הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת

11.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53488

⸱

23 בינואר 2016

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול וידאו שלב אחר שלב של כריתה אפיקלית מודגם במחקר זה. כריתה אפיקלית היא גישה כירורגית שהודגשה לאחרונה במחקר התחדשות לב של יונקים. מחקר זה עשוי לקדם את היישום של כריתה אפיקלית כמתודולוגיה סטנדרטית במחקר על המנגנון העומד בבסיס התחדשות הלב.

תקציר

מחלת לב וכלי דם המכות כל העולם בשל שינויים באורח חיים אינטנסיביים. התחדשות לב טומנת בחובו הבטחה גדולה לתיקון ושחזור cardiomyocytes איבד בגלל פציעה ומחלה. בניגוד להתחדשות הלב החזקה של בעלי חוליות התחתונות מסוימים, לב של יונקים בוגרים בדרך כלל להראות יכולת מינימאלית להתחדשות לב ותיקון. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה עוררו עניין מדעי רב עם הממצא ש, בין יום הלידה 1 עד 7 (P1 לP7), לב העכבר בילוד שומר פוטנציאל התחדשות משמעותי לאחר כריתת הפסגה (כלומר, קטיעה כירורגית וחשיפה של קודקוד של חדר השמאלי). מחלוקת עיקרית אחת מעל ממצא זה יכול להיות בגלל הנהלים הקשורים לניתוח המגוונים המשמשים במאמצים כדי לשכפל או להרחיב על ממצא חשוב זה. הוראות אלה באופן דינמי להציג את חומרים ומתודולוגיה לכריתת הפסגה במודל של עכברים. הצעדים הבולטים של surviva מכרסם זההניתוח כרוך בהרדמה l היפותרמיה, פתיחת בית החזה, כריתה כירורגית של קודקוד של חדר לב, ותפר והתאוששות של עכברים. הגישה המתוארת יכול להרחיב את היישום של מודל עכבר כריתת הפסגה למחקר לב וכלי דם.

מבוא

תוחלת חיים ממושכת מובילה למחלות שונות הקשורות להזדקנות ולאורח חיים, כולל אי ספיקת לב, גורם מוביל לתמותה. עם זאת, ללא החלפה של תאי שריר לב שאבדו או לא מתפקדים, הטיפולים הנוכחיים יכולים רק לשפר באופן זמני את תפקוד הלב1, 2. לפיכך, יש צורך לגלות ולפתח אסטרטגיות חדשניות להתחדשות ותיקון הלב. ללב היונקים הבוגר יש פוטנציאל התחדשות מוגבל. מחקרים מבעלי חוליות נמוכים יותר, כגון דו-חיים ודגי טלאוסט, סיפקו תובנות חסרות תקדים לגבי המנגנונים המולקולריים והתאים העומדים בבסיס התחדשות הלב3, 4. לאחרונה הופיע מודל עכברי יילודים של התחדשות לב שעשוי לאפשר זיהוי ואפיון של אירועים פתופיזיולוגיים שמורים יותר מבחינה אבולוציונית הנדרשים להתחדשות לב אנושית5.

כריתה אפיקלית מתייחסת להסרה כירורגית של קודקוד החדר השמאלי. הליך זה מוגבל לעכברים בני 1 עד 7 ימים (P1 עד P7) בשל הקטלניות הגבוהה שלו בעכברים מבוגרים6. תהליך התחדשות הלב בעכברים יילודים לאחר כריתה אפיקלית צפוי להיות כדלקמן: (I) היווצרות מהירה ויעילה של המטומה כדי לאטום את הקודקוד ולמנוע אקסנגווינציה; (II) התחדשות קרדיומיוציטים ושיקום התפקוד הסיסטולי5, 7. עבודות אחרונות עוררו דיון על המשמעות והיעילות של מודל8-11 זה. לפיכך, חשוב להציג את הכריתה האפיקלית בצורה ברורה ומפורטת. לשם כך, פרוטוקול זה מתאר בצורה חיה וספציפית סרטון וידאו של איך ביצעתי כריתה אפיקלית בהתבסס על פרוטוקולקודם 6.

הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הלב היא בעלת חשיבות לטיפול במחלות לב המאופיינות באובדן ו/או פגיעה בקרדיומיוציטים, כגון אי ספיקת לב1, 2. בהתחשב בהתקדמות הנוכחית והמבטיחה של כריתה אפיקלית בחקר התחדשות הלב, מחקר זה יכול לקדם את השימוש בטכניקה זו ואת השימושים שלה במחקר התחדשות הלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי העכבר אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים ושימוש בתכנית במכון הלאומי לבריאות (NIH) עם מספר פרוטוקול H0083R3. NHLBI IACUC אישר את הפרוטוקול ללא משככי כאבים.

1. היפותרמיה הרדמה בעכברים בילוד

  1. לעקר ספוגים וציוד כירורגי בחיטוי לפני הניתוח. הכן את כל החומרים כירורגית ולעבור על דקות 15-20 מעקר חרוז חם מראש להגיע 240 מעלות צלזיוס עד 270 מעלות צלזיוס.
  2. העבר את כל C57BL הגורים / 6 (P1 גיל) מאם הסיעוד שלהם לכלוב עכבר נקי עם מצעים טריים וחומרי קינון. ברגע שהגורים נלקחים לחדר ניתוח, לבצע את ניתוח הפסגה מייד כדי למזער את זמנם בילה מופרד מאמו וכדי להפחית את הסיכון של קניבליזציה האימהית.
  3. שימו ספוגים על מיטת קרח ולאחר מכן למקם גור אחד בספוג ל~ 3 דקות כדי להשיג הרדמה היפותרמיה. לאשר הרדמה על ידי התבוננות APNea ואקינזיה וצובטת את רגל אחורית. בדוק את המצב של ילודים לעתים קרובות בגלל מעט מדי זמן לא יעשה את האקינטי הגור וapneic, ומשך מוגזם של הרדמה יכול להוריד את שיעור הישרדות 12.

2. פתיחת בית החזה

  1. העבר את הגור מהמיטה הקרח על אזור benchtop כירורגית ולהשתמש בקלטת כדי לשתק את זרועות, רגליים, והזנב שלה במצב שכיבה.
  2. לחטא את החזה באמצעות בטאדין ועדינות לנקות אותו באמצעות 70% משטח הכנת אלכוהול.
  3. לעשות חתך בעור רוחבי לאורך האזור הלאה הצלע של חלל החזה באמצעות Vannas אביב מספריים, ולאחר מכן להקהות לנתח את השרירים הלאה צלע כדי להקל על גישה ללב.
    הערה: שיעורי הישרדות לשפר כאשר אובדן דם ממוזער במהלך התהליך כירורגי.

3. קטיעה כירורגית של לב חדרית איפקס

  1. ביד, בעדינות להפעיל לחצו על הבטן כדי exteriorizeשיאו של הלב. ספוג דם סביב אזור הניתוח עם החלת כותנה שקצה סטרילי להדמיה ברורה. לילודי שליטת דמה המופעל, להמשיך ישירות לשלב 4 (תפרים ושחזור של עכברים).
  2. מתחת לפנס מגדלת ושימוש iridectomy מספריים, בעדינות לבצע כריתת טיפין טיפין של החדר השמאלי (LV) עד תא LV חשוף. להיות זהיר כדי למזער את החלקים שעברו כריתה של LV. כ -15% כריתה היא הכרחית כדי להשיג חשיפה אופטימלית של חדר LV.
  3. ודא שהלב חוזר לחלל החזה פעם אחת קאמרי LV חשוף.

4. תפר ושחזור של עכברים

  1. לתפור את הצלעות ושרירים יחד כדי לאטום את חלל החזה באמצעות תפרי פרולין 6-0 סטרילי, ולאחר מכן לסגור בקפידה אתר חתך בעור באמצעות דבק עור.
  2. לחמם את הילוד תחת מנורת חום ל~ 3 דקות להתאוששות, ולאחר מכן לנקות את עקבות דם ודבק באמצעות 70% משטח הכנת אלכוהול befoמחדש reintroducing להמלטה שלה. לנסות להשלים את כל ההליך כירורגי בתוך 10 דקות, כי צמצום המשך הזמן מופרד מהאם משפר הישרדות גור לאחר כריתת הפסגה.
  3. לאחר כל ניתוח, למקם את הכלים כירורגיים במגע עם חרוזים של מעקר חרוז החם לכ -20 שניות לעיקור מלא. לאפשר כלים כירורגיים להתקרר לRT לפני כל ניתוח.
  4. לאחר שסיים את הניתוחים לכל הגורים בהמלטה, לערבב את הגורים עם המצעים של האמא וצואה לפני החזרתם לקן של האמא.
    הערה: באופן כללי, עכברי ICR / CD-1 הן אמהות אומנה טובה יותר מאשר C57BL / 6, אבל גם בקרב אמהות מניקות מאותו הרקע הגנטי, אינסטינקטים טיפוח להשתנות. אם שינוי אם מניקה יש צורך להפחית תמותה על ידי קניבלים אימהיים, להסיר את גורי P0 לאם מניקה ולאחר מכן לבצע כריתת הפסגה בP1. לבצע גם את פעולת דמה או r הפסגה רקesection בהמלטה אחת גורים, כי דמה ערבוב וגורים כירורגית יכולים להפחית את שיעורי ההישרדות של הקבוצה כירורגית של גורים 6.

ניתוח 5. לאחר ניתוח

  1. יום אחד לאחר הניתוח, לעקוב אחר הגורים, להבטיח שאין הבדל בין זיוף וקבוצות כירורגית, ולספור את מספר הגורים למדוד את שיעור ההישרדות. אם הניתוחים מבוצעים כראוי, שיעורי ההישרדות צריכים להיות דומים ויותר מ -60% בשני קבוצות דמה וניתוחיות.
  2. בידוד לב וקיבעון.
    1. להרדים את הגורים בימים 1 ו -2 לאחר ניתוח באמצעות עריפת ראש ויום 21 לאחר ניתוח על ידי CO2 עם הבטחה של מוות על ידי נקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן לנקות את החזה באמצעות הכנת אלכוהול 70%.
    2. לחתוך את העור ושרירים קו האמצע של החזה ולאחר מכן פתח את החזה.
    3. בלו כל הלב מחלל בית החזה ולתקן את כל הלב של כל דגימה ב 5 מיליליטר של 4% O paraformaldehyde / N ב RT.
  3. ביום שלמחרת, להעביר את הדגימות לאתנול 70%. דוגמאות ניתן לאחסן עד שבוע לפני הטבעת פרפין.
  4. סעיפי Slice 5-מיקרומטר בעובי פרפין דרך כל החדר ולבצע hematoxylin הסטנדרטי וeosin (H & E) וצביעת Trichrome של האסון לבחון את התגובה 5 משובי, 7. באופן ספציפי, כתם H & E משמש כדי לבחון החלפת שריר וכתם Trichrome של האסון משמש כדי לבחון את תגובות fibrotic 5.
  5. בחר את האזור של עניין ולהקים לפחות שלושה מוקדים לדגימה באמצעות סורק שקופיות באופן ידני. תמונה ולנתח את השקופיות מכתימה ב 40 × הגדלה פי הוראות היצרן עם פרמטרים של ברירת מחדל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גורי עכבר היו מורדמים כריתת פוסט-פסגת 1, 2, ו -21 ימים, ולבם נאספו עבור H & E וכתם Trichrome של האסון. צבע כחול בכתם Trichrome של האסון מציין בתצהיר של מטריקס epicardial 5. עם כריתת הפסגה מוצלחת, קריש דם נוצר בצורה יעילה כדי לאטום את כריתת פוסט-פסגת יום אחד LV, כפי שמוצג באיור 1 א. ספיגה הדרגתית של קריש הדם ולב סיסטיק המוקדם הוא ציין, והחלפה על ידי רקמת שריר לב מתרחשת עד התחדשות של שריר הלב שלמה מתקיימת 21 ימים לאחר כריתת הפסגה (איור 1 ו- C)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התחדשות הלב מראה פוטנציאל לטיפול ומניעה של אי ספיקת לב1, 2. מודלים של בעלי חיים הם הכרחיים וממלאים תפקיד קריטי בהבנת האופן שבו התחדשות הלב מתרחשת3-6. דו-חיים ודגים רבים מחדשים רקמת לב בתגובה לפציעה, ומספקים תובנה לגבי הבנתנו את מחלות הלב וכלי הדם האנושיות13, 14. במונחים של אבולוציה, לעומת זאת, הפתופיזיולוגיה צריכה להיות שמורה יותר בין מודל עכבר לבני אדם. התחדשות לב במודלים של בעלי חיים של יונקים היא תחום מחקר חדש יחסית אך מתפתח לטיפולים באי ספיקת לב3-6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

עמלות פרסום לכתבה זו מומנו על ידי מתנה מכלי מדע פיין לד"ר ג'יאן הו.

תודות

המחברים מודים בני הזוג. ג'יימס הוקינס, Zu-Xi יו וואן צ'ו מהלב הלאומי, הריאות ודם מכון (NHLBI) לסיוע שלהם עם ניתוח עכבר והכנה וצביעה של חלקי פרפין. המחברים מודים לועדת עורכי עמיתי NIH למערכת סיוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Olsen-Hegar מחזיקי מחטים עם מספריים, 1.5 מ"מFine Science Tools12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 מ"מ Cutting EdgeFine Science Tools15000-03מספריים לכריתת אירידקטומיה
מעקר חרוזים חםFine Science Tools18000-45
מלקחיים לקשתית, ישרים, משונניםכלים מדעיים עדינים11064-07
מלקחיים לקשתיתכלי מדע עדינים מעוקלים ומשוננים11065-07
מספריים שיאה - מעוקל/קהה-קהה/12 ס"מכלי מדע עדינים14105-12
מלקחיים לקשירת תפרים עם ידית עגולה, כליםמדעיים עדינים18025-12
מספריים קפיציים עם ידית עגולה כליםמדעיים עדינים15400-12
מדע עדינים Hemostat13007-12
מנורת מגדלתLuxolamp CorpIM120 
מנורת חימוםברנדט ציוד LLC51152/3
6-0 תפרי פרולןEthicon8889H
דבק עור-דבק רקמות Vetbond 3 חודשים 1469
אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנהDynarex4305
WEBCOL כרית הכנה לאלכוהולCovidien6818בינוני 2 שכבות, 200/BOX, רווי ב-70% איזופרופיל אלכוהול
Curity ספוגים לכל מטרהCovidien9024לא ארוג 4 שכבות, 4 "x4" (10.2 ס"מ ופעמים; 10.2 ס"מ)
יריעת מגן עליונה לספסלKIMTECH SCIENCE754618 אינץ' x 19.5 אינץ' (45.72 ס"מ x 49.53 ס"מ) x 50
0.9% נתרן כלורי, 250 מ"לHospira Inc.NDC 0409-6138-22
Betadine Solution SwabsticksPurdue Products L.P.NDC 67618-153-03
אוטוקלאבTOMY ביולוגיה דיגיטליתSX-700מעקר קיטור בלחץ גבוה
סורק שקופיותHAMAMATSUNanoZoomer 2.0-RS
ישרים כלי

מקורות

  1. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
  2. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
  3. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
  4. Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
  7. Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
  8. Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
  9. Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2(2014).
  10. Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
  11. Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
  12. Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
  13. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
  14. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
  15. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
  16. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.