מאמר שיטה

הכנה ובדיקה של עכבה מבוססי biochips fluidic עם תאים RTgill-W1 טוב ההערכה המהירה של שתייה דגימות מים עבור רעילות

DOI:

10.3791/53555

⸱

7 במרץ 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1U.S. Army Center for Environmental Health Research, 2Nanohmics, Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר כיצד להכין שבבים ביולוגיים נוזליים עם תאי אפיתל זימים של פורל הקשת לשימוש בחיישן עכבה נייד של תא חשמלי. מתואר גם הפרוטוקול להפעלת בדיקת רעילות מהירה של מי שתייה עם החיישן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר כיצד להכין שבבים ביולוגיים נוזליים עם תאי אפיתל זימים של פורל הקשת (RTgill-W1) לשימוש בחיישן רעילות מים נייד בשדה. שכבה אחת של תאי RTgill-W1 נוצרת על אלקטרודות החישה הסגורות בתוך השבבים. לאחר מכן, השבבים הביולוגיים משמשים לבדיקה בשטח מכשיר נייד לחישת עכבה של תא חשמלי (ECIS) המיועד לבדיקת רעילות מהירה של מי שתייה. כתב היד מתאר עוד כיצד לבצע בדיקת רעילות באמצעות השבבים הביולוגיים המוכנים. דגימת מים בקרה ודגימת מי הבדיקה מעורבבים עם אבקת מדיה שנמדדה מראש ומוזרקים לתעלות נפרדות של השבב. קריאות עכבה מאלקטרודות החישה בכל אחד מערוצי הביו-שבב נמדדות ומושווים על ידי תוכנה סטטיסטית אוטומטית. המסך במכשיר ECIS יציין "זוהה זיהום" או "לא זוהה זיהום" תוך שעה מהזרקת הדגימה. היתרונות הם קלות שימוש ותגובה מהירה לספקטרום רחב של כימיקלים אנאורגניים ואורגניים בריכוזים הרלוונטיים לדאגות בריאות האדם, כמו גם היציבות ארוכת הטווח של שבבים ביולוגיים מאוחסנים במצב מוכן לבדיקה. המגבלות הן הדרישה לאחסון קר של השבבים הביולוגיים ורגישות מוגבלת לחומרי הדברה מעכבי כולינאסטראז. יישומים לגלאי רעילות זה מיועדים לבדיקה מהירה בשטח של אספקת מי שתייה על ידי אנשי רפואה מונעת של הצבא או לשימוש במתקני טיפול במים עירוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכללית הייתה לפתח שיטת תא הזריעה, האחסון ובחינת biochips fluidic ב biosensor ECIS. המטרה לפיתוח biosensor זה הייתה לפגוש מפרטי צבא ארה"ב עבור מכשיר נייד שדה שיכול לזהות זיהום אפשרי של אספקת מים לשתייה בשימוש על ידי חיילים. הדרישות עבור החיישן הרעיל היו שזה יכול לזהות קשת רחבה של תרכובות תעשייתיות רעילות במהירות (תוך שעה) בריכוזים רלוונטיים לבריאות אדם, כי מכשיר להיות שדה-נייד, ואת הרכיבים הביולוגיים יהיו חיי מדף של לפחות תשעה חודשים. קירור, אבל לא קפוא, של רכיבים מתכלים היו מקובלים.

מבחינה היסטורית, טכנולוגיות בדיקות מים ניידים שדה עם מרכיב ביולוגי אליהם (כגון נוגדנים, אנזימים, או חומצות גרעין) כבר אנליטי ספציפי 1-3. החסרון לסוגים אלה של חיישנים ביולוגיים הוא שהם יהיו Only לזהות סוג של כימיקל אחד בכל פעם. חיישנים מרובים נדרשים אם הוא חשוד כי יותר מ כימי אחד קיים. אם חיישן ספציפי הוא לא ברפרטואר הבדיקה, מזהמים כימיים במים יכולים בקלות ללכת מבלי שיבחינו בו.

Broad מבוסס חיישנים רעילים, ומצד שני, יש הפוטנציאל למלא את פער הטכנולוגיה הזו. יש אלה בדרך כלל מרכיב הסלולר להם 4-8. היתרונות של חיישנים ביולוגיים רעילות בקנה מידה רחב יהיו שיוכלו לזהות נוכחות של מגוון רחב של מזהמים כימיים, כולל תערובות אלמונים, בתוך פרק זמן קצר יחסית 5,9,10.

הרעיון של שימוש במדידת עכבה חשמלית של monolayers התא כחיישן רעילות אפשרי, אשר ידוע גם בשם חישת עכבת תא מצע חשמלי (ECIS), תואר לראשונה על ידי Giaever ו Keese 11. במהלך שני העשורים האחרונים הוכח להיות אינדיקטור רגיש של התא viab ility ו cytotoxicity. ביסודו של דבר, monolayer התא כי היא דבקת האלקטרודות על biochips חשוף בתדר גבוה ומתח נמוך אות הנוכחי amperage לסירוגין. בשכבה והמחוברת של תאים מעכבת את זרימת אלקטרונים. כאשר שלמות monolayer התא נפגעת (כגון כאשר חומר כימי רעיל הוא הציג), חיישן ECIS רושם שינוי העכבה החשמלית 11-14. איור 1 מדגים את העיקרון של ECIS ביחס monolayer התא על biochip .

figure-introduction-1
איור 1:.. עיקרון ECIS האיור של monolayer תא על biochip עם סכמטי חשמלי קורא ECIS פשוט אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

> בתחילה, שורות תאים יונקים היו זורעים ב biochips fluidic ושימשו בטכנולוגיה חיישן ECIS המתואר כאן 12. תאים אלה לא היו מעשיים לשימוש בשטח, לעומת זאת, כי הם נדרשים שינויי תקשורת תכופה, היו חיי מדף מוגבלים, נדרשים סביבה מלאכותית CO 2 ובטמפרטורת דגירת 37 מעלות צלזיוס. התגלה כי קו תא זמין מסחרי שמקורם בתאי האפיתל זימי פורל קשת (RTgill W-1 תאים) יכול להיבדק בטמפרטורת חדר סביבת CO 2, נוצר בשכבה ומחוברת של biochips, יכול להיות מאוחסן בטמפרטורה בקירור, ו הייתה תגובה מהירה (1 hr או פחות) לקשת רחבה של כימיקלים בריכוזים רלוונטיים לבריאות אדם 12. יישומים של תאים RTgill-W1 ב טוקסיקולוגיה, וכן במחקר בסיסי, נבדקים על ידי Lee et al. 15

שיטות זריעה, אחסון ובחינת biochips fluidic המכיל monolayers של תאים RTgill-W1 על biochips fluidic בתוך biosensor ECIS מתוארים כאן. Biochips fluidic ניתן לאחסן עד 9 חודשים במצב בקירור ניתן להעבירה במיכל בקירור, לבדיקה של SUPPLIES.THE מי השתייה המלווה הקוראים ECIS, או יחידות הבדיקה, נשלחים בנפרד. Biochips יש שני מרכיבים אליהם; שכבת פוליקרבונט עליונה עם שני ערוצים נוזלים נפרדים, ושכבה אלקטרונית נמוכה המכילה ארבע כריות אלקטרודה לכל ערוץ עבור חישת עכבה. ישנם 10 אלקטרודות עבודה לכל כרית; אלקטרודה כל הוא 250 מיקרומטר קוטר. Biochips התאספו להם קשרים אלקטרודה זהב לרכישת קריאות עכבה כאשר מוכנס לתוך יחידת מבחן ECIS. כל אחד מהערוצים בצורת U fluidic שני סגורים יקיימו 2 מיליליטר של השעית תא RTgill-W1. איור 2 מראה biochip fluidic בקורא ECIS עם גדלה של תאים ומחובר על אלקטרודה חישה יחידה.

= "Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> figure-introduction-2
איור 2:.. Biochip fluidic ב ECIS Reader אזור מוגדל תערוכות בשכבה ומחוברת של תאי RTgill-W1 על אלקטרודה חישה יחידה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חומרי מבחן

הערה: כדי להכין את biochips לבדיקה, כמה צלוחיות ומחוברות של תאי RTgill-W1 צריך להיות מוכן. הערכה טובה של מספר צלוחיות שצריכות זה בקבוק אחד ומחוברות T175 במשך 16 biochips להיות זורע.

  1. בצע את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגי שני בכיתה (biohood) באמצעות טכניקה מזוהמת. השתמש 70% אתנול עבור חיטוי biohood וכל חומר להציב את מכסה המנוע.
    1. כן מצע פיברונקטין עבור biochips fluidic על ידי הפשרת בקבוקון 1 מ"ג של פיברונקטין והדילול ב 100 מיליליטר של 15 L תקשורת סטריליים בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. להקפיא ב 40 aliquots מ"ל צינורות פוליפרופילן סטרילי 50 מ"ל חרוטי ב -20 ° C. להפשיר בכמה שעות בטמפרטורת החדר לפני זריעת biochips. לאחר מופשר, אל תקפיאו.
    2. הכן התקשורת תרבית תאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר, 5 מ"ל של 200 מ"מ sup L-alanyl-L- גלוטמיןplement, ו -5 מ"ל של פתרון פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / מ"ל ​​ו -10,000 מיקרוגרם סטרפטומיצין / מ"ל) המניה ל -500 מ"ל של L-15 מדיה. זו תניב 560 מיליליטר של תרבית תאי תקשורת המכילה סרום 9%. לְקַרֵר.
      הערה: זו תהיה תקשורת תרבית תאים המלאה המשמשת צלוחיות תרבות biochips.
  2. בקבוקי מדיה אבקה
    1. הכן מראש 0.1 DRAM בקבוקוני snap-כובע המכילים 60 מ"ג ± 0.5% של אבקת L-15ex באמצעות מתקן אבקה אוטומטית. לייבל צלוחיות עם התאריך האבקה היה מרוקן בקבוקוני במקרר (בכמויות של 50) בשקיות פולי metalized recloseable; כל חבילות התייבשות שלוש 1 גרם סיליקה ג'ל המכיל.
      הערה: תקשורת בקבוקוני אבקת L-15ex יכולים להתבצע לאחסן עד 9 חודשים מראש של בדיקות.
  3. בצע פתרון של 100 מ"ל 20% אקונומיקה על ידי דילול אקונומיקה ביתית עם מים ללא יונים (DI). מעריכים כי 5 מ"ל של תמיסת אקונומיקה יהיה צורך עבור כל דוochip.
  4. הפוך מכלולים צינורות biochip ידי חיתוך 27 סעיפי מ"מ של צינורות ביולוגיים autoclavable (2 סעיפים לכל biochip להיות זורעים) ולהשתלב בשני הקצוות של הצינור עם אבזרי luer תלושים פוליקרבונט. מניח מכלולי צינורות בתוך שקית חיטוי autoclavable במשך 8 דקות ב 134 מעלות צלזיוס. כמו כן תקעי biochip חיטוי (2 לכל biochip) בשקית נפרדת אותן ההגדרות.
  5. מי חיטוי DI במשך 30 דקות at121 ° C.
    הערה: מים זה ישמש עבור שטיפת biochips לאחר הזריעה. מעריכים כי 10 מ"ל יהיה צורך עבור כל biochip.
    הערה: היקף בפועל של כל ערוץ biochip הוא 2 מיליליטר, אבל 5 מיליליטר של מים סטריליים הוא שטף דרך כל ערוץ לאחר הסרת פתרון אקונומיקה.
  6. הפוך מכלולים צינורות הזרקת מזרק על ידי חיתוך 27 סעיפי מ"מ של צינורות ביולוגיים מצרף אבזרי luer התלוש זכר בשני הקצוות של הצינור. מניח מכלולי צינורות בתוך כיס עיקור בחום חותם נייר חיטוי במשך 8 דקות ב 134 &# 176; ג.

נוהל 2. מתזמן biochip fluidic

הערה: בצע את כל הנהלים שבו biochips או התקשורת מתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה באמצעות טכניקה מזוהמת.

  1. עשרים וארבע שעות לפני זריעה מתוכננת, להסיר את biochips מאריזה יצרנית של biohood ומקום במקרי מכשיר פלסטיק מעוקר.
  2. לעקר את biochips באמצעות פתרון אקונומיקה 20% כדלקמן
    הערה: היסטורי, הליך הלבנה זו מנע גידול פטרייתי של biochips במהלך האחסון לטווח ארוך במקרה כי עיקור הפלזמה של biochips נעשה על ידי היצרן לא היה יעיל.
    1. באמצעות מזרק 20 מ"ל סטרילי עם צינורות הזרקה במזרק המצורף הרכבה ועבודה של biohood, להזריק 2 מ"ל של פתרון אקונומיקה 20% לתוך כל ערוץ של biochip. אפשר biochips לשבת במשך שעה 1 עם פתרון האקונומיקה.
    2. לאחר שעה, asp ואקוםנזעם פתרון האקונומיקה משני הערוצים באמצעות הרכבת luer התלוש זכר סטרילי המצורפת צינורות ואקום היניקה. השתמש באחת הרכבות צינורות biochip כביוב כאשר שטיפת biochips.
    3. באמצעות מזרק 20 מ"ל סטרילי מחוברת הרכבה הזרקת מזרק סטרילי, שטוף כל ערוץ של השבב עם 5 מ"ל של מים סטריליים, המאפשר את המים העודפים להתנקז לתוך המיכל biohood. ואז ואקום לשאוב את המים כפי שתואר על האקונומיקה ומקום biochips בחזרה במקרי מכשיר פלסטיק ולהשאיר את biohood עד זורעים עם תאים למחרת.
  3. שישים דקות לפני זריעת biochips, להזריק 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתוך כל ערוץ של biochip. השאירו את biochips ב biohood למשך 60 דקות, ולאחר מכן לשאוב לשאוב את פיברונקטין (כמתואר בשלב 2.2.3) לפני זריעת biochip עם תאים. מניח שני קטעים של מכלולי צינורות biochip סטרילי (עייןסעיף 1.4) על היציאות של biochips.
  4. Trypsinize בקבוק T175 אחד ומחוברות RTgill-W1 על כל 16 biochips באמצעות הנהלים המפורטים באוסף התרבות האמריקאית סוג גיליון תיאור המוצר (ATCC) 16.
    1. לשאוב את התקשורת מהבקבוק והמחובר (ים) של תאים.
    2. יש לשטוף את שכבת התאים עם 15 מ"ל של PBS ולאחר מכן לשאוב את.
    3. הוסף 6 מ"ל של טריפסין / EDTA אל שכבת התאים בכל בקבוק T175 ולאפשר לתאים trypsinize עבור ~ 5 דקות.
    4. הוסף 15 מ"ל של התקשורת תרבות שלמה L-15 תא בקבוק אחד להפסיק trypsinization.
    5. מערבב את מתלי התא במכל חד פעמי סטריליות.
      הערה: גודל מיכל יכול לנוע בין 150-500 מ"ל, תלוי במספר biochips להיות זורעים. מעריכים כי 5 מ"ל של תרחיף תאים יהיה צורך לכל biochip.
  5. הסר ~ 1 מיליליטר של השעית התא ומקום לתוך צינור microcentrifuge עבור ספירה. באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם objecti 10Xve ו hemocytometer, סופרות aliquot 10 μl של תאים ולחשב את היקף התקשורת L-15 תא תרבות שלמה הדרוש להשגת השעיה תא של 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל.
    הערה: אם אתה משתמש השעית תא זרע צלוחיות להמשיך התרבות, זו תהיה הנקודה לעשות זאת. התאם את ריכוז תא השעיה באמצעות תרבית תאי תקשורת מלאה L-15.
  6. באמצעות syringeattached 20 מיליליטר סטרילי לאסיפת צינורות הזרקת מזרק סטרילי (ראה סעיף 1.6), להזריק 2.5 מיליליטר של השעית התא ליציאה החיצונית של כל ערוץ של biochip (כלומר, את היציאות אין להם את הצינורות מחוברים), המאפשר חלק ההשעיה תא נוסף לזרום החוצה של הצינור לתוך מיכל פסולת של biohood.
    הערה: פעולה זו תבטיח כי הערוץ כולו הצינור מחובר יהיה מלאים השעית התא.
    1. צור לולאה סגורה עבור כל ערוץ biochip ידי הוספת את הקצה החופשי של הצינור עם fitti luerng לתוך השקעים החיצוניים עבור כל ערוץ.
    2. נגב כל מדיה עודפת הנחה של הלולאות הסגורות עם מגבת נייר טבולה 70 אתנול% ומקום biochips בחזרה בתיבת הפלסטיק C חמם 20 °. תנו לכל biochip מספר זיהוי ייחודי.
  7. בימים 4 ו -7, להסיר את biochips מן החממה 20 ° C ומלא את התקשורת בכל biochips עם תקשורת תרבית תאי L-15 שלמה-equilibrated טמפרטורה. בצע את אותו התהליך כמו בשלב 2.6 למעט שימוש רק מדיה תרבית תאי L-15 במקום (לא השעית תא). מניחים את biochips בחזרה בחממה 20 ° C לאחר שההנקה 4 יום.
    1. לאחר האכלה 7 יום, להסיר ולסלק את הצינורות מן שבבי והכנס את פקקי הניקוז autoclaved ב biochips.
    2. מניחים את biochips בקופסה C חממה 6 ° עד בשימוש לבדיקה.
      הערה: השבבי ניתן לאחסן בטמפרטורה בקירור עד 9 חודשים והם עדיין מעשיים עבור i בדיקותn הקוראים ECIS.

3. בדיקת ECIS עם biochips

  1. כן כימיקלי מבחן אם משתמש. (ראה ברנן, et al., 2012 7 להכנת כימיקלים מבחן).
  2. סר קורא ECIS ואספקת בדיקה מתוך תיק הנשיאה. הסרת biochip מוכן מן החממה C 6 °. מניחים את biochip על מגבת נייר. הפעל את הקורא ECIS.
  3. באמצעות 10 מ"ל מזרקים, להפריש 10 מ"ל מים מלאים לתוך צנצנת מלאת פלסטיק שקוף 0.5 אונקיה שכותרתו 10 מיליליטר של מדגם הבדיקה לצנצנת בדיקת פלסטיק שקוף 0.5 אונקיה שכותרתו.
    הערה: 1) הקפד להסיר בועות עבור מדידה מדויקת. 2) מזרקים וצנצנות מקודדים באמצעות צבע; כחול לבקרה אדומה עבור בדיקה.
  4. סור שני בקבוקוני תקשורת אבקה מן שקיות נייר הכסף. אחד פתוח צלוחיות תקשורת האבקה (כלי רב שימוש במידת צורך) ויוצקים כל תוכן של בקבוקון אחד לתוך הצנצנת במים מלאים, שומט את הבקבוקון כולו לתוךהפתרון גם כן. חזור על הליך זה עם צנצנת הבדיקה. שווי ולנער את הצנצנות על מנת להבטיח כי האבקה היא מומסת.
  5. ממלאים כל של מזרקים 10 מ"ל בצבע עם 9 מ"ל של או מלאה (מזרק כחול) או מבחן (מזרק אדום) פתרונות מן בקבוקונים בהתאמה. הסר בועות אוויר מזרקים.
  6. הסר את המצתים מנמלי biochip ולצרף לטמיון.
  7. מניחים את biochip למגש פלסטיק נשלף בקורא ECIS ולסגור את המכסה.
  8. צרף מזרקים מלאים ליציאות biochip החיצוניות ולצרף את הבוכנה במזרק.
  9. מהמסך הראשי, בחר "הבא" כדי ליזום בדיקה מקדימה.
    הערה: תוכנת Reader תבדוק עכבות. אם עכבות נמצאות בטווח המוגדר על ידי המשתמש (בדרך כלל בין 1,000 ל -3,000 אוהם) המסך ירשום "מחסנית העבר" כמצוין באיור 3, ולהורות למשתמש לבחור "הבא" ואת התוכנה תהיה המשך לשלב 3.10). אם עכבות והם אינם מצוייםבטווח סט בגלל biochip פגום או חיבור לקוי של biochip לקורא (בדרך כלל עקב חוסר תיאום בין אלקטרודות), ואז המסך ירשום "מחסנית נכשל" ואת תהיה למשתמש אפשרות או "בטל" או "אמת" במבחן.
    1. בחר "בטל" כדי לחזור לשלב 3.9). בחר "אמת" כדי להמשיך לשלב 3.10) לאחר הקבלה "מחסנית העבר" הודעה ובחירה "הבא".
      הערה: עדיף לקחת את biochip החוצה חזותית לבדוק בו פגמים או דולף אם "מחסנית נכשל" ההודעה התקבלה לפני שתמשיך עם biochip חדש.

figure-protocol-1
איור 3:. ECIS Reader תמונת מסך של biochip עם קריאות עכבה קבילות בצילום מסך פרטי קריאות עכבה ראשוניות אוהם של כל אחת השיתוף 4אלקטרודות ntrol (CE) ו -4 אלקטרודות בדיקה מדגמית (SE) בתוך biochip fluidic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. כאשר יתבקש על ידי הקורא, זן המידע המדגם באמצעות מקלדת רכה ולאחר מכן בחר 'קבל' בסיום.
    הערה: התוכנה הקוראת ECIS אוטומטי תחתים כל נתונים עם התאריך, השעה ומידע נוסף שזין המשתמש; כגון מספר biochip, ואת סוג חומר כימי והריכוז. שני דק של נתוני עכבה ייאסף מן biochip מוכנס טיימר על מסך יספור-פעם למטה.
  2. אחרי שתי דקות כאשר תתבקש לעשות זאת לפי ההוראות על המסך כי הם הברקה בתוך תיבה אדומה, פגע "הבא". כשתתבקש קופסה ירוקה מהבהבת כדי "להזריק דגימות עכשיו", להזריק מלאה התקשורת הבדיקה מן מזרקים מחוברים בו זמנית לתוך biochip channאלס. השאר את המזרקים במקום על biochips בסיום.
    הערה: ערכי עכבה ייאספו אחת לדקה למשך 60 דקות. אם תוכנת קורא ECIS קובעה כי ערוץ הטיפול שונה סטטיסטית מהערוץ המלא בכל נקודה בין 10 ל 60 דקות לאחר תחילת בדיקה, ולאחר מכן התצוגה על מסך תציין כי המדגם הוא "מזוהם". אם הטיפול אינו שונה מערוץ שליטה, אז המסך יציין "אין זיהום זוהה" בסוף של הפעלה נסיונית.
  3. תוצאות הבדיקה קלט כ מזוהם או לא מזוהמות עבור כל דגימה.
  4. בסוף בטווח הבדיקה, להסיר ולסלק biochip. לשטוף ואוויר-לייבש את מזרקים, מבחנות הבדיקה מגש פלסטיק נשלף בו שכנו biochip במהלך הבדיקות.
    הערה: קורא ECIS יש 4 GB של אחסון משולב עבור התוכנה המבצעית, מודלים מלאי קבצי הבדיקה מופקים הפעלת בדיקה. זה מאפשר מספר הקבצי הבדיקה ousand להיות מאוחסן על הקורא. קבצים ניתן לאחזר עם כונן USB לקפוץ והועברו למחשב לניתוח נוסף למטרות מחקר אם ירצו בכך.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגית ECIS המתואר במאמר זה עבר בדיקה בסוכנות להגנת הסביבה בארה"ב (USEPA) -sponsored בדיקת טכנולוגית תכנית ההערכה (TTEP). שלושה עשרה כימיקלים נבחרו לבדיקה כנציגי קשת רחבה של תרכובות תעשייתיות רעילות שעלולה להיות מזהמים אפשריים של מי שתייה. במהלך בדיקה, 9 של 13 התגלו על ידי ECIS בתוך שעות בריכוזים שרלוונטיים לבריאות האדם 8. טבלה 1 מציגה את תוצאות בדיקת זיהום זה. איור 4 הוא נציג של איזו תוצאה "מזוהמים" תיראה על המסך הקורא ECIS. על פי רוב, עכבות הסלולר ירד עבור דגימות מזוהמות בהשוואה לקבוצת ביקורת. לפעמים, תרכובות מסוימות עשויות לגרום לעליית עכבה.

כמו כן מוצג בטבלה 1 איור 5) עבור צילום מסך נציג "זוהה זיהום לא".

figure-results-1
איור 4: ECIS Reader תמונת מסך של דגימת מים "מזוהמת" דוגמא גרפיקת תוצאות עכבה מנורמלות ממדגם מים כי היה מזוהם.. קווים כחולים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות השליטה; קווים אדומים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות מדגם בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 5: מסך Reader ECIS של "זיהום זוהה לא" דגימת מי דוגמא גרפיקת תוצאות עכבה מנורמלות ממדגם מים שלא היה מזוהם.. קווים כחולים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות השליטה; קווים אדומים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות מדגם בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קטגוריה המזהם ריכוז נבדק (מ"ג / ליטר) 1 זוהה ≤1 שעה
n = 4/4 שבבי
דברה Aldicarb 0.17 לא
ארסן ic (arsenite נתרן) 4.5 כן
אזיד (אזיד הנתרן) 46.7 כן
Fenamiphos 0.56 לא
Methamidophos 1.4 לא
parathion מתיל 33.6 כן
Paraquat (dichloride) 4.6 לא
Pentachlorophenate (נתרן) 71.9 כן
כימיקלים תעשייתיים אַמוֹנִיָה 924 כן
נחושת (נחושת גופרתית II) 103 כן
ציאניד (נתרן) כן
מרקורי (כלוריד) 24.7 כן
טולואן 444 כן
מים נקיים 2 אף לא אחד NA לא
1 ריכוזים הנבדקים זהים בכתב היד על ידי וידר, et al. (2014).
2 40 דגימות מים נקיים נוהלו ללא זיהום.
3 "> 14

טבלה 1: מזהמים בדגימות מים זוהה על ידי ECIS.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכנולוגיה ECIS ביצועים טובים במעבדה הגדרה והיה מסוגל לזהות מזהמים מים פוטנציאל בריכוזים שרלוונטיים לבריאות האדם. ניידות ואריזה של הטכנולוגיה עושה את זה תורמת השימוש בשטח.

צעדים קריטיים בפרוטוקול להצלחת הטכנולוגיה הם כדלקמן: 1) לשמור על תנאים מזוהמים במהלך התרבות, זריעה, והאכלה של biochips, 2) שמור על biochips זרע בתנאים בקירור עד מוכן לבדיקה מאז תאי RTgill-W1 לא ישרוד זמן רב מאוד ברגע שהם חשופים לטמפרטורות מעל 25 ° C, 3) מדויקים לשקול את L-15ex צלוחיות תקשורת האבקה למדוד במדויק את דגימות מים כדי למנוע הפקת תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיגרם על ידי תזוזה osmolality של התקשורת ולא רעילות מדגם, 4) פעל לפי ההוראות המשתמש במסך ECIS להרצת בדיקות. התוכנה אצל הקורא יתריע למשתמש אם מדינה דוochip אינה מקובלת לבדיקה (המבוססת על קריאות עכבה ראשוניות) כאשר biochip מוכנס ראשון לתוך הקורא. אם רמות העכבה אינן מקובלות לבדיקה, התוכנה לא תאפשר למשתמש להמשיך עם בדיקות עד biochip חדש משמש. סיבות קריאות עכבה מקובלות בדרך כלל עקב חוסר תיאום קל של אלקטרודות biochip עם סיכות קורא ECIS או דליפת נוזל לאורך אחד הקצוות הדבקים של biochip.

יש כמה מגבלות על הטכנולוגיה הזו בגלל חיישן ECIS נבדק רק עם מי שתייה ולא עם מים עיליים. התאים RTgill-W1 כי הם על biochip לא יכול לסבול הקפאה או טמפרטורות הרבה מעל 25 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ממושך (מסגרת הזמן יכול להיות משעות ימים תלוי בטמפרטורה. Biochips לתפקד בצורה הטובה ביותר בתחום טמפרטורות מ בקירור בטמפרטורת החדר 7. הם מוכנים לשימוש מיידי, עם זאת, מיד לאחר להיות removed מ בקירור. מכולות בקירור ניידות משמשות כיום על ידי אנשי צבא בתחום אספקה ​​רגישה לטמפרטורה. מכולות אותו אלה יכולים לשמש לתחבורה biochip זרע.

עוד גבול טכנולוגיה זו הוא כי גם אם היא חיישן רעיל בפס רחב, זה לא מגיב היטב, אם בכלל, כדי תרכובות עיכוב cholinesterase, כגון חומרי הדברה מסוימים. למילוי זה פער יכולות, חיישן ECIS נועד לשמש בשילוב עם assay מבחן הדברה מהירה זמין מסחרי כאשר בודקים דגימות מים כדי לספק את המשתמש עם מגוון רחב יותר של בדיקות רעילות. ההערכה היא assay האנזימטית מהירה נועדה לזהות חומרי דברת organophosphate ו carbamate תוך 30 דקות.

חיישן ECIS משלים את WQAS-PM (ניתוח מערכות איכות מי - רפואה מונעת) מערכת בדיקת מים בתנאי שדה, המשמשת כיום על ידי אנשי רפואה מונעת צבאיים לזהות, ארסןic, עופרת, או ציאניד דגימת מים לשתייה. למרות חיישן ECIS לא יזהה מה חומר המזהם הוא, זה יציין אם מתכות מסוימות או תרכובות אורגניות נוכחות, המציין כי המים לא יכולים להיות מתאימים לצריכה אנושית. תוצאות בדיקת ECIS זמינות בתוך שעה. דגימות המים אז יכולות להישלח החוצה לניתוח נוסף לזיהוי של הזיהום אם יש תוצאה חיובית בבדיקה.

כפי שתואר לעיל, הקורא ECIS נועד להיות חלק ממערכת הכוללת ערכת ACE האנזימטית נפרד כדי לכסות ספקטרום רחב של גילוי מזהמים. שני קוראים אלה שצריכים לארוז בתיק חסון לתחבורת שדה לשימוש בשדה ידי חיילים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדעות, הפרשנויות, המסקנות וההמלצות הן של המחברים ואינן בהכרח מאושרות על ידי צבא ארה"ב. ציטוטים של ארגונים מסחריים או שמות מסחריים בדוח זה אינם מהווים אישור רשמי של המחלקה או אישור של הצבא למוצרים או לשירותים של ארגונים אלה. המחברים לינדה מ. ברנן ומארק ו. וידר, שניהם מהמרכז לחקר בריאות הסביבה של צבא ארה"ב, מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. מייקל מאיו, מייקל מקאליר ואלכס גרייס הם עובדי Nanohmics המייצרת את השבבים הביולוגיים והמכשירים החד פעמיים המשמשים במאמר זה.10251980

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פיקוד המחקר הרפואי והציוד של צבא ארה"ב ועל ידי התוכנית למחקר חדשנות בעסקים קטנים והעברת טכנולוגיה לעסקים קטנים; חוזה מס' W81XWH-13-C-0093. ברצוננו להודות לד"ר לוסי לי מאוניברסיטת פרייזר על היותה המנטורית שלנו לתרבית תאים RTgill-W1, ולהודות לד"ר נילס בולס מאוניברסיטת ווטרלו על פיתוח קו תאי RTgill-W1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר עובריLife Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com16000-085חנות @ -20 °C. הפשרה @ טמפרטורת החדר לפני השימוש. מרכיב למצע תרבית תאי L-15 מלא (10%).
פיברונקטין, פלזמה בקרEMD Millipore Corp.    www.emdmillipore.com           341631-1 מ"גחנות @ -20 °C. הפשרה @ טמפרטורת החדר לפני השימוש. יש לערבב עם מדיית L-15 לריכוז של 10 μ גרם/מ"ל והקפאה @ -20 ו-deg; C ב-aliquots. השתמש כמצע לביו-שבבים.
מצע L-15 ללא L-גלוטמיןLonza  www.lonzabioscience.com12-700Fחומר בזאלי לתרבית תאים והזנת שבבים ביולוגיים. יש לאחסן בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס.
אבקת L-15ex עם פנול אדוםUS ביולוגי              www.usbio.netL1501Media נשקל ב-60 מ"ג בבקבוקונים של 0.1 דראם ומאוחסן ב-6 מעלות; C בשקיות נייר כסף עם שקיות ייבוש. חיי מדף של תשעה חודשים. מעורבב עם 10 מ"ל דגימת מים לבדיקה בשבבים.
PBS, ללא Ca2+ או Mg2+Lonza  www.lonzabioscience.com17-516Fיש לאחסן בטמפרטורת החדר. משמש לשטיפת מדיה בעת ניסיון צלוחיות תרבית תאים.   
Trypsin, EDTALonza  www.lonzabioscience.comCC-5012Store @ -20 °C. להפשיר בטמפרטורת החדר ולהשתמש כדי לטריפסיניזציה של צלוחיות תרבית תאים. 
צלוחיות תרבית T175Fisher Scientific
www.fishersci.com		12-565-30משמש לתרבית תאי RTgill-W1.
אקונומיקהכלורוקס                                                                מדולל ל-20% עם מיליק או מים מזוקקים לניקוי שבבי ECIS. כל אקונומיקה ביתית מקובלת.
70% אלכוהוללחיטוי משטחי ביוהוד וכל חומר המונח בביוהוד.
תאי זימים של פורל קשת בענן (RTgill-W1) אוסף תרביות רקמות מסוג אמריקאי                      www.atcc.orgCRL-2523תאים שגודלו ושימשו לחיישן ביולוגי (זריעת שבבים ביולוגיים).
תוסף GlutaMAX-1, 200 מ"מלונזה  www.lonzabioscience.com35050-061יש לאחסן בטמפרטורת החדר. מרכיב למצע תרבית תאים L-15 מלא (1%).
פן / סטרפטוק סטוק 10K / 10KLonza  www.lonzabioscience.com17-602EStore @ -20 °C. הפשרה @ טמפרטורת החדר לפני השימוש. מרכיב למצע תרבית תאים L-15 מלא (1%).
צינורות BPT חמושיםתאגיד הפלסטיק האמריקאי          www.usplastic.com57317חתוך בחתכים של 27 מ"מ וחיטוי. משמש לזריעת שבבים ביולוגיים עם תאים וכלולאה סגורה בין שינויי מדיה.
אביזרי לואר פוליקרבונט למכלולי צינורות חמושיםValue Plastics             MTLS210-9מאובטח לכל קצה של צינורות Pharmed חתוכים להחדרה לתוך bichips.
מזרקים 20 מ"ל, קצה החלקהVWR Scientific          us.vwr.com BD302831משמש להזרקת תרחיף תאים לזריעת שבבי ECIS, כמו גם להזנת שבבים.
0.1 דראם מיקרוביאלי פוליפרופילן הצמדבקבוקים צנצנות וצינורות, בע"מ    www.bottlesjarsandtubes.com30600משמש לאחסון 60 מ"ג ציטוטים של אבקת L-15ex.
60 מיל Lexan נוזלי ECIS ביו-שבביםNanohmics, Inc.      תאי RTgill-W1 יוזרקו בהתאמה אישית על ידי Nanohmics, Inc. לתוך השבבים הביולוגיים ושבבים זרעים יוכנסו לקורא ECIS לבדיקה.
קופסת מכשירים מפלסטיק הניתנת לחיטוי
17 1/2 אינץ' x 7 3/4 אינץ' x 2 3/8 אינץ'		מדי-מינון EPS        medidose.comIB701משמש לאחסון הדברים הבאים: פקקים חיטוי, שבבים ביולוגיים שנוקו, שבבים ביולוגיים זרעים. 
שקיות עיקור איטום חום מנייר, 7 & frac12; ” x 13 אינץ'קרדינל הלת'              www.cardinalhealth.com90713משמש לחיטוי צינורות ואביזרים ותקעים.
מתקן אבקה אוטומטי של Quantosמטלר טולדו            www.mt.comQB5הוצאה אוטומטית של 60 מ"ג של אבקת L-15ex לבקבוקונים של 0.1 דראם.
קורא ECISNanohmics, Inc.      מיוצר בהתאמה אישית על ידי Nanohmics, Inc. שבב ביולוגי זרע מוכנס לקורא לביצוע בדיקת רעילות מים.
3 x 5 שקיות פוליפרופילן מתכתיות 2.5 מיל הניתנות לסגירה חוזרתUline                                www.uline.comS-16893אריזה ואחסון הן עבור שבבי ביו זרעים והן עבור בקבוקוני מדיה L-15ex באבקה.
Leatherman להשפריץ PS4אמזון                  משמש לפתיחת בקבוקוני אבקת מדיה.
1 גרם שקיקי סיליקה ג'ל ייבוש אולין                                www.uline.comS-3902הכניסו שקיות פוליפרופילן עם בקבוקוני אבקת מדיה L-15ex כדי למנוע מהאבקה לאסוף לחות.
בקבוקי Nalgene סטריליים 250 או 500 מ"לFisher Scientific
www.fishersci.com		09-740-25C או Eלהחזיק מתלי תאים לזריעת שבבי ECIS בביוהוד.
תקעים לביו-שבביםNanohmics, Inc.      מיוצר בהתאמה אישית על ידי Nanohmics, Inc. משמש לאיטום יציאות על שבבים ביולוגיים לפני האחסון בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס.
ניקוז עבור שבבי ECISNanohmics, Inc.      מיוצר בהתאמה אישית על ידי Nanohmics, Inc. מונח על 2 יציאות פנימיות על שבבים ביולוגיים לפני הכנסתם לקורא ECIS. מאפשר ניקוז עודפי מדיה מהתעלות במהלך הזרקות הבדיקה. 
המוציטומטרפישר Scientific
www.fishersci.com		S17040נחוץ לספירת תאים לפני התאמת תרחיף התאים להזרקה לביו-שבבים.
מיקרוסקופ Brightfield עם אובייקט 10XLeitz Labovertכל מיקרוסקופ שדה בהיר מקובל.
בטיחות ביולוגי Class IIכל ארון בטיחות ביולוגי מסוג II שבו ניתן לבצע תרבית תאים בתנאים סטריליים מקובל.
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.6 מ"לFisher Scientific
www.fishersci.com		02-681-311מחזיק 1 מ"ל של תרחיף תאים לפני ספירת התאים.
החלקה 10 סמ"ק מזרקים אדומיםProcedure Products, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-Rמושך 9 מ"ל של דגימת מי בדיקה ומשמש להזרקת דגימה לתוך שבב ביולוגי.
מזרקים כחולים 10 סמ"קProcedure Products, Inc.            www.procedureproducts.comS/49S 30-Bמושך 9 מ"ל של דגימת מים בקרה ומשמש להזרקת דגימה לביו-שבב.
½ oz. צנצנת פלסטיק שקופה לחיות מחמד עם כובעים מרופדים בצלעות לבנותבקבוק SKS & אריזות בע"מ              www.sks-bottle.com0605-30בקבוקוני דגימה המשמשים לערבוב אבקת L-15ex ו-10 מ"ל דגימת מים לבדיקה.
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן חרוטיפישר סיינטיפיק        www.fishersci.com12-565-269משמש להחזקת 40 מ"ל אליקוטים של 10 μ גרם/מ"ל פיברונקטין ב-20 מעלות צלזיוס.
בדיקת זיהוי מעכב אצטילכולין אסטראז NIDS ACEANP Technologies, Inc.
www.anptinc.com		חיישן ACE-400המיועד לזיהוי מהיר של חומרי הדברה במי שתייה
www.chlorox.com אתילי www.nanohmics.com www.nanohmics.com www.Amazon.com www.nanohmics.com www.nanohmics.com ארון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
  2. States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
  3. Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
  4. van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
  5. Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
  6. Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
  7. Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
  8. Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
  9. O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
  10. Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
  12. Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
  13. Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
  14. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
  15. Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
  16. RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים