Method Article

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

DOI:

10.3791/53437

⸱

December 12th, 2015

1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פני התא של הצמח הם הממשק שלו לתפיסת רמזים סביבתיים; הוא מגיב בשינויים ביולוגיים של התא כגון סחר בממברנות וסידור מחדש של השלד התא. ניתוח תמונה בזמן אמת וברזולוציה גבוהה של אירועים תוך-תאיים כאלה יגביר את ההבנה של הביולוגיה של תאי הצמח ברמה המולקולרית. מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בזווית משתנה (VAEM) היא טכניקה מתפתחת המספקת תמונות באיכות גבוהה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית על פני תא הצמח. במאמר זה מתוארים נהלים מעשיים להכנת דגימות VAEM, התאמת המערכת האופטית VAEM, לכידת סרטים וניתוח תמונה. כדוגמה לתצפית VAEM, מוצגות תוצאות מייצגות על הדינמיקה של PATROL1. זהו חלבון חיוני לתנועת הפיוניות, שנחשב מעורב בהעברת משאבת פרוטונים לממברנות פלזמה בקומפלקס הפיוניות של Arabidopsis thaliana. תצפית בזמן אמת של VAEM על תאי שמירה ותאי משנה בקוטילדון A. thaliana הראתה כי PATROL1 מתויגים פלואורסצנטיים הופיעו כמבנים דמויי נקודות על ממברנות פלזמה למשך מספר שניות ואז נעלמו. ניתוח קימוגרף של נתוני סרטי VAEM קבע את התפלגות הזמן של הנוכחות (המכונה 'זמן מגורים') של המבנים דמויי הנקודות. השימוש ב-VAEM נדון בהקשר של דוגמה זו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פני השטח של תא הצמח, כולל קרום הפלזמה והציטופלזמה הסמוכה אליו, הוא האזור העיקרי של תפיסת תא הצמח ושילוב של רמזים ביוטיים ואביוטיים מהסביבה החוץ-תאית. בתגובה לרמזים אלה, רכיבי פני התא כולל חלבוני קרום הפלזמה והשלד הציטולוגי בקליפת המוח עוברים שינויים דינמיים, בסולם זמן של שניות עד דקות1-4. לפיכך, הדמיה בזמן אמת וברזולוציה גבוהה של חלבונים פלואורסצנטיים על פני התא יכולה להאיר את תגובות הצמח לרמזים סביבתיים ברמה המולקולרית.

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הוא כלי רב עוצמה לקביעת לוקליזציה של חלבון מתויג פלואורסצנטי3, עם זאת, לעתים קרובות קשה לנטר את דינמיקת החלבון בזמן אמת בגלל זמני הלכידה הארוכים יחסית שלו. טכניקה מתפתחת לניטור בזמן אמת של חלבונים בתא הצמח היא מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בזווית משתנה (VAEM), שהוא התאמה של ציוד המשמש בדרך כלל למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). במיקרוסקופ TIRF, מקור האור הקרינה-עירור הוא שדה אור חולף שנוצר כאשר זווית הכניסה של הלייזר רדודה מספיק כדי להחזיר אור פנימי לחלוטין בממשק זכוכית-מים. עומק החדירה של שדה האור החולף הוא בסביבות 100 ננומטר. מיקרוסקופ TIRF הוא כלי יוצא מן הכלל להדמיית מולקולה בודדת, כגון זיהוי אקסוציטוזיס בתאי בעלי חיים5. עם זאת, אור חולף אינו יכול להגיע לממברנות הפלזמה או לציטופלזמה בקליפת המוח בתאי הצמח, מכיוון שיש להם דפנות תאים עבות. לאחרונה, ציוד מיקרוסקופיה TIRF הותאם על ידי ביולוגים של תאי צמחים, והבחינו כי לייזר, אם הוא זוויתי מעט יותר עמוק מאשר כאשר משתמשים בו כדי לגרום לתופעות השתקפות פנימיות מוחלטות, יכול לעורר את פני השטח של דגימות תאי צמחים, וכתוצאה מכך הדמיית תאי צמחים באיכות גבוהה6,7. עומק תאורת העירור משתנה על ידי התאמת זווית הכניסה של הלייזר; לכן, טכניקה זו מתוארת כ-VAEM. מערכת אופטית זו נקראת גם מיקרוסקופיה TIRF בזווית משתנה (VA-TIRFM) מכיוון שקיימת אפשרות שהשתקפות מוחלטת עשויה להתרחש בממשק דופן התא-פריפלזמה7, עם זאת, המונח VAEM משמש במאמר זה, לפי הדוח הראשון בצמחים6.

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים נהלים מעשיים לשימוש ב-VAEM כדי להמחיש דינמיקת חלבון מתויגת פלואורסצנטית על משטחי תאים צמחיים. בנוסף, מתואר פרוטוקול ניתוח תמונה לכימות זמן השהייה (משך הנוכחות) של מולקולות לניתוח סרטי VAEM. GFP-PATROL1 נקודה מהבהבת על תאים מורכבים של פיוניות ב- Arabidopsis thaliana cotyledons משמשת כדוגמה. PATROL1 זוהה על ידי גישות גנטיות קדימה כגן סיבתי של מוטציה של פגם בתגובה לפיונית ב-A. thaliana8. PATROL1 הוא הומולוג צמחי של MUNC-13, המהווה גורם ראשוני באקסוציטוזיס שלפוחית סינפסה8. בתגובה לרמזים סביבתיים, כגון אור או לחות, נהוג לחשוב כי PATROL1 מווסת באופן הפיך את אספקת משאבת הפרוטונים לממברנות הפלזמה בקומפלקס הפיוניות. קומפלקסים של פיוניות מורכבים כל אחד מזוג תאי שמירה8 ותאי משנה9, והם דורשים משאבת פרוטונים לתנועת הפיוניות. בתאים אלה, PATROL1 מתויג GFP מתמקם למבנים דמויי נקודות שנשארים על קרום הפלזמה פחות מדקה9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת השתילים

  1. לעקר את הזרעים.
    1. הכן את פתרון העיקור על ידי הוספת 500 μl NaClO (כלור זמין: 5.0%) ו1 μl 10% מים סטריליים 500 μl טריטון-100 X.
    2. א 10 המהונדס בערך מקום thaliana זרעי ביצוע GFP-PATROL1 8 לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    3. הוסף 1 מיליליטר 70% אתנול פתרון, ומערבבים היטב על ידי היפוך חמש פעמים. השאר דקות 1.
    4. שים לב לזרעים לשקוע לתחתית של התחתית. בזרימה למינרית נקייה, בעדינות להסיר את אתנול 70% באמצעות micropipette, ולהוסיף 1 מיליליטר פתרון עיקור. מערבבים היטב על ידי היפוך חמש פעמים ולהשאיר למשך 5 דקות.
    5. שטוף את הזרעים. עדיין עובד בתנאים אספטיים על ספסל נקי, להסיר בעדינות את הפתרון באמצעות micropipette, ולהוסיף 1 מיליליטר מים סטריליים. חזור חמש פעמים. הזרעים המעוקרים עשויים להיות מאוחסנים במים סטריליים על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
  2. כךw הזרעים המעוקרים על 0.5% gellan-הגדילו את מסטיק 1/2 צלחת בינונית Murashige וSkoog (pH 5.8) 9. הדבק את המכסה על הצלחת באמצעות שתי שכבות של קלטת כירורגית.
  3. דגירה את הצלחת בחושך על 4 מעלות צלזיוס עם תא אחסון קר, O / N.
  4. העבר את הצלחת לתוך תא צמיחה נקבע על 23.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור-חושך / 12-שעות 12 שעות באמצעות 100 מ 'μmol -2 שניות -1 אורות לבנים, ודגירה של 7 ימים. שתילים עם ארוכת פסיגים של כ 1 מ"מ אז יכולים להיות שנקטפו.

2. שמים בגלילה התקנת דוגמאות טבורית

הערה: גורם חשוב בהכנת דגימה להסתכלות VAEM היא הימנעות מההכללה של בועות אוויר בין הדגימה ומכסה הזכוכית. בועות לצמצם במידה ניכרות את איכות התמונה של VAEM ידי גרימת הבדלים בשבירה. שיטה פשוטה, שיש לנו בשם "טיפת שמים 'הרכבה, יכולה לשמש כדי למנוע בועותבין א ' פסיגים thaliana ומכסה הזכוכית. זה צריך להיעשות באופן מיידי לפני התצפית.

  1. מניחים 30 μl של חיץ בסיסי [5 מ"מ 2 (-morpholino N) -ethanesulfonic חומצה-טריס (MES-טריס) ב- pH 6.5, 50 מ"מ KCl, 100 מיקרומטר CaCl 2] במרכז שקופיות זכוכית (גודל: 76 × מ"מ 26, עובי: 1.0-1.2 מ"מ).
  2. הסר טבורית משתיל 7 ​​יום בן באמצעות מספריים לנתח. לצוף טבורית עם צד התצפית פונה כלפי מעלה על הירידה הבסיסית חיץ (איור 1, שלב 1).
  3. מניחים 30 μl של חיץ בסיס במרכז מכסה זכוכית (גודל: 18 × 18 מ"מ, עובי: .12-.17 מ"מ) (איור 1, שלב 2). הפעל את מכסה הזכוכית בעדינות כלפי מעלה. מתח פנים ימנעו את ירידת החיץ מלנפול. החזק את מכסה הזכוכית עם פינצטה על קצה אחד. הנח את הקצה השני בשקופית הזכוכית כך שירידת החיץ היא כ מעל טבורית.
  4. עם הקצה של מכסה הזכוכית עדיין בשקופית, ועדיין מחזיק את הקצה השני עם פינצטה, להתאים את המיקום של ירידת החיץ תחת מכסה הזכוכית, כך שזה ממש מעל מדגם טבורית (איור 1, שלב 3). עזוב את מכסה הזכוכית. הר ירידה במדגם וכתוצאה מכך הכנה ללא בועות אוויר.
  5. נגב את החיץ עודף באמצעות רקמות ונטולי מוך. שים לב להכנה מיידית (ראה שלב 3).
    הערה: אין צורך לאטום את הדגימות.

3. VAEM תצפית וסרט רכישה

הערה: מערכת מיקרוסקופ TIRF 9 השתמשה במחקר הנוכחי מתוארת כדלקמן: מיקרוסקופ הפוך מצויד ביחידת TIRF ועדשה אובייקטיבית TIRF עם צמצם מספרי של 1.49. לבקרה ממוחשבת של זווית כניסת הלייזר, משמשת תיבת בקרה. חלבון ניאון ירוק (GFP) הוא נרגש עם לייזר 488 ננומטר שאוב אופטי של מוליכים למחצה, ולאהוא הקרינה מזוהה דרך מסנן להקה עובר 510-550 ננומטר כדי למנוע autofluorescence מכלורופלסטים. הערך המרבי שנמדד תפוקת סיבי הכח הוא 13.0-13.5 mW. לגילוי, אלקטרון הכפלת מכשיר תשלום מצמידים מערכת (EM-CCD) ראש המצלמה ויחידת שינוי הגדלת המצלמה C-הר משמש.

  1. כייל את מרכוז הלייזר והתמקדות על פי הוראות היצרן.
    הערה: שלב זה הוא קריטי לתצפיות VAEM מדויקות. מומלץ מאוד שבדיקות תקופתיות של נהלי התאמת נתיב לייזר, מתאימות למיקרוסקופ שלך, מתבצעות.
    1. לקבוע את המיקום המרכזי מואר עם נתיב אור ללא עדשה אובייקטיבי על התקרה של החדר מיקרוסקופי. כדי לסמן את המיקום המרכזי, לשים חותם מעגל צבעוני על התקרה (איור 2, שלב 1, 2).
    2. להאיר את התקרה עם עדשה אובייקטיבית (איור 2, שלב 3, 4). הזז אותיlluminated אזור למצב המרכז (איור 2, שלב 5). פוקוס הלייזר (איור 2, שלב 6). לכוונן את המיקום של הלייזר הממוקד למרכז (איור 2, שלב 7).
  2. הגדר דגימה על הבמה של המיקרוסקופ ובחר תאים לתצפית באמצעות תאורה בשדה בהירה.
  3. בדוק שחלבון פלואורסצנטי ניתן להבחין בתאים, ולהגדיר את עמדת -axis z בתא השטח באמצעות תאורת epifluorescence (איור 3 א).
  4. לבצע תצפיות VAEM.
    1. להטות את זווית הכניסה של קרן הלייזר בהדרגה עם תיבת בקר. במקביל, לפקח על תמונת החיה בזהירות. בתחילה, התמונה תהיה מטושטשת (איור 3).
    2. ככל שעולה זווית הלייזר, תמונת VAEM תהיה פחות מטושטשת, סופו של דבר לייצר תמונה ברורה (איור 3 ג ו-ד '). בשלב זה, להפסיק increaלשיר את זווית הלייזר. אם אות הקרינה הולכת לאיבוד, להקטין לזווית רדודה.
    3. לכוונן את זווית כניסת הלייזר כדי להשיג תמונה טובה יותר. כוונון עדין של עמדת -axis z עשוי גם לשפר את התמונה. במידת צורך, להתאים את הפרמטרים האופטיים (כוח לייזר, אורך גל ומערכת סינון) ופרמטרי חיישן תמונה [גודל תמונה, זמן חשיפה, רווח, ורווח digitizer אלקטרונים הכפלה (EM)].
      הערה: במקרה של ציוד מיקרוסקופ TIRF שתואר לעיל, נציג פרמטרים הם כדלקמן. הגדלה של עדשה ממש מול המצלמה: 2X; פלט לייזר: 1.0 mW; גודל תמונה: 512 × 512 פיקסלים; זמן חשיפה: 100 אלפיות שני; קבל: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; ורווח EM: 100.
  5. לרכוש סרט כקובץ תמונת TIFF מרובים עמודים באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המסחרית. הנה, הסרט הוא נקודות שכותרת GFP מהבהבות על פני השטח של תאי הפיוניות.
    הערה: תנאי רכישת תמונת נציג הם כמו folשפל. רכישת מצב: הזרם ל- RAM; מספר המסגרות: 600; וגודל קובץ TIFF מרובי עמודים: ~ 302 MB.

4. רשם גלים ניתוח לכימות של ה- GFP שכותרת דוט מגורים זמן שימוש בתוכנת פיג'י

  1. התקן פיג'י ('פיג'י היא רק ImageJ') תוכנה 10 באמצעות ההוראות של המחברים (http://fiji.sc/Fiji).
  2. הפעל פיג'י ולפתוח את קובץ TIFF מרובי עמודים נרכש באמצעות תפריט פיג'י "קובץ-הפתוח".
  3. מקום בשורה באתר של עניין, תוך שימוש בתפריט סרגל כלי פיג'י "קו ישר מבחר כלי". לחלופין, להשתמש ב" מקוטע קו מבחר כלי "או" Freehand קו מבחר כלי ". בתוצאות שהוצגו כאן, קו ישר של 100 פיקסלים (המקביל ל 8.0 מיקרומטר) הונח על תא בת (איור 4 א).
  4. הפוך תמונת רשם גלים באמצעות תפריט פיג'י "תמונה-ערימות-דינמי Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (איור 4). לחלופין, "Flip האנכי" "90 מעלות סובב" ובחלון תיבת סימון זמין גם (לא השתמש בתוצאות שהוצגו כאן). X וציר y בתמונה רשם גלים לציין את מיקום הקו (100 פיקסלים המתאימים ל 8.0 מיקרומטר) וזמן תצפית (600 פיקסלים מקבילים ל -60 שניות), בהתאמה. אם תמונת רשם גלים אינה משביעה רצון, את המיקום והסוג (ישר, מפולחים וחופשי) של הקו על התמונה מרובות העמודים עשויים להיות שונה. כ שינויי הקו, תמונת רשם גלים דינמית משתנה. שמירת תמונת רשם גלים כקובץ TIFF באמצעות תפריט פיג'י "קובץ-שמירה ב- Tiff".
  5. מדוד את האורך של הבועה בכיוון של ציר זמן.
    1. כדי לבצע הפחתת רעש, להחיל מסנן גאוס לתמונות רשם גלים באמצעות תפריט פיג'י "תהליך מסננים-Gaussian Blur". "סיגמא (רדius) "הפרמטר הוא מתכונן (רדיוס 1 פיקסל משמש לתוצאות שהוצגו).
    2. מגזר אזורי האות על ידי thresholding, באמצעות תפריט פיג'י "תמונה התאם-סף".
      הערה: יש כמה אלגוריתמי thresholding לבחירה. בתוצאות שהוצגו, אלגוריתם "הין" נבחר (איור 4C).
    3. הכן למדידת הזמן (Y) -axis אורך של הבועה באמצעות התפריט "נתח-סט מדידות". בדוק את "המלבן התוחמת" בחלון "מדידות הגדר". באופן אידיאלי סט האזור צריך להיות קטן ככל האפשר, כדי לא לכלול רעש. כאן, באזור המינימום נקבע על 50 פיקסלים. מדוד את הזמן (Y) -axis אורך של הבועה באמצעות התפריט "נתח-לנתח חלקיקים". כדי להשיג את תוצאת הערכים ולהוכיח את האמינות של אזורי המדידה, בדוק את "צג התוצאות" ועל "הוסף למנהל </ Em> "קופסות.
    4. ערכים בעמודה "גובה" הם הזמן (Y) -axis אורכים לבועה שנמדדה (איור 4D). שמור את הערכים באמצעות תפריט שולחן תוצאות "כקובץ-שמירה" ולחשב ולעבד את בסיס הנתונים של משכי תמונת בועה באמצעות חבילה סטטיסטית ו / או תוכנת גיליון אלקטרוני (איור 4E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה וידאו, הפרוטוקולים לתצפית VAEM של ה- GFP-PATROL1 בא תאים מורכבים הפיוניות טבורית thaliana מסופקים. הרכבת ירידת שמים היא שיטת הכנה פשוטה שעשויות לעזור להפחית את ההתרחשות של בועות אוויר בהכנות VAEM של א ' פסיגים thaliana (איור 1). Overtilting של לייזר הכניסה ו / או Z-מיצוב של דגימות לVAEM יספק תמונה ברורה. אם זה יקרה, זה מומלץ להתחיל שוב מעמדה מייד מעל המדגם, כמו להישפט על ידי תאורת epifluorescence. לאחר הניסיון של כמה ימ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה וידאו, ניתנים פרוטוקולים לניטור ומדידת ההתנהגות הדינמית של נקודות GFP-PATROL1 במתחם הפיוניות של thaliana ארבידופסיס. כפי שניתן לראות כאן, התבוננות VAEM היא כלי רב עוצמה עבור הדמיה חיה של משטחי תאי צמח. תחת תנאי הניסוי משמשים כאן לניטור GFP-PATROL1, היה photobleaching הקרינה קטן מאוד במדגם המשמש ל1 דקות של לכידת וידאו, כי EM-CCD רגיש מאוד מתיר את השימוש בליזר עירור חלש יחסית באופטיקה VAEM. מרכוז לייזר והתמקדות, לפני תחילת כל ניסוי, חשובים לתצפית VAEM מוצלחת. משתמש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר יש מה למסור.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אני אסיר תודה לד"ר מסארו פוג'ימוטו על הצעותיו הטכניות ל-VAEM. אני גם אסיר תודה לפרופסור קו איבה ולד"ר מימי האשימוטו-סוגימוטו על מתן GFP-PATROL1 לצמחים טרנסגניים, ודיונים על PATROL1. אני מודה לפרופ' Seiichiro Hasezawa על תמיכתו המתמשכת בעבודתי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק KAKENHI של האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מספר 25711017.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX-73
יחידת TIRFOlympusIX3-RFAEVAW
TIRF עדשה אובייקטיבית אולימפוסUAPON 100 ופעמים; אוטירפ NA = 1.49
תיבת בקרת זווית לייזרChuo SeikiQT-AK
לייזר מוליכים למחצה שאוב אופטיתקוהרנטיספירTM LP USB 488-20 CDRH לייזר
510– מסנן פס 550 ננומטרOlympusU-FBNA
EM CCD מצלמתפוטוניקה ImagEMC9100-13
יחידת שינוי הגדלת מצלמה C OlympusU-TVCAC
MetaMorphהתקנים מולקולרייםMetaMorph גרסה 7.7.11.0
מדריך מיקרוסקופיה TIRFOlympusAX7385הוראות: מערכת תאורת השתקפות פנימית כוללת (הודפס ביפן ב -24 באוגוסט 2012)
שמן טבילהאולימפוסשמן טבילה Typr-Fne = 1.518 (23 מעלות)
תוכנת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
  2. Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
  3. Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
  4. Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
  5. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
  6. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
  7. Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
  8. Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215(2013).
  9. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
  12. Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
  13. Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
  14. Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
  15. Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle Epifluorescence MicroscopyPlant Cell Surface DynamicsFluorescent Protein TrackingReal time ImagingKymograph AnalysisResidence Time MeasurementGuard Cell ObservationSubsidiary Cell AnalysisPATROL1 Protein DynamicsArabidopsis thaliana

Related Articles