מאמר שיטה

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

DOI:

10.3791/53478

⸱

20 בינואר 2016

 , 
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי מולקולות הקשורות לאזורי עניין גנומיים ספציפיים נדרש כדי להבין את מנגנוני הבקרה של התפקודים של אזורים אלה. פרוטוקול זה מתאר נהלים לביצוע אימון-אופרפריצציה של כרומטין בתיווך מולקולות קשירת DNA (enChIP) לזיהוי חלבונים ו-RNA הקשורים לאזור גנומי ספציפי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי מולקולות הקשורות לאזורי עניין גנומיים ספציפיים נדרש כדי להבין את מנגנוני הבקרה של התפקודים של אזורים אלה. כדי לאפשר זיהוי לא מוטה של מולקולות המקיימות אינטראקציה עם אזור עניין גנומי ספציפי, פיתחנו לאחרונה את טכניקת הכרומטין המהונדסת בתיווך מולקולות (enChIP). כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש ב-enChIP כדי לבודד אזורים גנומיים ספציפיים ולזהות את החלבונים וה-RNA המשויכים. ראשית, אזור עניין גנומי מתויג עם חלבון דמוי מפעיל שעתוק (TAL) או קומפלקס חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR) מקובץ באופן קבוע המורכב מצורה לא פעילה קטליטית של Cas9 ו-RNA מדריך. לאחר מכן, הכרומטין מקושר ומפוצל על ידי סוניקציה. לאחר מכן הלוקוס המתויג משקע חיסוני והקישור המוצלב מתהפך. לבסוף, החלבונים או ה-RNA הקשורים לכרומטין המבודד נתונים לניתוחי ספקטרומטרי מסה או ריצוף RNA, בהתאמה. גישה זו מאפשרת זיהוי מוצלח של חלבונים ורנ"א הקשורים לאזור עניין גנומי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של מולקולות הקשורות לאזורים הגנומי ספציפיים של העניין נדרש להבין את מנגנוני רגולציה של פונקציות הגנומי כגון שעתוק ורגולציה אפיגנטיים. למרות כמה טכניקות פותחו לאנליזה ביוכימית של אזורים הגנומי ספציפיים 1-7, הם לא בשימוש נרחב בשלב זה בגלל הבעיות שלהם הפנימיות כגון יישום מוגבל (למשל, רק ללוקוסים גבוה עותק מספר או לוקוסים עם חזרות) ו נדרשו זמן ומאמצים רבים מדי.

על מנת לבצע את הניתוח ביוכימי של אזורים הגנומי ספציפיים בקלות, פיתחנו שתי טכנולוגיות immunoprecipitation הכרומטין מוקד ספציפי (שבב), כלומר insertional השבב (iChIP) 8-13 ומהונדס שבב תיווך מולקולת ה- DNA מחייב (enChIP) 14-17 . בiChIP, מוקד של העניין מתויג על ידי רצפי הכרת החדרה של חלבון קושר DNA אקסוגני כגון לקסא המוקד מבודד לאחר מכן על ידי טיהור זיקה באמצעות החלבון קושר DNA מתויג. מתחמים חוזר palindromic קצר interspaced באופן קבוע בenChIP, מהונדס מולקולות ה- DNA מחייבת, כגון חלבוני אבץ-אצבע, חלבוני שעתוק כמו activator (טל), והתקבץ (CRISPR), משמשים לתייג מוקד של עניין (איור 1). בהמשך לכך, אזור גנומי מבודד על ידי טיהור זיקה של מולקולות ה- DNA מחייבת המתויגות.

אחד היתרונות של enChIP על iChIP הוא שההכנסה של רצפי הכרה של חלבון קושר DNA אקסוגני היא לא הכרחית. המיקוד של לוקוסים באמצעות מתחמי CRISPR בהיקף של צורת catalytically פעילה של Cas9 (dCas9) וRNA מדריך (gRNA) הוא הרבה יותר קל מאשר המיקוד של אזורים אלה על ידי iChIP או enChIP באמצעות חלבוני טל ואבץ-אצבע. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לenChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ורצף RNA (RNA-Seq) לזהות מוקד-associaחלבוני טד וRNAs, בהתאמה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב של מולקולות ה- DNA מחייב תכנון הנדסי הכרת לוקוס היעד

  1. לenChIP באמצעות מתחמי CRISPR, להשתמש בכלי CRISPRdirect האינטרנט (http://crispr.dbcls.jp) לזהות רצפי יעד gRNA מועמד באזור הגנומי של עניין כפי שתואר קודם לכן 18. כלי אינטרנט זה מחזיר אתרים הגנומי 23 נ"ב של הטופס 5'-N-20 NGG 3 'בתוך אזור היעד.
  2. לסנתז gBlock כולל רצף אמרגן U6 והרצף של 5'-N 20 ב5'-N-20 NGG 3 'משתמש בשירותים מסחריים (ראה איור 2) 19,20. לsubcloning מטרות, כוללים אתרי אנזים ההגבלה מתאימים מחוץ לgBlock.
  3. הכנס את gBlock לוקטור מתאים כפי שתואר קודם לכן 16. כמה וקטורי retroviral לgBlocks זמינים (ראה חומרים).
  4. לenChIP באמצעות חלבוני טל, לתכנן חלבוני טל הכרת טארגלוקוסי et. צור פלסמידים קידוד חלבוני TAL באמצעות שירותים מסחריים. צור וקטורי ביטוי המכילים חלבוני טל התמזגו עם תג אחד או יותר כגון דגל 3 × כפי שתואר קודם לכן 15.

2. הקמת תאים לניתוח enChIP

  1. הגעה 3 × הדגל-dCas9 וgRNA (הליך המבוסס על CRISPR) או 3 × דגל-טל (הליך המבוסס על חלבוני טל) בתאים להיות מנותח כפי שתואר לעיל 14-17.
    1. השתמש transfection חולף אם יעילות transfection היא גבוהה. וקטור ביטוי המכיל 3 × הדגל-dCas9 ואמרגן CMV הוא זמין (ראה חומרים).
    2. לשקול הקמת transformants היציב בשיטות קונבנציונליות אם יעילות transfection החולפת היא נמוכה. בנוסף לוקטורי retroviral האמורים לgBlock, וקטורי retroviral של 3 × הדגל-dCas9 זמינים (ראה חומרים).
  2. אשר את הביטוי של 3xFLAG-dCas9 או חלבון 3xFLAG-טל בתאי transfected על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן אנטי-דגל (AB) כפי שתואר לעיל 14-17.
    הערה: ביטוי של חלבונים מתויגים אלה גם יכול להיות מאושר על ידי צביעה תאית עם אנטי-דגל-FITC וניתוח FACS הבא. פרוטוקול מכתים תאית ניתן להוריד מאתר הבית שלנו (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
  3. אשר ביטוי של gRNA על ידי טכניקת RT-PCR סטנדרטי.
  4. לזיהוי כמותי של חלבוני אינטראקציה עם האזור הגנומי של עניין, לשקול שימוש בתיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC) ניתוח בשילוב עם enChIP (enChIP-SILAC).
    הערה: מדיה לניתוח SILAC ניתן לרכוש מיצרנים מסחריים. SILAC הוא חזק באיתור אינטראקציות ספציפיות.
    1. תרבות תאים במדיום כבד SILAC. הכן cultu תאיםאדום במדיום SILAC אור כביקורת שלילית. השתמש לפחות 5 10 × 7 תאים לכל מדיום SILAC (כבד או קל). לתיוג יעיל, מוסיף שני L ליזין-2HCl, 13 C 6 וL- ארגינין-HCl, 13 C 6, 15 N 4 בתקשורת SILAC כבדה. הערה: לפחות חמש חלוקות תא נחוצות לחלבוני תווית.
      1. לדוגמא, תאי התרבות אנושיים HT1080 fibrosarcoma יציבות להביע 3xFLAG-dCas9 וgRNA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתקשורת DMEM לSILAC וסרום שור העוברי dialyzed עם יזין-2HCl תוספת L- ארגינין-HCl (בינוני אור) או 13 C 6 L ליזין-2HCl בתוספת 13 C 6 15 N 4 L- ארגינין-HCl (בינוני כבד) (ראה חומרים) 16. הוסף 50 מ"ג של אור או L ליזין-2HCl כבד וL- ארגינין-HCl ב500 מיליליטר של מדיום.
      2. תאי Trypsinize וreplate לפני שהם הופכים ומחוברות, כך שתאים לשמור growt מעריכיח.

3. Crosslinking של תאים עם פורמלדהיד

  1. לתאים בתרבית השעיה, העברה 2 × 10 7 תאים לבטא חלבוני 3xFLAG-טל או 3xFLAG-dCas9 תוספת gRNA ולהשעות ב 30 מיליליטר של מדיום תרבות הקבוע בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. כאשר יותר תאים משמשים, להגדיל את הנפחים וכמויות של חומרים כימיים באופן יחסי. לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית בינונית כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד) ולחלק את הסכום הכולל של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים.
  2. להוסיף 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של ההשעיה התא (ריכוז סופי 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לתאים חסיד, ישירות לתקן תאים בצלחות תרבות על ידי הוספת 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של מדיום התרבות.
  3. להפסיק crosslinking ידי הוספת 3.1 מיליליטר של 1.25 M פתרון גליצין (ריכוז סופי 127 מ"מ), ולדגור על RT במשך 10 דקות.
  4. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (ז 300 × 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). להשליך בזהירות פורמלדהיד supernatant כולל ולאחסן אותו בבקבוק פסולת מתאים.
    1. לתאים חסיד, לנתק את התאים עם מגרד תא וקציר בצינור מיליליטר 50, ולאסוף תאים כמתואר בשלב זה.
    2. לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית המנותק בינוני כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד), לחלק את סך של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים, ולאסוף תאים כפי שמתואר בזה שָׁלָב.
  5. שטוף את התא גלולה עם 30 מיליליטר של PBS פעמיים לכל צינור. להשליך בזהירות את supernatant כולל פורמאלדהיד ולאחסן אותו בפסולת מתאימה bottle.Handle פסולת פורמלדהיד פי הנחיות בטיחות כימיות. אפשר להקפיא תאים הקבועים ומאוחסנים ב -80 ° C.

4. הכנת הכרומטין (מחיר 2 x 107 תאים)

  1. להשעות את התאים הקבועים ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה תא (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% IGEPAL CA-630, ו1 × מעכבי פרוטאז) ודגירה על קרח למשך 10 דקות.
  2. צנטריפוגה המדגם (ז × 830 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות.
  3. להשעות את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הגרעיני (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate נתרן, lauroylsarcosine 0.5%, ומעכבי פרוטאז 1x). דגירה על קרח למשך 10 דקות ומערבולת כל דקות 2-3.
  4. צנטריפוגה המדגם (830 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות.
  5. שטוף את הכדור ב 10 מיליליטר של PBS. גלולה (חלק הכרומטין) ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי.

5. Sonication של הכרומטין (מחיר 2 x 10 7 תאים)

  1. להשעות את חלק הכרומטין ב800 μl שלתמוגה חיץ שונה 3 (10 מעכבי פרוטאז מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 0.1% deoxycholate נתרן, 0.1% SDS, ו1x) ולהעביר לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
  2. Sonicate הכרומטין באמצעות sonicator (ראה חומרים) והתנאים הבאים: פלט: 3; החובה: 100% (רציפה); וזמן: ללא תשלום. לבצע 10-18 מחזורים של sonication במשך 10 שניות וקירור בקרח במשך 20 שניות. כדי להימנע מחימום יתר, דגירה על דגימות קרח למשך 2 דקות כל 5-6 מחזורים. כדי למנוע הקצפה, לשמור על העמדה של הקצה של חללית sonication 0.5 סנטימטרים מעל החלק התחתון של הצינור.
  3. צנטריפוגה המדגם ב( ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות) ולהעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכרומטין sonicated ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי.

6. הערכה של פיצול הכרומטין

  1. מערבבים 10 μl של הכרומטין המקוטע עם 85 μl של מים מזוקקים.
  2. הוסף 4 μl5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות CO / N.
  3. הוסף 1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר RNase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
  4. הוסף 2 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0), 4 μl של 1 M טריס (pH 6.8), וμl 1 של 20 מ"ג / מיליליטר proteinase K, ולאחר מכן לדגור על 45 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
  5. נפרד 10 μl של המדגם על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose 1% שאינו מכיל צבעים מכתימים כמו SYBR ירוק.
  6. כתם ג'ל להעריך את חלוקת האורכים של הכרומטין המקוטע. תנאים שיוצרים אורך ממוצע של 0.5-2 KBP (טווח של .2-4 KBP) מומלצים.
  7. לטהר DNA מהדגימות שנותרו על ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש כDNA קלט להעריך את התשואות של ניתוחי enChIP (ראה 8.11).

7. הכנת Dynabeads Conjugated עם נוגדנים (מחיר 2 x 10 7 תאים)

  1. מִרֹאשׁלקלף שני צינורות 1.5 מיליליטר, אחד לטרום סליקה באמצעות IgG עכבר הרגיל והשני לדגירה עם אנטי-דגל Ab. להוסיף 150 μl של חרוזים מגנטיים G-מצומדות חלבון (ראה חומרים) על צינור אחד.
  2. מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
  3. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 0.01% Tween-20 (PBS-T). מניחים את הצינורות על דוכן מגנטי ולחכות 2 דקות. בטל supernatant ידי pipetting, ולאחר מכן לחזור על הצעד.
  4. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T המכיל BSA 0.1%.
  5. הוסף 15 מיקרוגרם של IgG עכבר הרגיל או אנטי-הדגל Ab ולסובב על 4 מעלות CO / N.
  6. ספין למטה בקצרה, ואז למקם את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
  7. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T. הפוך את המדגם מספר פעמים וספין למטה בקצרה. מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולהמתין 3 דקות, ואז להשליך את supernatant ידי pipetting. חזור על לשטוףעוד פעמיים עם PBS-T (כולל של שלושה שלבים לשטוף).

8. הכרומטין immunoprecipitation (מחיר 2 x 10 7 תאים)

  1. מערבבים את הכרומטין המקוטע הערוך 5.3) (כ -800 μl) עם חמישית מהנפח (כ -200 μl) של תמוגה חיץ שונה 3 המכיל 5% Triton X-100 (ריכוז סופי של 1% Triton X-100).
  2. מוסיף את פתרון הכרומטין לצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם העכבר רגיל IgG הוכנו. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות.
  4. מעבירים את supernatant לתוך הצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם אנטי-הדגל Ab הוכנו. סיבוב על 4 מעלות CO / N.
  5. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting.
  6. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של חיץ נמוך מלח (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% TriX-100 טון, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting וחזור על השלב לשטוף.
  7. שטוף את החרוזים עם חיץ מלח גבוה (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 500 מ"מ NaCl, 1% Triton X-100, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) פעמיים.
  8. שטוף את החרוזים עם חיץ LiCl (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 250 מ"מ LiCl, 0.5% IGEPAL CA-630, 0.5% deoxycholate נתרן, ומעכבי פרוטאז 1x) פעמיים.
  9. שטוף את החרוזים עם TBS-IGEPAL CA-630 (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, מעכבי CA-630 IGEPAL, ופרוטאז 1x 0.1%) פעם אחת.
  10. להשעות את החרוזים 200 μl של חיץ elution (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 0.1% CA-630 IGEPAL, מעכבי פרוטאז 1x, ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר 3 פפטיד × FLAG) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. מעבירים את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש ולחזור על elutצעד יון.
  11. לטהר DNA מחלק קטן (למשל, 5%) של eluate ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש לPCR עם פריימר הספציפי קובע להעריך את התשואות של enChIP ניתוחים על ידי השוואה עם קלט DNA מוכן בשלב 6.7 כפי שתואר לעיל 14,16.

9. SDS-PAGE, מכתים, וניתוח ההמוני spectrometric

  1. מערבבים את eluate (400 μl) עם 1 מיליליטר של 2-propanol, 50 μl של נתרן אצטט 3M (pH 5.2), ו -5 μl של 20 מ"ג / מיליליטר גליקוגן. לזרז את הכרומטין בCO -20 ° / N.
  2. צנטריפוגה המדגם (ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) וזורקים supernatant. יש לשטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות שוב (ז 16,000 × ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות). בטל supernatant לחלוטין על ידי pipetting.
  3. להשעות את גלולה ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (125 מ"מ טריס (pH 6.8), 10% 2-מרצדסaptoethanol, 4% SDS, 10% סוכרוז, ו0.004% bromophenol כחול). וורטקס למשך 5 דקות לפזר את גלולה לחלוטין, ולאחר מכן לדגור על 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפגל את החלבונים ולהפוך את crosslinking.
  4. לSDS-PAGE, לרוץ 40 μl של המדגם על הג'ל עד לצבוע מגיע 1 סנטימטר מתחת היטב. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4-20 ג'לי שיפוע%, אך ניתן להשתמש ג'לי% אחר.
  5. כתם ג'ל עם כחול מבריק Coomassie או כתם כסף.
  6. חותך את הג'ל לתוך חמש חתיכות (2 גובה מ"מ).
  7. לבצע בעיכול ג'ל וניתוח ספקטרומטריה כפי שתואר לעיל 13-16.
  8. לניסויי SILAC עם 5 x 10 7 תאים כל אחד (סך של 1 x 10 8 תאים), להשעות גלולה מחמישה צינורות הראשוניים ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (אין צורך בהיקף של עד).

10. טיהור של ניתוח RNA ו- RNA-Seq

  1. לטהר RNA לאחר enChIP, להוסיף 5 U / ml של RNase אינהיביטור (SEדואר חומרים) לכל פתרונות החיץ, למעט תמוגה חיץ שונה 3 וחיץ elution, ולכך יש להוסיף 40 U / ml של RNase מונעי.
  2. מערבבים את eluate (400 μl) עם 16 μl של 5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  3. הוסף 1 מיליליטר של מגיב החומצה-guanidinium-מבוסס פנול (ראה חומרים) לדוגמא. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5-15 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות בגרם 12,000 × וRT.
  4. מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולהוסיף 5 μl של p-bromoanisole. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 3-5 דקות. צנטריפוגה המדגם של 10 דקות ב g 12,000 × וRT.
  5. מעבירים את supernatant (כ 1 מיליליטר) לתוך צינור 2 מיליליטר חדש ולהוסיף 1 מיליליטר של 2-propanol. להפוך את הצינור ולדגור על RT במשך 10 דקות. טען את התערובת על עמודה בערכת טיהור RNA (ראה חומרים). צנטריפוגה עמודת דקות 1 ב 12,000 × ז וRT.
  6. לִשְׁטוֹףהטור עם 400 μl של רנ"א הצפת לשטוף בערכת טיהור RNA (ראה חומרים).
  7. להוסיף 80 μl של DNase אני קוקטייל (תערובת של 5 μl של DNase אני (1 U / μl), 8 μl 10 × DNase אני הצפת תגובה, 3 μl מים RNase ללא DNase /, ו -64 μl של רנ"א הצפת לשטוף ב ערכת טיהור RNA (ראה חומרים)) לעמודה. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואז צנטריפוגות במשך 30 שניות ב12,000 × g וRT.
  8. לשטוף את העמודה עם 400 μl של רנ"א כביסה מוקדמת הצפת בערכת טיהור RNA (ראה חומרים) פעמיים.
  9. Elute RNA עם 50 μl של DNase / מים RNase ללא. RNA eluted יכול לשמש לקביעת רצף RNA.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסך הכל, 1-30% מאזורים הגנומי היעד יכולים להיות מטוהרים באמצעות enChIP. איור 3 כוללים נתונים נציג המציגים את התשואות של enChIP ניתוחי מיקוד הטלומרים והאמרגן של אינטרפרון הגן (IFN) גורם-1 רגולציה (IRF-1). כדוגמאות לתוצאות טיפוסיות, טבלה 1 רשימות החלבונים הקשורים לאמרגן IRF-1 באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC, טבלה 2 רשימות מחייבים חלבוני הטלומרים זוהו על ידי enChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (enChIP-MS) , ולוח 3 רשימות RNAs קשורים עם הטלומרים זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq.

figure-results-1
איור 1. סקירה כללית של enChIP. CRISPR באמצעות enChIP (A, B) וטל (C, D, E אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. רצף של gBlock. אמרגן U6 (בשחור), ב נוקלאוטיד Gefore רצף המדריך (בכחול), רצף המדריך (spacer gRNA) (באדום), רצף הפיגום (בירוק), ורצף שליחות קטלנית (בכתום) מוצגים.

figure-results-3
איור 3. תשואות של enChIP נציג ניתוחים. אחוז () תשומות ליעד לוקוס IRF-1 ומוקד Sox2 היעד הלא. אחוז (ב) תשומות להטלומרים היעד וγ-לווינים שאינם יעד. הנתונים הותאמו ושונים מפרסומים קודמים 15,16.

קטגוריות חלבונים
תַעֲתוּק DDX1, PARP1, CKAP4, הומולוג Pescadillo, PURβ,
פולימראז מופעל RNA השני P15 activator תעתיק,
BTF3, Myb מחייב1A חלבון
deacetylation היסטון,
רכיבי corepressor 		RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetyltransferase N-methyltransferase ארגינין חלבון 1
topoisomerase DNA 2α topoisomerase DNA
ההיסטונים היסטון H2A.Z, H3.2 היסטון

טבלת 1:. דוגמאות לחלבונים הקשורים לאזור האמרגן IRF-1 האנושי באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC השולחן הותאם מפרסום קודם 16.

קטגוריות חלבונים
מחייבים חלבוני הטלומרים יונקים PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
הטלומרים-דוחלבוני nding בשמרים
או אורגניזמים אחרים 		IMP4
חלבוני אינטראקציה עם הטלומרים מחייבים
חלבונים [חלבון קושר הטלומרים קשורים] 		DNA פולימראז α [Cdc13p] (POLA1),
ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1],
exportin-5 [טרט], GNL3L [TRF1],
exportin-1 [טרט], 14-3-3 [טרט]
חלבוני לוקליזציה לheterochromatin BEND3
חלבונים המסדירים סימנים אפיגנטיים KDM5C
חלבוני מוטציות שמשפיעים על תפקוד הטלומרים α DNA פולימרז (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
גלוטמט-ציסטאין האנזים, מסוג glutaredoxin, SMRC1

טבלה 2:. דוגמאות לחלבונים הקשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-MS השולחן הייתה adapteד מפרסום קודם 15.

קטגוריות RNAs
רכיבי טלומרז Terc, Rmrp
Telomeric RNAs טראס
scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA Neat1

לוח 3: דוגמאות לRNAs קשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq השולחן הותאם מפרסום קודם 17..

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים טיהור של אזורים גנומיים ספציפיים באמצעות מולקולות קושרות DNA מהונדסות כגון מערכת CRISPR וחלבוני TAL, וזיהוי חלבונים ורנ"א הקשורים לאזורים גנומיים אלה. קשירה של מולקולות קושרות DNA מהונדסות לגנום עשויה להשפיע על מבנה הכרומטין, כולל מיקום נוקלאוזום, ועשויה לבטל תפקודים גנומיים, כמתואר בניסויי הפרעות CRISPR21. כדי להימנע מהשפעות חריגות פוטנציאליות אלה, אנו מציעים הנחיות ספציפיות לבחירת אזורים גנומיים יעד. ראשית, כדי למנוע עיכוב פוטנציאלי של גיוס RNA פולימראז וגורמי שעתוק, כמו גם שיבוש במיקום הנוקלאוזום סביב אתר התחלת השעתוק, אזורי היעד לניתוחים של אזורי מקדם צריכים להיות כמה מאות זוגות בסיסים במעלה הזרם של (5' ל) אתר התחלת השעתוק. לעומת זאת, כאשר מנתחים אזורים גנומיים עם גבולות ברורים, כגון משפרים ומשתיקי קול, ניתן למקד אזורים גנומיים הסמוכים ישירות לאזורים אלה מכיוון שפחות סביר שקשירה של מולקולות קשירת DNA מהונדסות תשפיע על תפקודיהם. יתר על כן, עדיף להימנע משימוש באזורי מטרה שנשמרו בקרב מינים שונים, מכיוון שמולקולות חשובות קושרות DNA נקשרות לעתים קרובות לאזורים שהשתמרו אבולוציונית ועיכוב הקישור שלהן עלול לשבש את תפקודי האזורים הגנומיים של המטרה. בהקשר זה, תמיד יש צורך לבדוק שתפקוד האזור הגנומי היעד נשמר בתאים המבוססים המשמשים לניתוחי enChIP. מכיוון שניתן לבדוק מספר gRNAs בקלות וזה מייגע ויקר לייצר גרסאות מרובות של חלבוני TAL או אצבע אבץ המזהים אזורים גנומיים שונים של מטרה, enChIP באמצעות CRISPR הוא יתרון יותר מאשר enChIP באמצעות חלבונים אחרים.

הוכח כי dCas9 נקשר לאתרים מחוץ למטרה, אם כי הזיקה לאתרים אלה עשויה להיות חלשה יותר מזו לאתרי היעד22-25. ישנן מספר דרכים לנהל זיהום של מולקולות הקשורות לאותם אתרים מחוץ למטרה. ראשית, מומלץ להשתמש בכמה, לפחות שניים, gRNAs שונים. המולקולות הנצפות בדרך כלל ב-enChIP באמצעות gRNAs מובחנים יהיו חיוביות אמיתיות. שנית, השוואה בין תנאים שונים ל-enChIP תהיה יעילה בביטול זיהום של מולקולות לא ספציפיות ומולקולות הקשורות לאתרים מחוץ למטרה. דוגמאות לקבוצות השוואה אלה יהיו (i) גירוי (-) ו-(+), או (ii) סוגי תאים שונים כגון תאי T לעומת תאי B. לבסוף, יש לבצע ניתוח כמותי של קשירה של מולקולות מועמדות כדי לאשר את הקישור הספציפי שלהן לאתרי היעד. עדיף להכין תאים המבטאים רק dCas9 אך לא gRNA כבקרה שלילית.

באמצעות ניתוחי enChIP, הצלחנו לזהות בהצלחה מספר מולקולות ידועות וחדשות המקיימות אינטראקציה עם אזורים גנומיים ספציפיים (טבלאות 1-3)14-17. עם זאת, טכניקה זו לא הצליחה לזהות כמה חלבונים ידועים אחרים המקיימים אינטראקציה עם אזורים אלה. לדוגמה, על פי הדיווחים, STAT1 נקשר למקדם IRF-1 בגירוי IFNγ8, אך ניתוח enChIP-SILAC שלנו לא זיהה את STAT1 כחלבון המושרה לאינטראקציה עם אזור גנומי זה16. בנוסף, בניתוח enChIP-MS של טלומרים, לא זיהינו חלבוני מחסה המורכבים מ-TRF-1 ו-TRF-215, שהוכחו כמקיימים אינטראקציה עם טלומרים26. ישנן כמה סיבות פוטנציאליות לפערים הללו. ראשית, הסטוכיומטריה של קשירה של Stat1 למקדם IRF-1 עשויה להיות נמוכה מאוד. סביר ש-enChIP-MS, כולל enChIP-SILAC, מזהה חלבונים הקשורים בשפע לאזורים גנומיים מטרה; לפיכך, ייתכן שיהיה צורך בניתוח של תאים נוספים כדי לזהות חלבונים אלה. עלייה ברגישויות של מכשירי טרשת נפוצה תתרום גם לזיהוי יעיל של חלבונים עם קשירה סטוכיומטרית נמוכה. שנית, חלבונים מסוימים, אולי כולל Stat1 ומקלטים, עשויים להיות מטרות קשות לניתוחי טרשת נפוצה. שלישית, בניתוח שלנו של חלבונים קושרי טלומר15, חלבוני 3×FLAG-TAL המזהים טלומרים (3×FN-Tel-TAL) עשויים לחסום את הקישור של מקלטינים לטלומרים בצורה תחרותית.

בניגוד לקושי היחסי בזיהוי גורמי שעתוק הנקשרים לאזורים גנומיים ספציפיים באמצעות enChIP, זיהינו בהצלחה מווסתים אפיגנטיים כגון אנזימי שינוי היסטון באמצעות אנליזות enChIP. הצלחתה של טכניקה זו עשויה לנבוע מהעובדה שמווסתים אפיגנטיים נקשרים למגוון רחב של אזורים גנומיים; לפיכך, יותר חלבונים לכל אזור גנומי זמינים עבור טרשת נפוצה. מכיוון שמווסתים אפיגנטיים מוכרים יותר ויותר כמטרות חשובות לתרופות נגד מחלות קשות כמו סרטן, enChIP יהיה כלי שימושי לזיהוי מטרות תרופות אפיגנטיות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הגישו פטנט על enChIP (שם הפטנט: 'שיטה לבידוד אזורים גנומיים ספציפיים באמצעות מולקולות קושרות DNA המזהות רצפי DNA אנדוגניים'; מספר פטנט: PCT/JP2013/74107). ה.פ. הוא חבר בוועדה המייעצת של Addgene.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדע טאקדה (TF); זכוכית קרן אסאהי; קרן Uehara הזיכרון (HF); Kurata זיכרון Hitachi מדע וטכנולוגית קרן (TF וHF); גרנט ב- סיוע למדענים צעירים (B) (# 25,830,131), גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ג) (# 15K06895) (TF); וגרנט ב- סיוע, גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ב) (# 15H04329), גרנט ב- סיוע למחקר גישוש (למחקר מדעי על "מחזור תמלול 'תחומי חדשניים (# 25,118,512 & # 15H01354) # 26650059) ו'הגנום תמיכה '(# 221S0002) (HF) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שירות הסינתזה של gBlockLifeTechnologies סינתזת גנים על ידי GeneArt
שירות הסינתזה של gBlockIDT (טכנולוגיות DNA משולבות)gBlocks שברי
pSIR-neoAddgene51128
pSIR-GFPAddgene51134
pSIR-DsRed-Express2Addgene51135
pSIR-hCD2Addgene51143
שירות סינתזה TALLife TechnologiesGeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1Addgene47948
3× FLAG-dCas9/pMXs-puroAddgene51240
3&פעמים; FLAG-dCas9/pMXs-IGAddgene51258
3&פעמים; FLAG-dCas9/pMXs-I2Addgene51259
3&פעמים; FLAG-dCas9/pMXs-neoAddgene51260
anti-FLAG M2 AbSigma-AldrichF1804
FITC-מצומד נגד FLAG M2Sigma-AldrichF4049
מדיום DMEM עבור SILACLife Technologies89985ניתן לרכוש מדיום אחר מ-Life Technologies
Dialyzed FBS עבור SILACLife Technologies89986
L-ליזין-2HCl עבור SILACLife Technologies89987עבור בינוני
קל L-ארגינין-HCl עבור SILACLife Technologies89989עבור בינוני
קל L-ליזין-2HCl, 13C6 עבור SILACLife Technologies89988עבור כבד
בינוני L-ארגינין-HCl, 13C6, 15N4 עבור SILACLife Technologies89990עבור כבד בינוני
שלם, מיני, אבחון Roche4693159
משבש אולטרסאונד UD-201Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & רכזZymo ResearchD5205
Dynabeads-Protein GLife TechnologiesDB10004
מעכב RNasin Plus RNasePromegaN2611
Isogen IINippon Gene311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050
LTQ Orbitrap VelosThermo Fisher Scientificרכיב של מערכת nanoLC-MS/MS לניתוח MS
nanoLCAdvance, Michrom Bioresourcesרכיב של מערכת nanoLC-MS/MS לניתוח MS
HTC-PAL autosamplerCTC Analyticsרכיב של מערכת nanoLC-MS/MS לניתוח MS
גנים ללא EDTA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109(2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171(2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084(2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387(2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213(2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

enChIPCRISPR dCas9TALRNAAnti FLAG

מאמרים קשורים