Method Article

שני פוטונים סימולטני In vivo הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

DOI:

10.3791/53528

⸱

March 13th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר (RSC) באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo בקו העכבר הטרנסגני Thy1-GFP. גישה זו יוצרת אפשרות לחקור את המתאם בין מניפולציות התנהגותיות לשינויים במורפולוגיה העצבית in vivo.

הליך השתלת חלון הגולגולת נחשב מוגבל רק לאזורי קליפת המוח הנגישים בקלות כגון שדה החבית. הגישה שלנו מאפשרת הדמיה של נוירונים ב-RSC בעל כלי דם גבוהים. RSC הוא מרכיב חשוב במעגל המוח האחראי על זיכרון מרחבי, שנחשב בעבר לבעייתי עבור הדמיית שני פוטונים in vivo.

השתלת חלון הגולגולת מעל ה-RSC משולבת עם הזרקה של נגיף אדנו-רקומביננטי המבטא mCherry (rAAVmCherry) לתוך ההיפוקמפוס הגבי. ה-mCherry המתבטא מתפשט להקרנות אקסונליות מההיפוקמפוס ל-RSC, ומאפשר הדמיה של שינויים הן בבוטונים אקסונליים פרה-סינפטיים והן בקוצים דנדריטיים פוסט-סינפטיים בקליפת המוח.

טכניקה זו מאפשרת ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo.

הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון Nencki לביולוגיה ניסויית, פולנית האקדמיה הלאומית למדעים.

הערה: החלק מן הקלעים של הווידאו הקשור מואץ. גורם מהירות מותווה בסצנות אלה.

1. ניתוח הכנה

  1. לעקר את כל הכלים, מיכלי זכוכית עבור נוזלים צמר גפן ב החיטוי. יש להשתמש בכפפות אפשר לוותר עליהן. נקו את שולחן הניתוחים, מסגרת stereotaxic וכל האזור שמסביב עם אתנול 70%. השתמש כרית כירורגית סטריל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביטוי של ה- GFP משנה של נוירונים עכבר כתב Thy1-GFP מאפשר in vivo ההדמיה של דנדריטים קליפת המוח ותחזיות axonal המקומיות RSC. איור 1 א מציג הקרנה מקסימלי של ערימה של תמונות עם דנדריטים GFP חיובים מרובים גלויים. גוף התא הוא מוסתר על ידי עורק. 1B האיור מראה תמונה אחת מטוס תקריב (זום דיגיטלי 3x) של סניף הדנדריטים המצוין 1A. פרטים של מורפולוגיה הדנדריטים (קוצים, filopodia) נראים בבירור. ערוץ GFP נרכש באמצעות מס.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החוזר המסומן ואת העצם העגול מוסר. לאחר דימום פסק, mCherry מרמת rAAV2 / 1 מוזרקת לתוך ההיפוקמפוס, וכן מכסה זכוכית מקובע הגולגולת מעל אזור הקדח. לבסוף לבר הקיבעון מאובטח על ראש החיה מושמת ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים (KL, MR, KR) יש זכויות פטנט (PL410001) עבור מסגרת מחזיק בסעיף זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי - קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית "כלכלה חדשנית" עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>תרופה
איזופלורןבקסטרAErrane 8DG96235-2% טרום ניתוח
איזופלורןבקסטרAErrane 8DG96231.5-2% במהלך הניתוח
דקסמטזוןסריקת וטרינרדקסאון 2 מ"ג/מ"ל0.2 מ"ג/ק"ג תוך שרירי
Baytril Bayer2.50%5 מ"ג/ק"ג תת עורי
טולפדיןוטוקינול4%4 מ"ג/ק"ג תת עורי
בוטומידורריכטר פארמה10 מ"ג/מ"ל 2 מ"ג/ק"ג תת עורי
קרפרופןKRKA-PolskaRycarfa 50 מ"ג/מ"ל10 מ"ג/ק"ג תת עורי
לידוקאיןג'לפהליגנוקאינוםמקומי
לידוקאיןג'לפה20 מ"ג/גרםבאופן מקומי
<ניתוח>חזק
קצף קצףאתיקוןספונגוסטן; REF MS0005
משחת עינייםDedraLubrithalבאופן מקומי
CA דבקPelikan Daniel20G Huste
אקריליק שינייםSpofaDentalDuracryl Plus
מסגרת סטריאוטקסיתStoelting51500D
<חזק>כלי
Coverglassהרווארד מכשירHSE-64-0720קוטר 3 מ"מ
מקדחה דנטליתSigmedKeystone KVet
מוט קיבועניתן להשתמש באגוזי בורג N/A M2 או M3 בהתאמה אישית ניתן להשתמש
במלקחייםRenexPN-7B-SA
מספריים מיקרוFalconBM.183.180
מיקרוסקופ דיסקציהKOZOXTL6445T
מסגרת <חזקה>הדמיה
מחזיקה בהתאמהאישיתN/A
מיקרוסקופ דו-פוטוניZeissUpright Axio Examiner Z1יחידת לייזר: זיקית קוהרנטית 690-1040 ננומטר עם מתנד פרמטרי אופטי 1050-1300 ננומטר. מטרות: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 ו-LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. זיהוי: מסנני פס פס של Zeiss BP 500-550 (GFP) ו-BP 570-610 (mCherry) מופרדים על ידי מפצל אלומה ב-560 ננומטר ומחוברים לשני גלאי פוטו GaAsP.
Reagent
Virusמתנה מ-K. DeisserothRecombinant adeno-associated virus (rAAV) המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת מקדם CaMK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon ImagingRetrosplenial CortexCranial Window ImplantationAAV InjectionThy1 GFP MicemCherry ExpressionHippocampal ProjectionsDendritic Spine ImagingSynaptic Plasticity MonitoringIn Vivo Microscopy

Related Articles