הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Orthotopic הינד לימב השתלה בבית העכבר

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53483

⸱

12 בפברואר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מודל הרומן הזה להשתלה הגפיים האחוריות orthotopic בתוך העכבר, החלת טכניקה השרוול הלא תפר עבור השקה סופר-כלי הדם, מספק כלי רב עוצמה עבור מחקר אימונולוגי מכניסטית in vivo הקשורים אלוגרפט מרוכבים vascularized (VCA).

תקציר

מערכות מודלים של בעלי חיים, ובמיוחד מודלים של עכברים, התפתחו לכלים מדעיים רבי עוצמה ורב-תכליתיים החיוניים למחקר בסיסי ותרגומי בתחום רפואת ההשתלות. מגוון עצום של ריאגנטים זמין אך ורק בסביבה זו, כולל נוגדנים חד-שבטיים ופוליקלונליים ליישומים אבחנתיים והתערבותיים כאחד. בנוסף, מספר עצום של זנים גנוטיפיים, מולדים, טרנסגניים ונוק-אאוט מאפשרים חקירה מפורטת של התרומות האישיות של רכיבים הומורליים ותאים ליחסי הגומלין המורכבים של תגובה חיסונית והופכים את העכבר לסטנדרט הזהב למחקר אימונולוגי.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) מתאר תחום חדש של השתלה באמצעות השתלות אלוגרפט כדי להחליף "דומה בכמו" בחולים הסובלים מאובדן רקמות טראומטי או מולד. פרוטוקול מתודולוגי כירורגי זה מראה את השימוש בטכניקת שרוול ללא תפר לאנסטומוזה סופר-מיקרו-וסקולרית במודל השתלת גפיים אחוריות של עכבר אורתוטופי. המודל מאפשר באופן ספציפי השוואה בין פרדיגמות מבוססות בהשתלת איברים מוצקים עם צורה חדשה של השתלות המורכבת ממרכיבי רקמה שונים ושונים. באופן ייחודי, מודל זה מאפשר השתלה של תא מח עצם ונישה ברי קיימא שיש להם פוטנציאל להשפיע לטובה על איזון הקבלה והדחייה של מערכת החיסון. טכניקה זו מספקת כלי לחקירת זיהוי אלואנטיגן ודחייה וקבלה של אלוגרפט, כמו גם מאפשרת להמשיך במחקרי התחדשות עצבים תפקודיים כדי לקדם עוד יותר את תחום ההשתלה החדשני הזה.

מבוא

סוף שנות התשעים בישרו את הימים החלוציים של השתלות משחזרות עם השתלת היד המוצלחת הראשונה שבוצעה בצרפת בשנת 1998. מאז, השימוש ב-VCAs לשחזור פגמים הרסניים ברקמות הופעל בהצלחה בספקטרום רחב של חולים. נכון להיום, העולם סופר 76 מקבלי 112 גפיים עליונות וכן 31 פנים 1-3. בנוסף, בוצעו מספר סוגים נוספים של VCAs כגון דופן הבטן 4, גרון 5, קנה הנשימה 6, מפרקים כלי דם 7 ואפילו פין 8. יתר על כן, לאחרונה דווח על לידת חי של תינוק לאחר השתלת רחם 9. ניסיון עולמי הולך וגדל זה מעיד על האופן שבו השתלה משחזרת הפכה לאופציה טיפולית תקפה עבור חולים הסובלים מפגמים תפקודיים משמעותיים ברקמות שאינם ניתנים לתיקון לניתוחים וטיפולים משחזרים ומשקמים קונבנציונליים.

בעוד שהרעיון של החלפת "דומה בכמו" עורר התלהבות קלינית, הספקנות הראשונית עדיין שוררת לגבי תופעות הלוואי של דיכוי חיסוני קונבנציונלי במינון גבוה הנדרש לשמירה על השתלות ותפקודן 10,11. עם זאת, כפי שהוכח על ידי עבודתם המכוננת של לי ועמיתיו, השתלים המרוכבים הללו נוטים פחות לדחות מאשר מרכיביו הבודדים, ויתר על כן, חלק ממרכיבי הרקמה כמו תא העצם הוסקולרי הזינו אופטימיות מכיוון שהם עשויים להפעיל השפעות אימונולוגיות ייחודיות על מאזן הקבלה והדחייה החיסונית 12.

הקבוצה שלנו הייתה חלוצה במספר מודלים מיקרו-כירורגיים של בעלי חיים להשתלת איברים מוצקים, כמו גם השתלה מרוכבת בכלי דם 13-19. כאן אנו מתארים הליך כירורגי חדשני המשתמש בטכניקת שרוול ללא תפר לביצוע אנסטומוזה סופר מיקרו-וסקולרית במודל השתלת גפיים אחוריות של עכבר אורתוטופי. מודל השתלה זה מספק כלי שימושי לחקירת מנגנוני קבלה ודחייה של מערכת החיסון, כמו גם את תפקידם של רכיבי רקמה בודדים, כגון תא מח העצם בכלי הדם, לקראת אינדוקציה של סובלנות בסביבה הרב-תכליתית מבחינה אימונולוגית של מיני העכברים. בנוסף, המיקום האורתוטופי של הגפה פותח את האפשרויות להתחדשות עצבית ולמחקרי תוצאות תפקודיות, שהם חשובים ביותר להגדרת VCA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ושימוש (JHUACUC). הנהלים הספציפיים בוצעו תחת MO13M108 פרוטוקול ACUC אושר.

מבצע התורם 1.

  1. נהל שיכוך כאבים בנקודת הזמן המתאים לכל ניסוח תרופתי לפני ניתוח. על פי השימוש בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש אישרה 0.1 מ"ג / ק"ג BW של עצירות תת עורי 1 hr לפני החתך בעור.
  2. התורם שלווה עם isoflurane מיושם באמצעות תא המצורף מאדה isoflurane ב 4%; לשמור הרגעה והרדמה ב -2% באמצעות חרטומו. בצע השתקפות נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה לפני תחילתו של ההליך.
  3. לובשים מסכות, שמלות בידוד הפנויה וכפפות.
  4. לגלח את ar כירורגיתea, בפרט הגפה ובמפשעה האחוריות, ו prep עם 10% Povidone - יוד.
  5. השתמש וילון שדה סטרילי, מכשירים autoclaved ו מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה (40X).
  6. בצעו חתך עור במפשעה באמצעות מספרי proximally לאזור אמצע הירכיים ואת circumferentially לחבר את החתך כדי לתחום את הגפיים אחוריים משאר גוף העכבר.
  7. זהה לנתח את עורק, וריד עצב הירך. הפרד כל שלושת המבנים באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו.
  8. לאחר pedicle וסקולרית הוא גזור לחלק את הכלי ברמה של הרצועה מפשעתי באמצעות מספרי מייקרו.
  9. לאחר מכן, ממשיכים לחלק את גחון הפרט (שרירי ירך gracilis המדיאלי) וקבוצות שרירים הגבו 20 proximally ברמה של ירך האמצע להפריד השתל מן החיה התורמת באמצעות מספריים.
  10. Transect הירך וגוזר באמצע פיר הירך באמצעות מספריים.
  11. להרדים בעלי חיים על ידי fol מנת יתר isofluraneשאחריו נקע בצוואר הרחם. אשר הפסיק פעימה ונשימת לב.
  12. שטוף את האיבר עם 2 מיליליטר heparinized (30 IE) קר (4 ° C) מלוח באמצעות מחט שטיפת G 33 רכובה על מזרק (ראה לוח חומרים).
  13. מניח שרוול polyimide אחד על וריד, ועצם ירך, בהתאמה.
  14. עוטפים השתל לתוך גזה צמר גפן רטוב, מקום בצלחת פטרי ולאחסן ב 4 ° C עד הבלעה.

2. נמען מבצע

  1. הסרת הגפיים האחוריות
    1. נהל שיכוך כאבים בנקודת הזמן המתאים לכל ניסוח תרופתי לפני ניתוח. על פי השימוש בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש אישרה 0.1 מ"ג / ק"ג BW של עצירות SC 1 hr לפני החתך בעור.
    2. התורם שלווה עם isoflurane מיושם באמצעות תא המצורף מאדה isoflurane ב 4%; לשמור הרגעה והרדמה ב -2% באמצעות חרטומו. בצע השתקפות נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על המחלקהשעות של הרדמה לפני תחילתו של ההליך.
    3. השתמש במשחה וטרינריים המשפיעים על העיניים של העכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
    4. לגלח את אזור הניתוח, ובמיוחד הגפיים האחוריות ובמפשעה מכין עם 10% Povidone - יוד.
    5. בצעו חתך עור במפשעה באמצעות מספרי proximally לאזור אמצע הירכיים ואת circumferentially לחבר את החתך כדי לתחום את הגפיים אחוריים משאר גוף העכבר.
    6. זהה לנתח את עורק הירך, וריד ועצב ולהפריד כל שלושת המבנים באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו.
    7. לאחר pedicle וסקולרית הוא גזור, מהדק את כלי הירך ברמה של הרצועה מפשעתי.
    8. חותכים את כלי דיסטלי ברמה של העורק ברום הבטן שטחית.
    9. לאחר מכן, ממשיכים לחלק את גחון הפרט (שרירי ירך gracilis המדיאלי) וקבוצות שרירים הגבו 20 proximally ברמה של ירך האמצע להפריד את האחוריות li הילידיםMB מבעלי החיים לנמען באמצעות מספריים.
    10. Transect הירך באמצע פיר הירך באמצעות מספריים.
    11. לצרוב שרירי ירך transected בעבר כדי למנוע דימום של אתר לנתיחה ובכך איבוד דם נמען.
  2. הַשׁרָשָׁה
    1. להקטין את איבוד הנוזלים על ידי להשקיית שדה הניתוח עם מלח חמים (37 מעלות צלזיוס) והזרקת 0.3 מ"ל תמיסת מלח חמים לפני ואחרי הניתוח.
    2. מניחים את השתל באופן המשקף את עמדת אנטומי מדויק של הגפיים האחוריות יליד ידי יישור עצם הירך של הנמען ואת השתל ולחבר אותם באמצעות מחט השדרה 20 G כמו מסמר תוך לשדי.
    3. Coapt קבוצות שרירים הגחון ועל הגב באמצעות חומר תפר נספג (6-0 Polysorb).
    4. חבר את כלי הירך באמצעות טכניקת השרוול-תפר הכללי; בפירוט, למשוך את הצד המקבל של כלי שיט על האזיקים רכובים בעבר על הכלי המסתיים של גרףt. השתמש תפר 10-0 ניילון ולבצע עניבה היקפית כדי לתקן את ספינת הנמען על השרוול.
    5. הבא לשחרר את המלחציים. בשלב זה לוודא ויזואלית סיבוב שרוול ומיצוב אופטימלי כדי למנוע אי-סיבוב מסתלסל של הכלים.
    6. בצע המוסטאסיס מוקפד באמצעות כוויית אלקטרו עם דגש מיוחד על הממשק התורם למקבל השריר ואת קצות העצם.
    7. סגור את העור באמצעות תפרים ניילון שאינם נספגים (6-0 Ethilon).
    8. לקבוע תנאי normothermic בכך שהוא מאפשר את החיה להתאושש בכלוב שלה תחת מנורת חימום. המשך מעקב שוטף לפחות 4 שעות לפני חזרת אותו למוקד הדיור.
    9. לספק שיכוך כאבים שלאחר הניתוח עם עצירות במינון של 0.1mg / kg SC כל 6-8 שעות במשך 3 ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Performing אלוגרפט מרוכבים vascularized במודל של עכברים באמצעות טכניקה השרוול הלא תפר מאפשר להשיג הישרדות השתל ובעלי חיים טווח מצוין וארוך כפי שמוצג באיור 1. יתר על כן, הוא מייצג שיטה אמינה לקבל תוצאות לשחזור של דחייה של השתל הדרגתית מרוכבים vascularized אלוגרפט כפי שתועד על ידי מהתמונות המוצגות באיור 2. היסטולוגיה H & E של רקמות המתקבל חיות שעברו דחייה נוספת מדגישה את הדינמיקה לשחזור של דחייה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Vascularized Composite אלוגרפט, כגון גפיים עליונים והשתלות פן לשיקום פגמי רקמות הרסניות, התפתח כאפשרות טיפול תקפה בחולים לא amendable להליכים שיקומיים קונבנציונליים. התקדמות טכנית בתחום המיקרו-כירורגיה לשחזור וכן ניסיון רב עם אימונוסופרסיבי החזק וטיפולי modulatory חיסוניים בהשתלות איברים מוצקות, מאפשרת כעת הישרדות של שתל לטווח ארוך באוכלוסיית חולים ייחודית זו 3,21. עם זאת, תופעות לוואי משמעותיות של דיכוי חיסוני ארוכת הטווח הנדרשת לצורך תחזוקה של השתל והישרדות עדיין להגב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הצבא, חיל הים, NIH, חיל האוויר, VA לענייני בריאות לתמוך במאמץ AFIRM השנייה, תחת פרס מס W81XWH-13-2-0053. פעילות רכישה הצבא האמריקני למחקר רפואי, 820 צ'נדלר רחוב, פורט דטריק MD 21,702-5,014 הוא משרד הרכישה הענקת וניהלה. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן על דעת המחבר ואינם שאושרו בהכרח על ידי משרד הגנה.

המחברים מבקשים להודות ג'סיקה איזי, DVM, קרוליין גארט, DVM וג'ולי ווטסון, DVM לתמיכת הווטרינרים המעולה שלהם במהלך המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר, 6-0 ניילוןMWI31849
תפר, 6-0 תפר פוליסורבMWI72667
, 10-0 ניילוןAero SurgicalTK-107038
צינורות פולימיד, גודל 25Vention Medical141-0023
צינורות פולימיד, גודל 27Vention Medical141-0015
מהדקים מיקרו-וסקולריים (יחיד)Synovis00396
מהדקים מיקרו-וסקולריים (כפולים)Synovis00414
מיקרו-מספרייםSynovisSAS-18
מיקרו-מלקחייםSynovisFRS-15 RM-8
מיקרו-מרחיביםSynovisFRS-15 RM-8d.1
מיקרו-מחטSynovisC-14
מוליך מיקרו-מהדקSynovisCAF-4
מחט מיקרו-שטיפההמילטון10 מ"מ, 30°, 33G
תמיסת צלצולים חלבפישר סיינטיפיקNC9968051
בופרנורפיןמספר DEA נדרש; מתקבל מבית מרקחת בית חולים.
אנרופלוקסצין; BaytrilBayer Health Care186599
Heparinמתקבל מבית מרקחת בית חולים

מקורות

  1. Khalifian, S., et al. Facial transplantation: the first 9 years. Lancet. , (2014).
  2. Petruzzo, P., Dubernard, J. M. The International Registry on Hand and Composite Tissue allotransplantation. Clin. Transpl. , 247-253 (2011).
  3. Shores, J. T., Brandacher, G., Lee, W. A. Hand and Upper Extremity Transplantation: An Update of Outcomes in the Worldwide Experience. Plast. Reconstr. Surg. , (2014).
  4. Levi, D. M., et al. Transplantation of the abdominal wall. Lancet. 361, 2173-2176 (2003).
  5. Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. N.Engl.J. Med. 344, 1676-1679 (2001).
  6. Rose, K. G., Sesterhenn, K., Wustrow, F. Tracheal allotransplantation in man. Lancet. 1, 433(1979).
  7. Hofmann, G. O., et al. Allogeneic vascularized transplantation of human femoral diaphyses and total knee joints--first clinical experiences. Transplant. Proc. 30, 2754-2761 (1998).
  8. Hu, W., et al. A preliminary report of penile transplantation. Eur. Urol. 50, 851-853 (2006).
  9. Brannstrom, M., et al. Livebirth after uterus transplantation. Lancet. , (2014).
  10. Sarhane, K. A., et al. Diagnosing skin rejection in vascularized composite allotransplantation: advances and challenges. Clin. Transplant. 28, 277-285 (2014).
  11. Schneeberger, S., Khalifian, S., Brandacher, G. Immunosuppression and monitoring of rejection in hand transplantation. Tech. Hand Up. Extrem. Surg. 17, 208-214 (2013).
  12. Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast. Reconstr. Surg. 87, 401-411 (1991).
  13. Sucher, R., et al. Hemiface allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 129, 867-870 (2012).
  14. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
  15. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
  16. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).
  17. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
  18. Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp. , (2010).
  19. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J. Surg. Res. 93, 97-100 (2000).
  20. Zhang, F., et al. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19, 209-213 (1999).
  21. Schneeberger, S., et al. Upper-extremity transplantation using a cell-based protocol to minimize immunosuppression. Ann. Surg. 257, 345-351 (2013).
  22. Azari, K., Brandacher, G. Vascularized composite allotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 631-632 (2013).
  23. Pomahac, B., Gobble, R. M., Schneeberger, S. Facial and hand allotransplantation. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, (2014).
  24. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3, a015495(2013).
  25. Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 133, 133e-141e (2014).
  26. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. J. Surg. Res. 24, 501-506 (1978).
  27. Leto Barone, A. A., et al. The gracilis myocutaneous free flap in swine: an advantageous preclinical model for vascularized composite allograft transplantation research. Microsurgery. 33, 51-55 (2013).
  28. Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 26, 201-207 (2010).
  29. Barth, R. N., et al. Prolonged survival of composite facial allografts in non-human primates associated with posttransplant lymphoproliferative disorder. Transplantation. 88, 1242-1250 (2009).
  30. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Res C Embryo Today. 96, 39-50 (2012).
  31. Foster, R. D., Liu, T. Orthotopic hindlimb transplantation in the mouse. J. Reconstr. Microsurg. 19, 49(2002).
  32. Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a Mouse Model for Heterotopic Limb and Composite-Tissue Transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 17, 267-274 (2001).
  33. Zhang, F., Shi, D. Y., Kryger, Z., Moon, W. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19 (5), 209-213 (1999).
  34. Schneeberger, S., et al. Atypical acute rejection after hand transplantation. Am. J. Transplant. 8, 688-696 (2008).
  35. Mathes, D. W., et al. Stable mixed hematopoietic chimerism permits tolerance of vascularized composite allografts across a full major histocompatibility mismatch in swine. Transpl. Int. 27, 1086-1096 (2014).
  36. Yamada, Y., et al. Use of CTLA4Ig for induction of mixed chimerism and renal allograft tolerance in nonhuman primates. Am. J. Transplant. 14, 2704-2712 (2014).
  37. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, a015529(2014).
  38. Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 358, 353-361 (2008).
  39. Kawai, T., Sachs, D. H. Tolerance induction: hematopoietic chimerism. Curr Opin Organ Transplant. 18, 402-407 (2013).
  40. Kawai, T., Sachs, D. H., Sykes, M., Cosimi, A. .B. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 368, 1850-1852 (2013).
  41. Leventhal, J., et al. Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation. Sci. Transl. Med. 4, 124-128 (2012).
  42. Cendales, L. C., et al. The Banff 2007 working classification of skin-containing composite tissue allograft pathology. Am. J. Transplant. 8, 1396-1400 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל עכברהשתלת רקמה מורכבת ומסvקולריזית (Vascularized Composite Allotransplantation)טכניקת שרוול ללא תפריםאנסטומוזיס סופר-מיקרו-וסקולריתדיסקציה של העורק והוריד הפמורלייםיישום שרוול פוליאימידיישור עצם הפמורקירוב קבוצות שריריםניתוח דחיית השתלה אלוגנאית
Orthotopic הינד לימב השתלה בבית העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.