הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

58.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53561

⸱

1 בינואר 2016

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

תקציר

האיבר של קורטי, השוכן בשבלול של האוזן הפנימית, מכיל תאי שיער מכניים-סנסוריים ותאים תומכים המאורגנים בצורה ספירלית ובעלי שיפוע טונוטופי לזיהוי קול. שבלול העכבר הוא באורך של כ-6 מ"מ ולעתים קרובות מחולק לשלושה סיבובים (קודקוד, אמצע ובסיס) לצורך ניתוח. כדי לחקור אובדן תאים, חלוקת תאים או ביטוי גנים בפסיפס, כל ההכנה של השבלול שימושית. שיטת דיסקציה זו מאפשרת הדמיה של כל התאים בתוך האיבר של קורטי בשילוב עם צביעה חיסונית ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמות תאים במישורים שונים בציר ה-z. ניתן להשיג חתכים אופטיים מרובים גם מתמונות z-stack אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בכל שיטת חיתוך ההרכבה לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, אם כי יש צורך בשיטת קיבוע שונה. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד את איבר קורטי כשלושה סיבובי שבלול שלמים (קודקוד, אמצע ובסיס). ניתן להשתמש בשיטה זו עבור עכברים מגיל שבוע ועד לבגרות ושונה מהטכניקה המשמשת לדגימות יילודים בהן הסתיידות השבלול אינה שלמה. ניתן להשתמש בגרסה מעט שונה לדיסקציה של שבלול החולדה. אנו גם מדגימים הליך לצביעה חיסונית עם נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים.

מבוא

השבלול בצורת הספירלה של האוזן הפנימית, בתוך העצם הטמפורלית, בתי האיבר של קורטי, איבר השמיעה החושי הסוף ביונקים. השבלול מאורגן tonotopically ומחולק בדרך כלל לפסגה, אמצע, ובסיס פונה מתאים לאזורים שונים בתדירות עם זיהוי קול בתדר גבוה בבסיס וזיהוי בתדר נמוך בקודקוד 1. תאי שיער, תאי mechanosensory של האיבר של קורטי, לאורכו של שבלול האוזן, שהם כ 6 מ"מ ארוך בעכברי 2,3. תאים אלה להמיר את האנרגיה המכנית של גלי קול, שמועברים דרך המבוך הקרומי מלא הנוזל, לאותות עצביים המעובדים על ידי מבנים שמיעתיים מרכזיים. הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה להכנת mounts של האיבר של קורטי כל אחרי ההסתיידות של השבלול היא מלאה (לדגימות החל שבוע בגיל אחת לבגרות). כמו כן, אנו מציגים שיטה לimmunostaining כל רכוב רקמת שבלול. mounts כל שבלול הם קריטיים להדמיה של כל תאי השיער ותאים המקיפים את תמיכה בסידורים מרחביים הטבעיים שלהם ולאפשר לניתוח בשלושה ממדים בשימוש במיקרוסקופ confocal.

בני הזוג. האנס Engstrom והארלו עדס במקור תיארו שיטת הר שלמה שבלול נתיחה בשנת 1966. הם מפורטים טכניקה לתקן במהירות ולנתח cochleae המסויד שקוע בנוזל ממגוון רחב של יונקים, שמירת מגזרים שלמים קצרים של האיבר של קורטי לניתוח מיקרוסקופי 4. הנתיחה של שבלול עכברוש מבולבל, מסויד גם כבר מודגמת בסרטון הדרכה 5. בני הזוג. ברברה Bohne וגארי הרדינג באוניברסיטת וושינגטון עשו כמה שינויים חשובים בשיטה זו. בגרסתם של שיטת ההר השלמה השבלול, העצם הטמפורלית היה נטול הסידן, משובץ בפלסטיק, וחמישה וחצי או עשרה סיבובים רבע תור היו dissecטד 6,7. ד"ר צ'רלס ליברמן ועמיתיו באיטון מעבדות פיבודי, מסצ'וסטס עין ואוזן המרפאה, השינוי בטכניקה זו, כך שהטבעת הפלסטיק לא נדרשה 8. שינוי נוסף של הטכניקה התרחש במעבדה של ד"ר ג'יאן זואו בבית החולים למחקר סנט ג'וד 9-12 שהודיע ​​לשיטה לנתיחה שהוצגה כאן. אנו משתמשים באסטרטגיה שונה כדי לקבל גישה לאיבר של קורטי מאשר Bohne וליברמן, המאפשר בידוד של הפסגה מלאה, אמצע, וסיבובים בסיסיים. כך הרקמה גזור היא גדולה יותר ופחות סיכוי להיות אבד או ניזוק במהלך תהליכי הנתיחה או immunostaining. בנוסף, השיטה הנוכחית מאפשרת מדידה של המרחק מקצה הקודקוד או הוו בסיסי לזיהוי אזור תדר.

למרות שמעבדות רבות לבצע immunostaining של רקמת שבלול, לא ברור היכן מקורו בשיטה זו. כתוצאה מכך יש מתכונים שונים לחסימת buffeRS ומאגרי דגירה נוגדן שעשוי להשפיע על הביצועים של נוגדנים ראשוניים בודדים. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לimmunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently שחל על נוגדנים הנפוצים ביותר בתחום השמיעתי.

הצורה המורכבת של השבלול, המבנה עדין של האיבר של קורטי, וההסגר גרמי לספק אתגר לניתוח היסטולוגית וביוכימיים. מגוון של טכניקות משמש כיום בתחום השמיעה להתגבר על התכונות קשות האלה ולדמיין את התאים בתוך האיבר של קורטי, כל טכניקה עם יתרונות משלה וחסרונות. הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לנתיחה הר שלמה של שבלול העכבר הבוגר ו, עם שינוי קל, עלול לשמש כדי לבחון מבנים הקריטיים בתוך cochleae ממגוון רחב של אורגניזמים מודל אחרים המשמשים בתחום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש באוניברסיטת דרום אילינוי לרפואה.

1. הפקה של עצמות זמניות

  1. לזהות עצמות זמניות בבסיס גולגולת העכבר 13 ולגרד ממנו את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים דפוס סטנדרטיים.
  2. מניחים מלקחיים דפוס סטנדרטיים בקצה של הקפסולה otic ועם האגודל של יד העיתונות ההפוכה על התעלה חצי עגולה האחורית כדי לסלק את השבלול במארז.
  3. לשחרר את החצי התחתון של העצם הטמפורלית מהגולגולת באופן ידני עם האגודל והאצבע או באמצעות 10.5 סנטימטר מספריים עדינים.

2. פוסט לתקן עצמות זמניות

  1. מניחים עצמות זמניות לתוך 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge המכילים 250-500 μl paraformaldehyde 4% (PFA) בדילול מלא בופר פוספט 10 מ"מ (PBS) pH 7.4 וincubאכלתי ב RT עבור 2 - 20 שעות.
    הערה: אין צורך בפתיחת המכסה או הזרקת הפסגה של PFA לסיבוב החלון סגלגל או. מומלץ להשתמש בכיתת מתנול החופשית, אולטרה-טהור, במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) PFA שניתן לרכוש בריכוז 16% בבקבוקוני זכוכית. ברגע שבקבוקון נפתח ודילול 1: 4 בPBS, מה שהופך את פתרון 4%, ניתן להשתמש בו לתקופה של עד 2 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלסיוס (נוגדנים מסוימים דורשים קיבוע ואחרים קצרים יכול לסבול O / N (O / N) קיבעון).

3. עצמות זמניות Decalcify

  1. לאחר קיבוע, להסיר PFA בעזרת פיפטה ולהחליף עם 120 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מעט יותר מ -2 מיליליטר. הקפד למלא את צינור microcentrifuge 2 מיליליטר כל כדי למנוע בועות אוויר כאשר הצינור סגור.
    1. אם לא decalcifying מייד, להחליף PFA עם דגימות pH 7.4 וחנות 10 מ"מ PBS ב 4 מעלות צלסיוס
      הערה: לאחר קיבוע, ניתן לאחסן עצמות זמניות לvariable מסתכם של זמן עד שנבחן decalcification בהתאם לאנטיגנים.
  2. מקום צינורות על הכתף הסוף-על-הסוף ולסובב ב 4 סל"ד ב RT. לשנות פתרון EDTA יומי בעזרת פיפטה. אורכו של decalcification תלוי בגיל של המדגם והעדפתו של המדען עושה הנתיחה.
    1. דגירה עצמות זמניות בEDTA באמצעות ההנחיות לזמני דגירה הבאות:
      עבור דגימות יום (P) לאחר הלידה 8 לP15: 2 - 4 שעות; לP15 דגימות לP21: O / N; לP21 דגימות לP30: 2 O / N; עבור דגימות מבוגרות מP30: 3 או יותר O / N.
      הערה: הפעמים decalcification כפופות להעדפה של משתמשים וניתן להרחיב על פי צורך. זמן decalcification יכול להיות מופחת על ידי שינוי פתרון EDTA פעמיים ביום, מלבד כ -8 שעות. מעבדות כמה להוסיף 1% PFA לפתרון EDTA כאשר decalcifying ליותר מ -3 ימים על מנת למנוע זיהום.
  3. כדי לקבוע אם המדגם הוא נטול הסידן כראוי, למקם את העצמות זמניות oסיליקון אלסטומר na מצופה צלחת לנתיחה ולוחץ בעדינות על מלקחיים השבלול בצורת השבלול. אם הרקמה היא ספוגית, אז decalcification הוא מלא.
  4. ברגע שdecalcification הושלם, להסיר EDTA בעזרת פיפטה ולהוסיף 500 -1000 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4. דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לנתח.

4. צור צלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון

  1. מערבבים את הבסיס וסוכן ריפוי של ערכת encapsulant אלסטומר סיליקון על פי הוראות היצרן ומערבבים היטב.
  2. להוסיף כ 2 - 3 כפות של אבקת פחם עד הפתרון הוא שחור ומערבבים היטב.
    הערה: דיו נוזלי או פחם נוזלי לא לערבב עם הפתרון ולא ניתן להשתמש בו. ניתן לרכוש ערכות encapsulant אלסטומר סיליקון בצבע שחור, המאפשרות ללהשמיט שלב 4.2.
  3. יוצקים את הפתרון לזכוכית 60 מ"מ או צלחות פטרי פלסטיק, מילוי מספיק כדי מעיל התחתון. אם bubbles נמצא, עלים עם אוויר על פני השטח. תן לעמוד לפחות 24 שעות בRT להגדיר.
    ניתן להשתמש בכלים מצופים אלסטומר סיליקון שוב ושוב במשך שנים: הערה. עם זאת אין להשתמש באתנול לניקוי, כמו זה יגרום אלסטומר סיליקון לפיצוח.

5. הר השלם Dissection של השבלול (לP7 ודוגמאות ישנות יותר)

  1. הפרד את התור הבסיסי מתור הפסגה / אמצע
    1. מניחים עצם הטמפורלית נטול הסידן אחד בצלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון מולא באופן מלא שני שלישים עם 10 מ"מ PBS pH 7.4 ולהשתמש מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו לשלבים הבאים.
    2. החזק את העצם הטמפורלית באזור שיווי המשקל עם מס '4 או # 5 המלקחיים של צורף ישר ובאמצעות 5 מ"מ מספריים אביב Vannas-טובינגן, לחתוך רקמות כמוסת otic עודפות לאורך הצדדים ומעל לקודקוד.
    3. באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, הכנס להב אחד לחלון הסגלגל ולעשות כמה חתכים קטנים לאורך רצועת ספירלה / לרוחבקיר של התור הבסיסי.
    4. בעזרת מספריים אביב 5 מ"מ Vannas-טובינגן, הכנס להב אחד לאזור רק לחתוך ולמקם את הלהב האחר על מחוץ לעצם הטמפורלית, המדיאלי לחלון הסגלגל. קיצוץ זה מפריד תור הבסיסי מתור אמצע והפסגה.
  2. נתיחה מלאה של התור הבסיסי.
    1. באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לחתוך את סיבי עצב הגנגליון ספירלה המתחברים כלִּישׁוֹר כדי לשחרר את המתח בתורו הבסיסי ולחתוך מתחת לתורו הבסיסי להיפרד מאיברי שיווי המשקל.
    2. באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לעשות סדרה של חתכים קטנים כדי להסיר את רצועת ספירלה / הקיר לרוחב משני מעל ומתחת לאיבר של קורטי. השתמש # 4 או 5 # המלקחיים של צורף ישר כדי להנחות את הרקמה. הצמד את סיבי עצב הגנגליון ספירלה לצלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון, אבל לא להיאחז אזור זה כרקמה תקרע.
    3. במהלך השלבים הקודמים, חלק מmembran של רייסנרהדואר יהיה לעתים קרובות יוסר. אם כל עדיין, לתפוס הקרום של רייסנר עם המלקחיים # 4 או 5 של תכשיטים ישרים ולהתרחק מהאיבר של קורטי.
      הערה: קרום tectorial הוא לעתים רחוקות גלוי, ובדרך כלל צף משם ללא צורך בצעד מסוים להסרת.
    4. סוף סוף לעשות כמה חתכים כדי להפחית את העובי של אקסונים הגנגליון ספירלה, על מנת להפוך את התור שטוח ככל האפשר ולהשתמש מס '4 או # 5 המלקחיים של צורף ישר להעביר את תור הבסיס גזור, על ידי אחיזת האקסונים הנותרים של הגנגליון הספירלה, ל צלחת 48-היטב (או תא שקופיות) המכילים ~ 500 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4.
  3. אמצע נפרד וסיבובי הפסגה
    1. הנח את שני השלישים הנותרים של שבלול האוזן, צד הפסגה למטה.
    2. באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, הכנס להב אחד לתקשורת סקאלה בי תור האמצע משמש לחיבור לתורו הבסיסי, ולעשות כמה חתכים קטנים לאורך רצועת ספירלה / הקיר לרוחב של הדואר אמצע התור.
    3. בעזרת מספריים אביב 5 מ"מ Vannas-טובינגן, הכנס להב אחד לאזור רק לחתוך עם תור האמצע ממוקם על גבי הלהב, ולמקם את הלהב האחר על מחוץ למבוך הגרמי, בזווית של 90 o מקצה הקודקוד. זה מפריד תור האמצע מתור הפסגה.
  4. נתיחה מלאה של תור האמצע בצורה דומה לתורו הבסיסי (ראה 5.2.2 צעדים ל5.2.4).
  5. נתיחה מלאה של תור הפסגה.
    1. באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לפתוח את הכובע שמכסה את תור הפסגה. נתיחה מלאה באופן דומה לתורו הבסיסי (ראה 5.2.2 צעדים ל5.2.4).
      ניתן לאחסן תור שבלול גזור ב10 מ"מ PBS pH 7.4 בצלחת 48-היטב (או שקופיות קאמריות) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני immunostaining: הערה. עם זאת PBS יתאדה וצריך להתחדש מעת לעת והאחסון ארוך יותר מ2-3 שבועות יכול לגרום להתפתחות חיידקים או פטרייתי ברקמה אשר יכול להקטין את איכות התמונה. אנו ממליצים אחסון לטווח הארוך של דוגמאות כמו עצמות זמניות undissected.

Immunostaining 6. עם נוגדנים מתויגים fluorescently ש

  1. לאחר הנתיחה, לאחסן כל תור שבלול ובנפרד בצלחת 48-היטב (או שקופיות קאמריות), שקוע ב~ 500 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4. לכל אחד מהשלבים הבאים תור השבלול צריך להיות שקוע בנוזל, לא צף על גבי או דבוק לצד השני של הבאר.
    הערה: בעת הסרת נוזל מכל טוב, זה קל לאבד את תור השבלול או למצוץ אותו בקצה פיפטה. שינוי פתרונות עם קצה פיפטה 200 μl באמצעות היקף נתיחה יעזור למנוע את זה.
  2. בעזרת פיפטה, להסיר PBS מכל טוב ולהחליף עם ~ 200-300 μl לכל גם חסימה / פתרון permeabilization (1% Triton X-100, 1% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -10% עזים בסרום נורמלי (NGS) בדילול מלא 10 עמ מ"מ PBSH 7.4). דגירה שעה 1 ב RT על הכתף 3D.
    הערה: אם כל נוגדן ראשוני משמש נעשה במארח עז, אז נוגדן אנטי-עז משנית יהיה צורך ולא צריך להיות בשימוש NGS לכל אחד מהשלבים. סרום סוס רגיל יכול לשמש כתחליף לNGS.
  3. הסר חסימה / פתרון permeabilization בעזרת פיפטה ולהחליף עם כל טוב של פתרון נוגדן ראשוני ~ 100 μl (0.1% Triton X-100, NGS BSA 1%, ו -5% בדילול מלא 10 מ"מ PBS pH 7.4). הגורם לדילול עבור כל נוגדן ראשוני משתנה. דגירה O / N (HR 14 המינימום) בשעת 4 המעלות צלסיוס על הכתף 3D.
    הערה: אם משמש נוגדן אחד או יותר יסודי, כל ניתן לשלב אותו הפתרון לדגירה, רק לוודא שכל נוגדן ראשוני מארח שונה.
  4. הסר פתרון נוגדן ראשוני בעזרת פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. כל אחד לשטוף דוגר מינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D.
  5. הסר P האחרוןBS לשטוף בעזרת פיפטה ולהחליף עם ~ 100 μl לכל גם פתרון נוגדנים משני (0.1% Triton X-100, NGS BSA 1%, ו -5% בדילול מלא 10 מ"מ PBS pH 7.4). הגורם לדילול עבור כל מתויג fluorescently נוגדנים משני הוא בדרך כלל 1: 500 או 1: 1,000. מניחים צלחת 48-היטב בקופסא שחורה כדי להגן מתויג fluorescently נוגדנים משני מהאור. דגירה 2 - 3 שעות ב RT על הכתף 3D.
    הערה: אם יש צורך בנוגדן אחד או יותר משני, הם יכולים להיות משולבים לאותו פתרון לדגירה. ודא שאין אפשרות של תיוג צולב (למשל., באמצעות עז נגד ארנב ועוף אנטי-עז נוגדנים משני)
  6. הסר פתרון נוגדנים משני באמצעות פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. דגירה כל שטיפה למינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור.
  7. הסר לשטוף PBS האחרון בעזרת פיפטה ולהחליף עם כל טוב של Hoec ~ 100 μlHST 33342 (בדילול 1: 2,000 ב 10 מ"מ PBS pH 7.4) לתייג גרעינים. דגירה 15 - 20 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור. אל דגירה ארוכה יותר מ -20 דקות.
  8. הסר פתרון Hoechst בעזרת פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. דגירה כל שטיפה למינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור.
  9. ניתן להרחיב את כל הצעדים, למעט הדגירה Hoechst, על ידי כמה שעות במידת הצורך. כדי להשהות את התגובה בכל שלב, רק לצלול דגימות ב~ 500 ul של 10mm PBS pH7.4 ולאחסן את הצלחת 48 "טוב (או תא שקופיות) בשעת 4 המעלות צלסיוס עד מוכן לחדש את שעות פרוטוקול או 1 - 2 ימים לאחר מכן .

7. הר שבלול מאירה בשקופיות

  1. תווית שקופיות עם מידע רלוונטי על המדגם ונוגדנים בשימוש.
  2. פיפטה ~ 50 μl של תקשורת הרכבה על כל שקופית ולהיזהרכדי למנוע בועות. צנטריפוגה הצינור המכיל את תקשורת ההרכבה כדי להסיר בועות.
  3. שימוש במס '4 או מלקחיים # 5 של התכשיטים ישרים, לתפוס את האקסונים של הגנגליון הספירלה להעביר בעדינות תור שבלול אחד מהצלחת 48 היטב לשקופית והמקום בתקשורת ההרכבה. הר תור שבלול אחד לכל שקופית כדי למנוע חשיפה לאור וphotobleaching במהלך תהליך ההדמיה.
  4. השתמש במיקרוסקופ לנתיחה סטריאו כדי להבטיח שתור שבלול אינו מקופל, מעוות, או בסמוך בועת אוויר. אם כל התנאים הללו מתרחשים, המלקחיים # שימוש 4 או 5 של התכשיטים ישר כדי למקם מחדש את תור השבלול.
  5. מניחים בקצה אחד של coverslip בשקופית ומשחרר בעדינויות לתת coverslip הסתיו.
  6. השתמש במיקרוסקופ לנתיחה סטריאו כדי להבטיח שתור השבלול אינו מקופל, מעוות, או בסמוך בועת אוויר. אם כל התנאים הללו מתרחשים, בעדינות להזיז את coverslip קדימה ואחורה כדי למקם מחדש את תור השבלול.
  7. שקופיות מקוםבתיקיית שקופיות, כך שהם שכבו. בואו הרכבה O תרופת תקשורת / N ב RT (לשמור בחושך)
  8. coverslips חותם עם לק ציפורניים ברורים ולאחסן ב RT או C -20 o עד צילם. שקופיות ניתן לאחסן בתיקיית שקופיות או תיבת שקופיות.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות לטווח ארוך בC -20 o או -80 מעלות צלסיוס וקרינה יישמר במשך כמה חודשים.
  9. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם אורך הגל המתאים המבוסס על הנוגדנים משני המשמשים במהלך הליך immunostaining. ניתן לבצע התאמות בהירות והניגודיות באמצעות תוכנת ההדמיה מסופקת על ידי הספק confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס) מרקמת שבלול שהוא מסויד, בצעדים לנתיחה מפתח מוצגים באיור 1. בשבוע הראשון לאחר הלידה של פיתוח, ההסתיידות של שבלול העכבר אינו שלם ושיטה לנתיחה פשוטה יותר ניתן להשתמש 13. שימוש בשיטה בילוד ההר שלמה לנתיחה עם שבלול מP7 ותוצאות עכברים מבוגרים בדמעות ורטוש של האיבר של קורטי. רצועת ספירלה / הקיר לרוחב כעת מחובר היטב יותר ולא ניתן התקלף מהאפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם מספר צעדים קריטיים לנתיחה מוצלחת כל ההר וimmunostaining. עם זאת, לפני אחת מהשיטות הבאות מבוצעות, יש צורך בקיבוע הנכון של רקמת השבלול. אנו ממליצים על שימוש בכיתה ללא תשלום, אולטרה-טהורה, EM PFA מתנול. PFA עשוי אבקה יכולה להיות עקבות של מתנול ו- pH יציב אשר מקטין את האיכות של immunofluorescence. גם קבוצות אחרות הראו כי ניתוחים דומים הם fixatives באמצעות אפשרי שאינו מכיל פורמלדהיד 14-16. אורכו של הקיבעון הוא גם חשוב וספציפי נוגדן. נוגדנים מסוימים יכולים לסבול O ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מהמשרד למחקר ימי (N000141310569). ציוד מתקן ההדמיה המחקרי של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרום אילינוי נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר-בריאות (S10RR027716).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלקחיים סטנדרטיים  דפוסFine Science Tools11000-12ניתן לרכוש מספקים אחרים
מספריים עדינים 10.5 ס"מFine Science Tools14060-11ניתן לרכוש מספקים אחרים
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהMidSciAVSS2000מספקים אחרים
16% פורמלדהיד, ללא מתנול, טהור במיוחד, Polysciences בדרגת EM18814רעיל - ללבוש כפפות ולא ניתן להשליך אותו לכיור. ניתן לרכוש מספקים אחרים. 
PBS pH 7.4 SigmaP3813-10PAKמספקים אחרים
EDTAFisherBP118-500מספקים אחרים
ניתן לרכוש מסובב צינור קצהFisher05-450-127מספקים אחרים
צלחת פטרי 60 מ"מניתן לרכוש אתFisher50-202-037
מעטפת סיליקון Dow Corning Sylgard 184Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
פחם פעילFisherAC134372500ניתן לרכוש מספקים אחרים
מיקרוסקופ דיסקציה סטריאוZeissStemi 2000ניתן לרכוש מספקים אחרים
Dumont #4 מלקחיים של תכשיטןFine Science Tools11241-30
Dumont #5 מלקחיים של תכשיטןFine Science Tools11251-20
2.5 מ"מ Vannas מספריים קפיצייםFine Science Tools15001-08מעוקל 
מספריים קפיציים 5 מ"מ Vannas-TubingenFine ScienceTools 15003-08צלחות ישרות
48 בארותניתן לרכוש אתפישר08-772-52
מגלשות קאמריות 8 בארות1256518 פישרמספקים אחרים
Triton X-100SigmaX100-500מספקים אחרים
BSA, שבר Vניתן לרכוש את FisherBP1605מספקים אחרים ניתן לרכוש
מעבדות NGSVectorS-1000מספקים אחרים
מעבדות NHSVectorS-2000מספקים אחרים
ניתן לרכוש מסובב תלת מימדMidsciR3D-710מספקים אחרים
תיבת דגירה של כתמים מערביים XLLicor929-97401
ניתן לרכוש את Hoechst 33342Life TechnologiesH3570מספקים אחרים
את Prolong gold antifade הרכבה מדיהTechnologies P36930מספקים אחרים, אך מדיות הרכבה משתנות ביכולתן להגן מפני הלבנת פוטו
Superfrost Plus SlidesFisher12-550-15ניתן לרכוש מספקים אחרים
כיסויים 22 x 22 x 1Fisherניתן לרכוש 12-548-Bמספקים אחרים
לק שקוףבבית מרקחתמספקים אחרים
תיקיית שקופיות קרטוןפישר12-587-10לרכוש מספקים אחרים
קופסת שקופיות מפלסטיקפישר03-448-10ניתן לרכוש מספקים אחרים
ניתן לרכוש את ניתן לרכוש את קצה מספקים אחרים ערכת מספקים אחרים ניתן לרכוש את ניתן לרכוש אתניתן לרכושניתן לרכוש Life ניתן לרכוש מקומי ניתן

מקורות

  1. Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
  2. Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
  3. Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
  4. Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
  5. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442(2011).
  6. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
  7. Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
  8. Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
  9. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
  10. Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
  11. Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
  12. Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
  13. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685(2010).
  14. Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
  15. Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
  16. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  17. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Z
ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.