמצעות מחט 23 G.
  8. חזור על שלב זה עם מחט 25 G. הערה: יש צורך בצעדים אלה כדי להסיר גושי תא ושאריות עצם.
  9. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. מחק את supernatant וresuspend התאים במדיום 40 מיליליטר תא תרבות (RPMI-1640 בתוספת L- גלוטמין 2 מ"מ, FCS 10%, פניצילין (100 U / ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -15% תא מסונן L-929 ( ATCC, CCL-1) בינוני זו מציעה המכיל M-CSF (או לחלופין 10 M-CSF רקומביננטי ng / ml במקום L-929 בינוניים-מותנה תא).
    הערה: הדור של מדיום ממוזג תא L-929 היה מפורט קודם לכן בכתב עת זה בשינה 2013. 11
  11. תרבות התאים מעכבר אחד בשתי 15 סנטימטרים צלחות פטרי (לא משתמש בצלחות שטופלה תרבית תאים מאז מקרופאג לא להתנתק מפלסטיק זה) ב 20 מיליליטר בינוני תרבות לכל צלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
  12. הוסף 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טריות ביום 3, מבלי להסיר 20 מיליליטר מדיום תרבית תאים מבוגר.
  13. החלף את המדיום של כל צלחת הישנה עם 20 מיליליטר בינוני תרבות טריות ביום 6. פעולה זו, שאינה חסיד תאים יוסרו גם.
  14. יום 8:
    1. ניתוק תאים על ידי דוגריהם 5 מ 'במלוח על 37 מעלות צלזיוס ב 10 מיליליטר ציטרט (אשלגן כלורי 135 מ"מ בתוספת נתרן ציטרט 15 מ"מ H 2 O, autoclaved) ולשטוף עם 10 מיליליטר PBS. רוזן מקרופאגים עצם בוגר נגזר מח (BMDM) ביום 8 באמצעות דלפק תא.
    2. ודא היווצרות הבוגרת (CD11b + F4 / 80 +) BMDM על ידי בדיקה ויזואלית או על ידי cytometry זרימה. בלוק 10 תאים 5 עם 1/100 אנטי-CD16 / CD32 ב PBS במשך 20 דקות ב 100 μl PBS, דגירה עם 1/200 נגד CD11b-FITC בתוספת 1/200 אנטי-F4 / 80-APC-Cy7 ב RT, לשטוף ולנתח ידי cytometry זרימה.
      הערה: מקרופאגים נגזרות מח עצם עכבר Culturing כבר פורסם בהרחבה קודם לכן בכתב עת זה על ידי et al יינג 11..
  15. תאי זרע 50,000 (ספירת תאים אופטימלית צריכים להיות מותאמים) לכל גם בmicroplate תרבית תאים במדיום תרבות μl 100. אל תאי זרע בבארות תיקון רקע (A1, A12, H1, H12) ולשים בינוניים בלבד (ללא תאים) בבארות אלה טיפ:. החזק את פיפטה בזוויתהתקף באמצע הדרך למטה בצד של הבארות לשכבת תאים הומוגנית ביותר.
  16. אפשר התאים להתיישב על RT במכסת מנוע תרבית תאים עבור שעה 1. זה יקדם גם חלוקת תא ולהפחית את תופעות קצה. צג דבקות באמצעות מיקרוסקופ ותרבות ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
  17. שלוש שעות לאחר הציפוי, לעורר תאים למשך 24 שעות עם 10 ng / ml LPS, או 20 ng / ml עכבר רקומביננטי IL-4 כדי ליצור מקרופאגים M1 או M2, בהתאמה. כוללים מקרופאגים שלא טופלו נאיבי (M0) כביקורת. ו / או MMR (CD206) וMGL ביטוי משטח-arginase 1 פעילות להעריך קיטוב מקרופאג נכון M1 ו- M2 על ידי מדידת הפרשה מושרה LPS של IL-6, IL-12, TNF (ELISA) ו- IL-4-Induced (CD301) (Cytometry זרימה) כפי שתואר קודם לכן 3,11.
    הערה: בשלב זה, תאים יכולים להיות (מראש) -treated עם תרכובות תרופתיות של ריבית או מקרופאגים יכולים להיות מגורה עם גורמים אחרים. מאז, הווריאציה בין בארות נפרדות עשויה להיות צוללותtantial, מומלץ להשתמש לפחות 4 ובאופן אידיאלי 6 בארות לכל מצב.

2. הכנה של assay תאי השטף

  1. מימה מחסנית חיישן יום אחד לפני הפעלת assay:
    1. הנח את מחסנית החיישן הפוך ליד צלחת השירות.
    2. מלא היטב בכל צלחת השירות עם 200 μl של פתרון calibrant ולהפחית את מחסנית החיישן לצלחת שירות הצללה החיישנים בפתרון calibrant.
    3. לוודא את רמת פתרון calibrant היא גבוהה מספיק כדי לשמור על החיישנים שקועים ומקום ב2 37 ° C חממה שאינו CO O / N.
  2. הכן בינוני assay ביום של assay כדלקמן:
    1. בינוני 50 מיליליטר בסיס XF חם עד 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 500 μl L- גלוטמין 200 מ"מ כדי לקבל ריכוז סופי 2 מ"מ.
    3. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ולעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר ולשמור בינוני assay על 37 מעלות צלזיוס.
  3. בעדינות להסיר את מדיום תרבית תאים ממקרופאגים מקוטבים ולאחסן אותו ב -20 ° C לשימוש עתידי (למשל ELISA לבחון קיטוב מקרופאג נכון). שוטפים את התאים עם מדיום assay 100 μl, להוסיף 180 בינוני assay μl לכל גם ולאמת מתחת למיקרוסקופ שתאים לא נשטפו. מניחים את צלחת תרבית תאים בחממה 37 ° C ללא CO 2 עבור שעה 1 לפני ריצת assay.
  4. הכן תערובת 10 x מתחם הזרקה עד D, כמתואר בטבלה 1, חם עד 37 מעלות צלזיוס, להתאים את ה- pH 7.4 ולסנן לעקר.
    1. הפוך את כל התרכובות בתערובות אלה ב10x הריכוז הסופי בבארות תרבית תאים ולייעל את הריכוזים אלה לכל סוג תא.
  5. טען את מחסנית החיישן באמצעות מדריכי הטעינה מסופקים עם כמויות שצוינו (טבלת 1) של 10x תערובות מתחם הזרקה מוכנות בנמלים, B, C ו- D, respectively.
תערובת / הזרקה תרכובות נפח הוסיף לקבל 10x תערובת (μl) נפח Assay בינוני (מיליליטר) הנפח המוזרק במהלך הריצה (μl) ריכוז סופי בassay
א 2.5 M (45%) גלוקוז 300 2.7 20 25 מ"מ
B 5 מ"מ oligomycin (OM) 9 3.0 22 1.5 מיקרומטר
ג 5 מ"מ FCCP 9 2.7 25 1.5 מיקרומטר
פתרון 100 מ"מ נתרן פירובט 300 1 מ"מ
D 5 מ"מ antimycin (AA) 15 3.0 28 2.5 מיקרומטר
5 rotenone מ"מ (רוט) 7.5 1.25 מיקרומטר

טבלת 1. תערובות הזרקה.

3. אפיון ביו-אנרגטי של מקוטב M1 ו- M2 BMDM באמצעות תאי שטף Analyzer

  1. צור תבנית assay עם אשף assay עם MIX 2 דקות ו -3 פעמים נמדדו דקות ו( לפחות) 3 מדידות תערובת ושיעור לולאות לפני כל 4 הזריקות (טבלת 1) ולאחר הזריקה האחרונה.
    הערה: ריכוזים אלה תקפים למקרופאגים נגזרות מח עצם ושורות תאי מקרופאג Raw264.7, אבל צריך להיות מותאמים לכל סוג תא. יש צורך בהוספה פירובט בתערובת FCCP דלק נשימה מקסימלי.
  2. התחל את הריצה על ידי לחיצה על תחתית ההתחלה ובצע את ההוראות של המכשיר. עומס ראשון המכוניתצלחת tridge עם בדיקות התייבשות כדי לאפשר כיול על ידי מנגנון והעומס הבא צלחת התא.
  3. לאחר assay, להשליך בזהירות כל מדיום assay ולאחסן microplate תרבית התאים נותח ב -20 ° C לנורמליזציה תא עתיד באמצעות ערכת assay התפשטות תאים כפי שתואר בפירוט על ידי הספק.
    1. בקיצור, להכין חיץ תא תמוגה 1x על ידי דילול הרכיב B פי 20 במים מזוקקים ולדלל מתחם 400-פי במאגר תא תמוגה 1x. הוסף 200 μl לכל גם, דגירה 5 דקות ב RT ולמדוד הקרינה עם ~ 180 ננומטר עירור ו~ 520 מקסימום פליטת ננומטר.
      הערה: כאשר עובדים עם תאים שאינם חסיד או אם דבקות עניה היא דאגה, ערכת התפשטות תאים הישירה יכולה לשמש כחלופה מאז פרוטוקול זה אינו דורש השלכת כל מדיום assay. עם זאת, פרוטוקול ישיר זו הוא מעט פחות רגיש בהשוואה לפרוטוקול המשמש במעבדה זו.
  4. לאחר מדידת הקרינה, לנרמלספירת תאים בכל טוב כיחס שבו ספירת התאים הממוצעת של כל בארות מקרופאג הנאיביים מוגדרת ליום 1 ב.
    הערה: כימות חלבון (למשל באמצעות assay BCA) יכול לשמש כדרך חלופית ללנרמל תאי ספירה. עם זאת, בידיים שלנו assay זה היה פחות רגיש בהשוואה לערכת assay התפשטות תאים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר שסיים את כימות assay ותא שטף תאי, יכולים להיות מנורמלים נתונים לספירת תאים ונותחו. זה בדרך כלל יניב חלקות ECAR וOCR כפי שמוצג באיור 1 א ואיור 1 ב.

לאחר ההזרקה של גלוקוז (), העלייה בECAR מייצגת את שיעור גליקוליזה. עלייה נוספת בECAR לאחר עיכוב synthase ATP עם oligomycin (ב) מספקת מידע על המילואים והקיבולת (איור 1 א) glycolytic. כאשר מנתחים את ערכי OCR, oligomycin הזרקה (ב) מאפשר חישוב של צריכת החמצן המשמשת לסינתזת ATP במיטוכונדריה. FCCP (C) uncouples נשימה המיטוכונדריאלי והמדידות OCR המתאימות להניב נתונים על מקסימאלי ויכולת נשימה חילוף. לבסוף, הזרקה של rotenone (רוט) וantimycin (AA) לחסום אני מורכב המיטוכונדריה ושלישית וOCR השייר מייצג את חסרונות החמצן אינה המיטוכונדריהumption (איור 1).

figure-results-1
איור 1: פרמטרים מטבולית נגזרים מassay שטף XF תאי. () הפרמטרים הבאים של גליקוליזה הסלולרית מחושבים מערכי ECAR (במייל / min): גליקוליזה, קיבולת המרבית glycolytic ומילואים glycolytic. מדידות OCR (ב) (בpmoles / min) משמשות לחישוב הפרמטרים הבסיסיים הבאים של פונקציה של המיטוכונדריה: נשימה בסיסית, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה המרבית ויכולת נשימה חילוף. Gluc = גלוקוז; OM = oligomycin; FCCP = 4 phenylhydrazone ציאניד קרבוניל (trifluoromethoxy); AA = antimycin; רוט = Rotenone אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר הריצה, מדידות ECAR וOCR 1 till 15 לכל אחד גם יכול להיות מיוצא ל- Excel וניתן לחשב את הפרמטרים הבאים glycolytic ממדידות ECAR כדלקמן:

החמצה ללא glycolytic = ממוצע. ECAR (1,2,3)

גליקוליזה = ממוצע. ECAR (4,5,6) - ממוצע. ECAR (1,2,3)

קיבולת המרבית glycolytic = ממוצע. ECAR (7,8,9) - ממוצע. ECAR (1,2,3)

מילואים glycolytic = ממוצע. ECAR (7,8,9) - ממוצע. ECAR (4,5,6)

משיעורי OCR, ניתן לקבוע את מאפייני חילוף החומרים הבאים:

נשימה ללא המיטוכונדריה = ממוצע. OCR (13,14,15)

נשימה בסיסית = ממוצע. OCR (4,5,6) - ממוצע. OCR (13,14,15)

ייצור ATP = ממוצע. OCR (4,5,6) - ממוצע. OCR (7,8,9)

דליפת פרוטון =ממוצע. OCR (7,8,9) - ממוצע. OCR (13,14,15)

נשימה = ממוצע מרבי. OCR (10,11,12) - ממוצע. OCR (13,14,15)

יכולת נשימה חילוף (SRC) = ממוצע. OCR (10,11,12) - ממוצע. OCR (4,5,6)

figure-results-2
איור 2:. מאפייני מטבולית של נאיבי (M0), LPS- (M1) ו- IL-4 (M2) מקרופאגים מקוטבים לכל מדידה, הממוצע וסטיית התקן של הממוצע (SEM) של 8 בארות בודדות מוצג. (א) שיעורי החמצה תאיים (ECAR, במייל לשעה / דקה) ושיעורים (ב) צריכת חמצן (OCR, בpmoles / min) נמדדים למקוטב באופן דיפרנציאלי (M1 ו- M2) ומקרופאגים הנאיביים (M0). כל המדידות היו מנורמלות לספירת תאים (כפי שנמדדו בCyQUANT) וספירת התאים הממוצעת של מקרופאגים הנאיביים נקבעה על 1. בjection = גלוקוז; = Oligomycin B; C = FCCP; D = antimycin + Rotenone. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כפי שניתן לראות באיור 2 א, הפעלת מקרופאג עם LPS משרה על חילוף חומרים מוגבר glycolytic. ההבדלים בין LPS ומקרופאגים שטופלו IL-4 הם עוד יותר נראית לעין כאשר מסתכלים על שיעורי צריכת חמצן (OCR) באיור 2. ואכן, תוך מטבוליזם חמצוני המקסימאלי מדוכא ביותר בM (LPS), IL-4 גורם נשימה בסיסית ומקסימלי במיוחד במקרופאגים M2. יש לציין כי glycolytic המוגבר הוא די ייחודי לM מקרופאגים (LPS) ואינו בהכרח אופייני של מקרופאגים M1 מאז מקרופאגים M (IFNγ) לא להציג לשפר גליקוליזה.

בסך הכל, ניתוח שטף תאי זה מדגים thaהמושרה IL-4 לא מקרופאגים M2 מתאפיינים במטבוליזם חמצוני מוגברים ובמיוחד יכולת נשימה חילוף גבוהה (SRC), ואילו תצוגת מקרופאגים מופעל LPS משופר חילוף חומרים glycolytic ולא מחזיקה שום יכולת נשימה חילוף.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של המעבדה שלנו היא להבין כיצד קיטוב ותפקוד מקרופאג יכולים להיות מושפע במטרה האולטימטיבית כדי לשפר את התוצאה של טרשת עורקים ומצבים דלקתיים אחרים 12. כדי להעריך קיטוב מקרופאג, אחד בדרך כלל מודד את LPS (+ IFNγ) -induced וIL-4-Induced ביטוי גנים של M1 וגני סמן M2 (qPCR), קובע IL-6, IL-12, TNF ואין הפרשה (על ידי ELISA וGriess תגובה) ובוחן CD71, ביטוי CD206, CD273 וCD301 פני השטח (על ידי cytometry זרימה) וarginase פעילות מושרה IL-4 3,13. בנוסף, מבחני אפופטוזיס (על ידי Annexin-V / הכתמת PI), מבחני phagocytosis (עם חרוזי ניאון לטקס ו / או coli pHrodo א) ומבחני היווצרות תאי קצף (על ידי ספיגת DiI-oxLDL, מכתים שומנים ניטראלי LipidTOX) יכולים להתבצע ל להעריך פונקציונלי מקרופאג 14. בנוסף, ניתוח שטף תאי ניתן לבצע כדי למדוד bioenergetics פרופילים של מק מקוטבrophages כקריאת נתונים פונקציונליים חדשה ואלטרנטיביות.

כתב יד זה מראה כי קיטוב מקרופאג גורם תכנות מחדש חילוף חומרים עם מקרופאגים המושרה LPS מעבר לגליקוליזה גדלה כמקור האנרגיה שלהם. לעומת זאת, מקרופאגים M2 מושרה-IL-4 להשתמש זרחון חמצוני המיטוכונדריה כמקור העיקרי של ה- ATP. חשוב לציין, תכנות מחדש חילוף חומרים לא רק מספק אנרגיה לדרישות מסוימות של מקרופאגים מקוטבים M1 ו- M2. ואכן, שינויים מטבוליים משפיעים ריכוזי המטבוליט שרגולטורים ישירים של פנוטיפ מקרופאג 10,15,16. לפיכך, חילוף החומרים מקרופאג הוא לא רק אופייני (כפי שמוצג כאן באיור 2), אלא גם נהג של מצבי קיטוב מקרופאג מובחנים והידע החדש הזה תמך בצמיחה המהירה של תחום מחקר immunometabolism במהלך השנים האחרונות.

עם זאת, מדידות חזקות של פרופילים מטבולים במאקרופאגים נשארו קשים ולא היו להם מגבלות. במחקר זה, מנתח שטף תאי מוחל למדוד גליקוליזה, מילואים glycolytic, קיבולת glycolytic מקסימלי, החמצה שאינה glycolytic, בסיסיים ונשימה מקסימלי, ייצור ATP, יכולת נשימה חילוף, דליפת פרוטון ונשימה אינה המיטוכונדריה בזמן אמת וחסונה בכמות מינימאלית של מקרופאגים.

לכן, אנו שונו ושופרו פרוטוקולים של היצרן כדלקמן. המבחן הסטנדרטי מתח מיטו (# 103,015-100) מציע להשתמש בינוני עם גלוקוז ופירובט ופרוטוקול עם 3 זריקות (OM, FCCP, AA / רוט). אנו בוחרים להתחיל assay עם גלוקוז / בינוני ללא פירובט, להוסיף סוכר כבזריקה ראשונה בנמל (כמו במבחן # מתח גליקוליזה 103,020-100) ולהוסיף פירובט יחד עם uncoupler FCCP בנמל ג בדרך זו , כל הפרמטרים גליקוליזה הרלוונטיים נגזרים ממדידות ECAR 1-9 וכל המידע הרלוונטי אודות mitochondriפונקצית אל ממדידות OCR 4-15.

שים לב שזה קריטי להזריק פירובט יחד עם FCCP דלק נשימה מקסימלי על שחרר. לפני השימוש בפרוטוקול משולב זה, יש גם לוודא ש2-Deoxy-D-גלוקוז (2-DG) מוריד את רמות ECAR לאחר assay לערכים הבסיסיים (1-3) וכי שיעורי ECAR נרשמו 4-6 אכן בשל לגליקוליזה. בנוסף, יש להבין כי ריכוזי המתחם ומספרים סלולריים בשימוש בכתב היד הזה תקפים למקרופאגים נגזרות מח עצם ושורות תאי מקרופאג Raw264.7 וצריך להיות מותאמים לסוגי תאים אחרים. יתר על כן, יש לציין כי M-CSF שמשמש להפקת מקרופאגים נגזרות מח עצם מקדם פנוטיפ אנטי דלקתי כמו-M2. התוצאות שהוצגו ממקרופאגים נגזרות מח העצם עשויות אפוא להיות לא ניתן להשוות באופן מלא למדידות עם מקרופאגים תושב רקמות ראשוניות או מקרופאגים שורות תאים שאינם דורשות M-CSF במהלך culturi תאng.

בהשוואה לשיטות קיימות, פרוטוקול זה דורש כמויות מינימליות של מקרופאגים ומספק במהירות כמעט את כל מאפייני תא חילוף חומרים בסיסיים. כתוצאה מכך מספיק תאים עודפים לבצע מבחני אחרים חיסוניים ואפילו תאים המשמשים לאפיון bioenergetics עדיין יכול לשמש לשני תכליתי לאחר assay. יתר על כן, בפורמט המסוים צלחת 96 גם מאפשר הערכת תנאים מרובים בזמן אמת באותו הזמן. ובכל זאת, הווריאציה בין בארות בודדות יכולה להיות משמעותית ולכן השימוש בלפחות 4 בארות לכל מצב הוא לעתים קרובות רצוי. נלקח בחשבון מגבלה זו, ניתוח השטף תאי תאר עדיין מאפשר להפעיל יותר מ -10 תנאי ניסוי (n = 6) בבת אחת, וזה הרבה יותר מאשר טכניקות מסורתיות.

בסך הכל, מאמר זה מספק assay התפקודי קל ושחזור המאפשר מדידה כל גליקוליזה הרלוונטית ופרמטר המיטוכונדריהאטות בתת מקרופאג מקוטב. טכניקה זו יכולה לשמש כיישום עתיד כדי להעריך את תפקוד מקרופאג ולהעריך את ההשפעה של מניפולציות שונות (להפיל, תרופות חדשות כגון: גן, וכו ') על הפנוטיפ של מקרופאג (חילוף חומרים). ככזה, ניתן להשתמש בנתונים שטף תאיים בשיתוף עם מבחני אחרים, כדי לאפשר אפיון מעמיק של מצב הפעלת מקרופאג.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי סוסון הים Bioscience.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan Van den Bossche קיבל מענק פוסט-דוקטורט מקרן הלב ההולנדית (2013T003) ומענק VENI מ-ZonMW (91615052). מנו דה וינטר הוא חוקר מבוסס של קרן הלב ההולנדית (2007T067), נתמך על ידי מענק של קרן הלב ההולנדית (2010B022) ומחזיק במלגת AMC. אנו מודים גם על התמיכה של יוזמת המחקר הקרדיווסקולרית ההולנדית, הפדרציה ההולנדית של מרכזים רפואיים אוניברסיטאיים, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות והאקדמיה המלכותית ההולנדית למדעים בפרויקט GENIUS "יצירת היעדים התרופתיים מבוססי הראיות הטובים ביותר לטרשת עורקים" (CVON2011-19). אנו מודים ל-Seahorse Bioscience על שאפשרה פרסום בגישה פתוחה. המחברים מודים ל-Riekelt Houtkooper ול-Vincent de Boer (מעבדה למחלות מטבוליות גנטיות, המרכז הרפואי האקדמי, אמסטרדם, הולנד) על כל הסיוע הקודם עם מנתח סוסון הים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחטי 23G ו-25GBecton Dickinson#300800 ו-#300600למח עצם סמוק
מזרקים 10 מ"לBecton Dickinson#307736למח עצם סמוק
צלחות פטריGreiner#639161לתרבית תאי מח עצם
ערכת בדיקת התפשטות תאים CyQUANT בדיקות מולקולריות#C7026לכימות תאים בנקודת זמן מאוחרת יותר (עובד רק עבור תאים נצמדים)
ערכת בדיקת התפשטות תאים ישירה של CyQUANT בדיקות מולקולריות#35011לכימות תאים מיד לאחר הבדיקה (תאים לא דביקים)
XFe96 תרבית תאים מיקרו-צלחתSeahorse Bioscience#101085-00496 צלחת באר שבה מתרבתים תאים ובה נעשית
בדיקה רקומביננטית עכבר אינטרלוקין-4 (IL-4)Peprotech#214-14-Bמשמש להשראת הפעלת
מקרופאגים חלופייםליפופוליסכריד (LPS)סיגמא#L2637גירוי פרו-דלקתי
מחסנית חיישן סוסון ים Seahorse Bioscience#102416-100מכיל את הבדיקות למדידת pH ו-O2
Seahorse XF Calibrant Seahorse Bioscience#100840-000דרוש כדי להרטיב את הגשושיות במהלך הלילה 
בסיס XF בינוני Seahorse Bioscience#102353-100מדיום נטול בופר המאפשר מדידה יעילה של שינויי pH
L-גלוטמיןטכנולוגיות חיים#25030-081
D-(+)-גלוקוזסיגמא#G8769מתדלק גליקוליזה לאחר הוספתו לתאים
אוליגומיצין Aסיגמא#75351מעכב סינתאז ATP מיטוכונדריאלי
FCCP( קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון)סיגמא#C2920מבטל את הנשימה המיטוכונדריאלית
100 מ"מ תמיסת נתרן פירובטLonza#BE13-115Eמאפשר נשימה מיטוכונדריאלית מקסימלית ללא צורך בגליקוליזה
אנטימיצין Aסיגמא#BE13-115EA8674מעכב קומפלקס III של המיטוכונדריה
רוטנוןסיגמא#BE13-115EA8674R8875מעכב קומפלקס I של מיטוכונדריה
Casy Cell CounterRoche Diagnostics#05 651 697 001מכשיר לספירת תאים
נגד CD16/CD32eBioscience#14-0161Fc קולטן לחסום זרימה ציטומטריה
אנטי-F4/80-APC-eFluor780eBioscience#47-4801נוגדן להכתמת מקרופאגים
נגד CD11b-FITCeBioscience#11-0112נוגדן להכתמת מקרופאגים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

M1M2

מאמרים קשורים