מאמר שיטה

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53534

⸱

5 בדצמבר 2015

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, 2Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להערכת שינויים בכלי הדם האימהיים במהלך ההריון בעכברים. באמצעות שיטות סטריאולוגיות, שיפוץ העורקים הספירליים העשרוניים מוערך כמותית והתוצאות מאושרות איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

תקציר

השליה מתווכת את חילופי הגורמים כמו גזים וחומרים מזינים בין האם לעובר ויש לה דרישות ספציפיות לאספקת דם ממחזור הדם האימהי. כלי הדם של הרחם האימהי צריכים להסתגל לדרישה זמנית זו ולהצלחת תהליך שיפוץ העורקים הזה יש השלכות על גדילת העובר. תאים של מערכת החיסון האימהית, במיוחד תאי הרג טבעיים (NK), ממלאים תפקיד קריטי בתהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה להערכת מידת העיצוב מחדש של עורקי הספירלה האימהיים במהלך הריון עכבר. קטעי רקמה מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין נסרקים וגודל הכלים מנותחים. כשיטת אימות משלימה, אנו מציגים גם הערכה איכותית להצלחת תהליך העיצוב מחדש על ידי זיהוי אימונוהיסטוכימי של אקטין שריר חלק (SMA), שבדרך כלל נעלם מתוך כלי הדם העורקיים באמצע ההריון. יחד, שיטות אלו מאפשרות לקבוע פרמטר חשוב של פנוטיפ ההריון. ניתן לשלב תוצאות אלה עם נקודות קצה אחרות של הריון עכברים כדי לספק תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס סיבוכים הקשורים להריון.

מבוא

חילופי חומרים מזינים, גזים וחומרי פסולת במהלך הריון eutherian מתווך על ידי השליה. במערכת הרבייה הנשית, עורקי הרחם הם הצינורות העיקריים של דם אל הרחם. לאחר השתלה, סניף אלה לתוך כלי מיוחד הנקרא עורקי ספירלה שסליל דרך basalis decidua ליחידת fetoplacental. קוטר ואלסטיות של עורקי ספירלה אלה, אשר מוקפים בלויקוציטים, בתאים מסוימים רוצח טבעי רחם (אונק), להכתיב נפח ומהירות של דם זמין ל1,2 השליה. שינויים המודינמית נכונים כתוצאה משיפוץ של עורקי הספירלה הם קריטיים להצלחת הריון.

בעוד המנגנונים שונים בפירוט בין אדם והריון עכברי, התוצאה הסופית של תהליך שיפוץ בשני המינים הוא כלי דם מורחבים, גבוה מוליכות שמאבדים את שכבת שריר החלק שלה. בעכברים, אונק תא הנגזר אינטרפרון (IFγ N-) הוא הכרחי כדי לגרום לשינויים אלה בסביבות אמצע ההריון-3-5. עכברים שחסרים או תאים או רכיבים של מסלול איתות IFN-γ NK לא מצליחים לעבור שינויים אלה וזה קשור ל6,7 גדילת העובר מופחת, והדגיש את החשיבות של אספקת דם הולמת ליחידת fetoplacental. במהלך ההריון אנושי מוקדם, פלישת ביניים וendovascular של trophoblast extravillous והאינטראקציה שלהם עם תאים אונק חשובות לגרימת שינויים בכלי הדם וקידום 8-10 גדילת העובר. תאים אונק יכולים לתזמר פלישת trophoblast אדם באמצעות כמוקינים 11 וציטוקינים כגון מקרופאג granulocyte - גורם המושבה גירוי (GM-CSF) 12. פלישת trophoblast רדודה קשורה לסיבוכי שיפוץ עורקים והריון מופחתים כגון רעלת הריון 9.

פרוטוקול זה מבוסס על עבודתו החלוצית של אנה Croy שתאר חשובתפקידה של מערכת החיסון וIFN-γ במיוחד נגזר NK לשיפוץ מוצלח של כלי דם באמצעות ניסויי אימונוהיסטוכימיה והעברה אלגנטית 5,13. כאן אנו מתארים את דרך מהירה וחסכונית כדי להעריך את מצב שיפוץ של עורקי ספירלה. למרות שהמעבדה שלנו מעריכה באופן שגרתי הזה באמצע ההריון (יום הריון (ה ') 9.5) 14, תהליך שיפוץ מתקיים בין gd8.5 ו12.5 15. כניסתו של סורקי שקופיות אוטומטיים יש להקל באופן משמעותי את ההערכה של אזורי כלי ולומן מסעיפים ומצאנו את זה כדי להיות גישה לשחזור יותר מאשר מדידת קטרי כלי. התוספת של זיהוי immunohistochemical של SMA מאפשרת לאימות ישירה של התוצאות שהתקבלו מהערכת stereological. כמו בכל טכניקות stereological, מומלץ לבצע ההערכה כניסוי מסונוור לפחות שני בוחנים. לשם כך, ניתן הציג צעד אקראי כאשר סדרתי לחתוךטינג הדגימות כך שהחוקרים להעריך את השקופיות לא יודעים שמקבוצת ניסוי הדגימות לבוא.

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק כלי אמין כדי להעריך בזהירות את שיפוץ של עורקים סליליים בעכברים עם גנוטיפים אימהיים ואבהיים מוגדרים, בהקשר של מודלים עכבר לסיבוכים הקשורים להריון. התוצאות מדגישות את התלות בתאים אונק של תהליך זה, שהוא חיוני לצמיחה תקינה של העובר.

פרוטוקול

כל הנהלים דנו בכתב יד זה הם בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה ומאושרות על ידי לוח הסקירה אתית קיימברידג '.

1. דגימה אוסף

  1. הגדרת הזדווגויות מתוזמן באמצעות C57BL / 6 נקבות עכברים ישנים 8-12 שבוע עם זכרים בוגרים (עד 2 נקבות לזכרים) בשעתי אחר הצהריים. לבדוק את קיומו של תקעי נרתיק כסימן להזדווגות מוקדם בבוקר בימים הבאים. הנוכחות של תקע בgd0.5 סימני בוקר.
  2. על gd9.5, להרדימו נקע בצוואר רחם ולפתוח את חלל הבטן. הערה המתת חסד שעל ידי CO 2 עלולים לגרום vasodilatation.
  3. השתמש בחוט דנטלי ולקשור בעדינות את עורקי רחם (איור 1, חצים מקווקוים). לקשור את החוט סביב העורקים בקצה של כל קרן רחם, הפרוקסימלי לשחלות, כמו גם סביב צוואר הרחם.
    הערה: אל להיקרע כלי מכיוון שהדבר עלול לגרום לעורקים התמוטטו.
  4. לנתח את הרחם במהירות באמצעות מספריים לנתיחה, מוציא את כל הרחם distally לשלוש נקודות קשירה בקצה קרן הרחם וצוואר הרחם.
  5. מניחים את הרחם על פיסת קלקר מוכנה כך ששני הקרניים מיושרות לאורך אותו הציר הארוך בכיוונים מנוגדים מצוואר הרחם. בעדינות למתוח אותו ולהצמיד למקום באמצעות 2-3 25 מחטי G.
  6. לטבול את הקלקר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מוכן. ראש הדף עד 50 מיליליטר עם פורמלין 10%. תקן עבור 5-6 שעות בטמפרטורת חדר.
  7. מחק את פתרון פורמלין ולהחליף עם 50 1x מלוח מיליליטר פוספט (PBS) במשך 5 דקות.
  8. בלו שתי קרנות רחם proximally לנקודת קשירה בכל קצה וproximally לצוואר הרחם במרכז, לקצץ משם כל שומן עודף סביב אתרי ההשתלה ולשטוף פעמים PBS במשך 5 דקות כדי להסיר עקבות של פורמלין.
  9. אחסן את הדגימות באתנול 70% ב 4 ° C. (לתקופה של עד שבועיים) עד לעיבוד.
    זהירות: Ethanol הוא דליק מאוד.
  10. השתמש במערכת עיבוד אוטומטית באמצעות הפרמטרים שצוינו בטבלה 1. שבץ הקרניים בנפרד בפרפין, כך שהם יכולים לחתוך לאורך המישור ניצבת לציר של הרחם הארוך. הדבר מבטיח כי השטח המרבי של כל אתר השתלה יהיה חשוף לניתוח באמצע הבלוק (איור 2 א).
    אופציונאלי: זוהי נקודת זמן נוחה לאקראית של בלוקים אם תרצה בכך.
  11. באמצעות microtome, לחתוך קטעים סידוריים של 7 עובי מיקרומטר מהלוקים. כתם סעיף אחד בכל מרווח 49 מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H & E, ראה סעיף 2.1). אחסן את החלקים שנותרו בטמפרטורת חדר למשך צביעת SMA ויישומים במורד הזרם אחרים.
פִּתָרוֹן זְמַן טֶמפֶּרָטוּרָה
אתנול 70% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
אתנול 100% שעה 1 40 מעלות צלזיוס
שעה 1 40 מעלות צלזיוס
קסילן שעה 1 40 מעלות צלזיוס
קסילן שעה 1 40 מעלות צלזיוס
פָּרָפִין שעה 1 63 מעלות צלזיוס
פָּרָפִין שעה 1 63 מעלות צלזיוס
פָּרָפִין שעה 1 63 מעלות צלזיוס
פָּרָפִין שעה 1 63 מעלות צלזיוס
21px; "> קסילן:

טבלת 1:. הגדרות עבור עיבוד רקמות אוטומטי סקירה כללית של ההגדרה המשמשת לעיבוד של רקמת רחם

2. Sterהערכת eological

  1. H & E מכתים
    1. סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית לתוך אמבטיה קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
      זהירות: קסילן הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. עבודה זו חייבת להתנהל במנדף, תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE).
    2. לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות.
    3. רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד.
    4. לטבול את השקופיות בפתרון של 50% 3 hematoxylin גיל לא, מדולל במים מטוהרים, במשך 5 דקות.
      זהירות: Hematoxylin מזיק על ידי בליעה ומגע לעיניים. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול.
    5. לשטוף שקופיות בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות.
    6. לטבול את השקופיות בפתרון 1% חומצה / אלכוהול (1% חומצה הידרוכלורית 10 M באתנול 70%) למשך 10 שניותולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז.
    7. לטבול את השקופיות בפתרון eosin למשך 30 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות.
    8. בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 70% אתנול, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד.
    9. לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות.
    10. הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבש אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ.
  2. הערכת Stereological של גודל כלי שיט וסטטוס שיפוץ
    1. עבור כל אתר השתלה, לקבוע אילו חלקים קרובים לנקודת midsagittal. הקובץ המצורף chorioallantoic בין השליה לעובר ופיתוח משמש כמדד טוב לנקודת midsagittal.
    2. בחר 3 חלקים ב 49 מיקרומטר במרווחים קרובים לנקודת midsagittal לניתוח. סריקת שקופיות שנבחרו. על מנת להימנע מIncורידי luding, אשר הוכחו להיות ממוקמים יותר שולי באתרי ההשתלה 16, להגביל את הניתוח על 2/4 של כל אתר השתלה (איור 2 א) המרכזי.
    3. כדי להעריך גודל לומן, לצייר סביב החלק הפנימי של כלי הדם ולהקליט את השטח של צורה זו. לסך גודל הכלי, לצייר סביב הקיר החיצוני של כלי השיט, כולל תאי אנדותל, pericytes ולויקוציטים ביצוע עצמי.
      הערה: היחס בין סך גודל כלי ללומן הוא מדד למצב שיפוץ של ספינה. ככלי סליל באמצעות המטוס שהסעיף היה לחתוך לאורך, ייתכנו חתכים מרובים של אותו העורק בשקופית אחת. הימנע מדידה אותו העורק מספר פעמים.
    4. רשום את המדידות מ 5 כלים בכל אתר השתלה עם לומן הגדול ועגול. למדוד כל אתר השתלה בשלושה עותקים (שלושה חלקים במרווחים 49 מיקרומטר זה מזה). הממוצע של 15 represe מדידות אלהNTS הקוטר הממוצע של כלי הגדולים ביותר.
    5. כדי להימנע מייצוג יתר של כלי גדול יותר בכמה דוגמאות, למדוד אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה.

3. הערכה איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה

  1. Deparaffinization וRehydration
    1. סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית חסינה חומה לאמבטית קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות.
    3. רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול ו -70% ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד.
  2. אנטיגן אחזור
    1. הכן חיץ נתרן ציטרט 10 מ"מ במים מטוהרים ולהתאים לpH 6 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית M.
    2. מלא מיכל חסין חום שיכול להכיל 600 מיליליטר עם חיץ ציטראט 400 מיליליטר נתרן ומקום בסיר לחץ מקומי המכיל ואט מספיקאה לצלול מחצית מהמכל. באופן רופף לצרף את המכסה של סיר הלחץ והחום עד רתיחה.
    3. מתלה מקום שקופיות למאגר נתרן ציטרט והדוק לתקן את המכסה של סיר הלחץ. ברגע שלחץ, לאפשר לרתיחה במשך 3 דקות.
    4. לְהַפִיג לַחַץ סיר הלחץ ולהסיר את המכל הפנימי. לאפשר שקופיות להתקרר במאגר נתרן ציטרט במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. לשטוף מחליק באמבט המכיל מים מטוהרים במשך 5 דקות.
    6. להקיף את החלקים באמצעות עט מחסום הידרופובי.
    7. לשטוף שקופיות על ידי השריית בPBS במשך 5 דקות.
  3. חסימת אנדוגני Peroxidase והלא ספציפי מחייב
    1. סעיפי דגירה עם מי חמצן 3% בדילול מלא במים מטוהרים בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
      זהירות: מי חמצן הוא גירוי מאוד לעיניים, עור ועל בליעה. ללבוש PPE המתאים.
    2. הקש את פתרון מי חמצן עודף ולשטוף SLIdes פעמיים על ידי השריית בטריס שנאגרו מלוח (TBS) עבור 2 דקות כל אחד.
    3. סעיפי דגירה עם אימונוגלובולינים עכבר חסימה מגיב מאת העכבר על ערכת עכבר הוכן בהתאם להוראות יצרן.
    4. לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS עבור 2 דקות כל אחד.
  4. Immunodetection של אקטין שריר חלק
    1. הכן פתרון נוגדן diluent (הניתן בערכה) ודגירה עם קטעים של 5 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרן.
    2. לדלל 1: שריר אקטין חלק 100 עכבר אנטי-אנושי (DAKO M0851) בפתרון diluent הנוגדן. לדלל את שליטת אלוטיפ עכבר IgG2a בפתרון diluent נוגדן, להבטיח כי ריכוז אימונוגלובולינים הסופי הוא שווה ערך בשני הפתרונות.
    3. הקש את סעיפי פתרון diluent הנוגדן וכיסוי עודפים עם פתרונות בקרה או בדילול נוגדן או אלוטיפ. דגירה בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    4. לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS ל2 דקות כל אחד.
    5. לדלל נוגדנים משני אנטי עכבר biotinylated דגירה סעיפים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרנים.
    6. לשטוף שקופיות אחת לעם כפות וPBS למשך 2 דקות, בהתאמה.
    7. הכן פתרון 3,3'-diaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן. לכסות חלקים עם פתרון DAB ודגירה של עד 4 דק ', הבטחה לעקוב אחר חלקים, כדי למנוע התפתחות צבע עודפת.
      זהירות: DAB הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול.
    8. לטבול את השקופיות במים מטוהרים, כאשר מגיעה לעצמה רצויה של צביעה.
    9. Counterstain עם 50% גיל מס '3 hematoxylin במשך 20 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז עד המים פועל ברורים.
  5. התייבשות והרכבה
    1. בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות ETH 70%anol, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד.
    2. לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות.
    3. הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבשו אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ

תוצאות

Rag2 - / - IL2rg - / - עכברים חסרים כל ימפוציטים הבוגרים, כוללים תאי NK 17, ועורקי הרחם שלהם לא מצליחים לעבור את השינויים בכלי הדם ראו בעכברי C57BL / 6 wildtype congenic (WT) סביב אמצע הריון-5,14. כתוצאה מזה Rag2 המופחת שיפוץ - / - IL2rg - / - עכברים מראים אזורים קטנים יותר באופן משמעותי luminal פני השטח, מעידים על כלי הכוללים קטנים יותר שניתן דמיינו על חלקים מוכתמים-E H & ולכמת stereologically (איור 2). יתר על כן, עובי הדופן יחסית (כלי ליחס לומן) הוא גבוה יותר בעורקי הספירלה בעכברים אלה, המצביע על אספקה ​​מופחתת של דם ומהירות גבוהה יותר בדם.

הערכה כמותית זו אושרה באמצעות זיהוי immunohistochemical של SMA. זה אופייני לעכברי WT לאבד את רוב SMA בתקשורת וכלי הדםשל עורקי הספירלה באמצע ההריון. אם תהליך מונחה תא NK זה אינו מתקיים, SMA נשאר בתקשורת של כלי השיט וניתן להבחין בקלות immunohistochemically טבעות סביב כלי הדם (איור 3).

figure-results-1
איור 1: רחם העכבר בgd9.5, סקירה סכמטית ציור המראה את מיקומם היחסי של קרנות רחם, צוואר רחם (הכחול) ועורקים ראשיים רחם (אדום).. הצביע הם הציר של קרן הרחם (חיצים) ונקודות קשירה (חיצים מקווקווים) הארוך. החלקים לאימונוהיסטוכימיה נחתכים לאורך מישור הנוף.

figure-results-2

איור 2:. הערכת Stereological של שיפוץ עורקים באמצע ההריון () דוגמא assessment הלומינל ואזורי כלי מוחלט על סעיפי H & E מוכתמות מנקבות WT ב2/4 המרכזי של basalis decidua (מוגדרת על ידי שחור האנכית קווים מקווקווים) בgd9.5. בכלי בהגדלה גבוהה יותר, האדום קו מקווקו תוחם אזור כלי כולל, קו מקווקו צהוב תוחם אזור לומן. בר = 500 מיקרומטר (משמאל), 50 מיקרומטר (מימין). הציר של הרחם הארוך הוא קו אופקי בכיוון זה. כימות (ב) לאזורי luminal (פנל משמאל) ויחס של שטח luminal לאזור ספינה כולל (פנל מימין) מWT (C57BL / 6) וRag2 - / - Il2rg - / - עכברים (על C57BL / 6 רקע). כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של 15 מדידות (5 מדידות לכל סעיף, 3 חלקים לאתר השתלה). ברים מייצגים ממוצעים של n = 11-13 אתרי השתלה מ4 הריונות לכל קבוצה; p-ערך ממבחן מאן-וויטני שני זנב, מזווג. WT: wildtype.

figure-results-3
איור 3:. גילוי immunohistochemical של אקטין שריר חלק בbasalis decidua מכתים הנציג SMA על WT (למעלה) וRag2 - / - IL2rg - / - עכברים (על רקע C57BL / 6, תחתונה) בgd9.5. בר = 100 מיקרומטר. WT: wildtype.

דיון

הפרוטוקול המובא כאן נועד לספק שיטה לשחזור הקשורים ליישום שינויים בכלי הדם הנדרשים להריון מוצלח. קריטי להצלחה של הערכה זו היא האיכות של חלקי רקמות. שניהם קביעה מדויקת של גיל הריון אתרי השתלה וכן באופן מהימן ligating עורקי הרחם הם צעדים חיוניים. שינויים בפרמטרים כגון זמן של קיבעון, פרוטוקול עיבוד רקמות, וכו 'עשויים להשפיע גם על התוצאה. להערכה stereological משוחדת, חשוב למדוד את אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. מומלץ למדוד 5 כלי לאתר השתלה וכל אתר השתלה בשלושה עותקים. הממוצע של 15 מדידות אלה מייצג את הגודל הממוצע של 5 כלי הגדולים ביותר.

בהמשך לנתונים מRag2 alymphoid - / - IL2rg - / - עכברים שמוצגים כאן, מצאנו prot זהocol שימושי עבור מספר הדגמים של תפקוד מערכת חיסון אימהי לקוי, כולל אחד מתאי NK עכבות 14. פגמים בשיפוץ עורקים גם הוכחו במודלים של פלישת trophoblast לקוי 18 והטכניקות המתוארות כאן עשויות להיות מועילות כדי להעריך את כלי הדם במקרים אלה. אנו מותאמים ומאומתים פרוטוקול זה לחקירת שיפוץ כלי דם decidual באמצע ההריון בעכבר, אבל זה גם מתקבל על הדעת להתאים פרוטוקול זה לעבוד במערכות אחרות מודל (למשל חולדות) או אפילו באיברים אחרים. בעוד אנו מוצאים כי שיפוץ NK-תלוי ניתן להעריך חסונה בgd9.5, זה יכול להיות מתוקן לנקודות זמן אחרות כגון gd12.5, כאשר כלי הדם האימהיים הוא שופץ לחלוטין. בנקודה זו בזמן, פלישת trophoblast endovascular היא עמוקה יותר 16 ונקודת זמן זו עשויה להיות מתאימה יותר לחקירות של התפקיד trophoblast לשינויים בכלי הדם. אם קריאות כמותית נוספות רצויים,חוקרים יכולים גם להגדיל את מספר הסעיפים המוכתמים עבור SMA ולהעריך את אחוז כלי שופצו באופן חלקי בכל אתר השתלה.

הגבלה של פרוטוקול זה היא תיאורי הטבע של בדיקות היסטולוגית. מבחני פונקציונליים, לעומת זאת, הם רק הופכים לאט זמינים (כגון אולטרסאונד דופלר 19). טכניקות אלה דורשות מומחיות טכנית והוצאות גבוהות בהרבה לרכישה ותחזוקה של ציוד, אבל יש את היתרון של מתן אורך קריאת נתוני vivo להשפעת השינויים שניתן לצפות בהיסטולוגיה. חסרון אפשרי של כל בדיקות stereological הוא הסובייקטיביות של החוקרים. לשם כך, באמצעות שני בוחנים עצמאיים שלנתח את כל הדגימות באופן עצמאי יכול לעזור כדי למנוע בעיה זו. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן נותן תובנה כמה דם יכול להגיע לממשק fetomaternal, זה עשוי להיות יתרון לשלב את זה עם complגישת ementary של בחינת הסכום הכולל של דם בכל זמן נתון בכלי הדם דרך הפלסטיק מטילה 16.

כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב שתי גישות עצמאיות. שינוי בכלי דם הוא ראשון להעריך כמותית ידי stereology והתוצאה מכן תוקף איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האמינות של התוצאות ניתן לחזק עוד יותר על ידי באופן אקראי, הדגימות. הדגימות מוכנות לפרוטוקול זה יכול לשמש בקלות גם לחקור פרמטרים אחרים של הריון כגון decidualisation, פיתוח כולל הלימפה mesometrial של הריון (MLAp) או immunodetection של תאים של עניין, כדי להעריך את הפנוטיפ הריון בקפדנות בmidgestation.

שיפוץ עורקים הוא שלב קריטי להריונות לא מסובכים בנשים וכישלון של שינויים אלה בבסיס התסמונות הגדולות יילוד (GOS), כלומר רעלת הריון, הגבלה בגדילת העובר ולידת עובר מת. אנו מציגים כאן טכניקות כדי להעריך פנוטיפ הריון במודלים של עכברים המחקים כמה מאפיינים של הפתופיזיולוגיה של GOS בזהירות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת קולוצ'י על הדיונים המועילים. עבודה זו מומנה על ידי קרן וולקאם [094073/Z/10/Z], המרכז לחקר טרופובלסט וקרן הלב הבריטית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL/6 עכברים (בני 8-12 שבועות)חוט
פוליסטירןמשמש להחזקת רקמות במקום
מספריים לדיסקציה ישרהEMS72940
300600משמש להחזקת רקמות במקום
50 מ"ל צינורות חרוטייםFalcon352070
תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%סיגמאHT501128-4L
פוספט חוצץ מלחסיגמאP3813-10PAK
אתנולסיגמא32221-2.5 ליטר
פרפיןסיגמא327204-1 ק"ג
XyleneFisher ScientificX/0250/17
מעבד רקמות אוטומטיSakura6032
MicrotomeLeicaRM2245
מתלה שקופיותצנצנת קופלין SigmaZ710989
SigmaS5891
מים
, זימים מס' 3סיגמאGHS332-1L
Eosin Y פתרוןסיגמאHT110116-500 מ"ל
קולט אדים
מדיה הרכבה מבוססת קסילןVWR361254D
סורק שקופיותHamamatsuNanoZoomer
תוכנת סורק שקופיותHamamatsuNDP viewer
נתרן ציטראט tribasic דיהידראטסיגמא32320הכינו תמיסה של 10 מ"מ והתאימו את ה-pH ל-6
סירהמשמש לאחזור אנטיגן
צלחתהמשמשת לאחזור אנטיגן
עט מחסום הידרופוביוקטורH-4000
מי חמצןפישר סיינטיפיקH/1800/15
Tris חוצץמלח סיגמאT6664-10PAK
ערכת עכבר על עכברוקטורBMK-2202מפחית משמעותית את הרקע
עכבר אנטי אנושי שריר חלקאקטין DAKOM0851מגיב צולב עם
עכבר בקרת איזוטיפ IgG2aDAKOX0943
תא לחסיגמאH6644
תמיסת 3,3'-דיאמינובנזידיןסיגמאD4293-5SET
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקH/1050/PB17
דנטלי צ'ארלס ריבר 25 גרם מחטים BD  תמיסת המטוקסילין מטוהרים לחץ חימום

מקורות

  1. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  2. Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
  3. Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
  4. Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
  5. Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
  6. Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
  7. Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
  8. Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
  9. Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
  10. Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
  11. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  12. Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
  13. Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
  14. Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
  15. Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
  16. Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
  17. Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
  18. Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
  19. Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.