מאמר שיטה

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

DOI:

10.3791/53564

⸱

6 באפריל 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול מהיר לעיכול פרוטאוליטי עם מיקרו-ריאקטור טריפטי שנבנה בזרימה פנימית יחד עם ספקטרומטר מסה של יינון אלקטרו-ספריי (ESI). מתוארים ייצור המיקרו-כור, מערך הניסוי ותהליך רכישת הנתונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרוב המכריע של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוסס שיטות ניתוח חלבון בה התקדמות עיכול אנזימטי לפני הגילוי, בדרך כלל עם טריפסין. שלב זה הכרחי עבור הדור של פפטידים בעלי משקל מולקולרי קטן, בדרך כלל עם MW <3,000-4,000 Da, כי ליפול בתוך טווח סריקה יעילה של מכשור ספקטרומטריית מסה. פרוטוקולים קונבנציונליים לערב עיכול אנזימטי O / N ב 37 ºC. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מגוון רחב של אסטרטגיות, בדרך כלל בתחום השימוש של microreactor עם קיבוע אנזימים או של מגוון רחב של תהליכים פיזיקליים משלימים המפחיתים את הזמן הדרוש לעיכול פרוטאוליטים לכמה דקות (למשל, מיקרוגל או גבוהה לַחַץ). בעבודה זו, אנו מתארים גישה פשוטה וחסכונית שיכול להיות מיושמת בכל מעבדה להשגת עיכול אנזימטי מהיר של חלבון. החלבון (או תערובת החלבונים) היא adsorbed על Perf הגבוהה C18-בונדד התהפכו פאזייםormance כרומטוגרפיה נוזלי (HPLC) חלקיקי סיליקה נטענו מראש טור נימים, טריפסין חיץ מימי הוא החדיר מעל החלקיקים לתקופה קצרה של זמן. כדי לאפשר on-line זיהוי MS, פפטידים tryptic הם eluted עם מערכת ממס עם תוכן אורגני גדל ישירות למקור MS יון. גישה זו תמנע את השימוש של חלקיקי קיבוע אנזימים יקרן ואינו מצריכה כל עזרה שתגיע להשלמת התהליך. עיכול חלבון וניתוח מדגם מלא ניתן להשיג בפחות מ ~ 3 דקות ו ~ 30 דקות, בהתאמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי ואפיון של חלבונים מטוהרים מושגת לעתים קרובות על ידי שימוש בטכניקות MS. החלבון מתעכל עם אנזים ופפטידים שלה מנותחים עוד יותר על ידי MS באמצעות התקנה ניסיונית עירוי פשוט. עיכול פרוטאוליטים הכרחי להפקה שברי פפטיד קטנים שנופלים הטווח המוני השימושי של רוב מנתחי MS, וזה יכול להיות מקוטע בקלות דרך התנתקות מושרה התנגשות אנרגיה נמוכה להפקת מידע רצף חומצות האמיניות. עבור חלבונים מבודדים או תערובות חלבון פשוט, אין צורך עוד הפרדה chromatographic של פפטידים לפני גילוי MS. תערובת של פפטידים 25-50 להיות יכולה לנתח בקלות על ידי יציקת המדגם עם משאבת מזרק ישירות מקור יון MS.

ספקטרומטר המסה יכול לבצע את הניתוח ולאשר את הרצף של חלבון בתוך מסגרת זמן קצרה. בעזרת שיטות איסוף הנתונים מודרניות, תהליך זה יכול להתבצע within כמה דקות או אפילו שניות. הגורם המגביל בהשלמת התהליך על בקנה מידת זמן קצר הוא צעד העיכול פרוטאוליטים. בדרך כלל, זה מתבצע על פני כמה שעות (או O / N), בתמיסה, ב 37 ºC, באמצעות מצע: יחסי אנזים של (50-100): 1. כדי לצמצם את זמן עיכול אנזימטי לדקות או שניות, microreactors אנזים משותק, בצורה של כורי microfluidic או מחסניות זמינות מסחרי, תוארו. 1-6 בדרך כלל, האנזים הוא משותק על ידי קוולנטיים, הלא קוולנטיים / ספיחה פיזית, מורכב היווצרות או אנקפסולציה, 3,6 יעילות משופרת של תהליך אנזימטי מתאפשר בזכות יחסי קרקע-נפח האנזים אל המצע גדול. יתרונות נוספים של כורים משותקים כוללים מופחת autolysis והתערבות של האנזים בניתוח MS, שיפור יציבות אנזים ויכולת שימוש חוזר. מגוון של גישות, באמצעות זכוכית או מכשירי microfabricated פולימריים תואר,באמצעות אנזימים משותקים על חרוזים מגנטיים ידי אינטראקציות נוגדן-אנטיגן, 7,8 הלכוד רשתות ננו-חלקיקים מזהב, 9 גלומים סול ג'ל טיטניה-אלומינה 10 ו nanozeolites, 11 או נתפסו באמצעות Ni-נ.ת.ע או ההיווצרות המורכבת-Tag שלו. 6 לחלופין נימים, פתוח צינורי עם קיבוע אנזימים פותחו, כמו גם. 12 יתר על כן, מחשוף פרוטאוליטים משופר הודגם באמצעות הקרנת מיקרוגל מבוקר 13 או לחץ בסיוע או לחץ טכנולוגית אופניים (PCT) לצמצום זמני התגובה ל 30-120 דקות. 14

למרות היתרונות המרובים של כורי אנזים משותקים, העלויות של מחסניות מסחריות היא גבוהות, הזמין של מכשירי microfluidic לשימוש שיגרתי מוגבל, ושימוש תוצאות טכנולוגיות מיקרוגל או PCT ב צורך במכשור נוסף. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה כי circumveNTS החסרונות האלה, וזה יכול להיות מיושם בקלות בכל מעבדה להעצים חוקרים עם גישה פשוטה ויעילה לביצוע מחשוף אנזימטי של חלבונים כהכנה לניתוח MS בתוך דקות. הגישה מתבססת על השימוש הידרופובי, C18-חלקיקים שהם שנטענו מראש נימים או מכשיר microfluidic, ואת הספיחה של החלבון (ים) של עניין על חלקיקים אלה ואחריו עיכול אנזימטי במהלך העירוי של האנזים על מיטה וחלבון שנתפס ארוז (ים). לפי גישה זו, המצע הוא משותק באמצעות קישור לא קוולנטי, ואת האנזים הוא החדיר מעל החלבון ההמום. יעילות עיכול פרוטאוליטים מוגברת על-ידי אזורים פני החלקיקים גדולים החושפים את חלבון לעיבוד האנזימטית, מרחקים וזמני דיפוזיה אל מפני השטח של חלקיקים, שיפור העברת המוני, לא מצורף קוולנטיים שעשויים להשפיע על פעילותו של האנזים, היכולת במהירות evaluatשילובי דואר של אנזימים שונים, disposability, ריבוב אם התהליך מבוצע במתכונת microfluidic. גישה זו באה לידי ביטוי עם השימוש תערובת של חלבונים סטנדרטיים טריפסין-האנזים הנפוץ ביותר לעיכול פרוטאוליטים לפני גילוי ESI-MS. ספקטרומטר מסה משמש לגילוי במחקר זה היה quadrupole מלכודת ליניארי המכשיר (LTQ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של נימי microreactor

  1. חותכים את 100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) x 360 מיקרומטר קוטר חיצוני (OD) נימי באורך של 7-8 ס"מ, ואת נימי 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD 3-5 ס"מ עם קופיץ נימי זכוכית; לאמת תחת מיקרוסקופ כי בשני הקצוות נימי יש חתך נקי, ישר, ללא כל קוצים בולטים.
  2. הכנס את 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי לתוך קצה אחד של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר, למשך פרק ~ 6 מ"מ; במקרה הצורך, יש למלא אחר המבצע הזה תחת מיקרוסקופ.
  3. החל טיפה קטנה של E6000 הדבק סביב צומת של הנימים מזהים 90 מיקרומטר OD / 100 מיקרומטר עם סופו של Q-Tip, ולתת את התרופה הדבקה O / N ב RT.
  4. חותכים את 20 מוכנס מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי באורך של ~ 10-15 מ"מ; זה יהיה פולט יינון electrospray.
  5. טרום לחתוך באמבטיה "OD הצצה, 1/16" הצצה OD ו 1/16 "OD PTFE 1/32ing לחתיכות של 4-5 ס"מ אורך; אלה יהיו השרוולים המשמשים איגודים נימי למתן חיבור חופשי דליפה.
  6. חבר את הקצה השני של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר לאיחוד הצצה; להשתמש שרוול 1/32 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
  7. הכנס / להדק פיסת ~ 5 ס"מ 1/16 "צינורות PTFE אל הקצה השני של האיגוד.
  8. לשקול ~ 4 מ"ג של C18 (5 מיקרומטר) חלקיקים בתוך מראש לנקות / יבשים 2 בקבוקון זכוכית מ"ל; להוסיף 0.5 מ"ל isopropanol, לסגור את הבקבוקון לפזר את התערובת הדלילה באמבטיה ultrasonicator.
  9. משיכה עם מזרק 250 μl כ 200 סלארי μl, הכנס את מחט המזרק בצינור 1/16 "PTFE של האיגוד הצצה, ולחלק את התערובת הדלילה לאט לתוך נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר; להתבונן תחת מיקרוסקופ כמו נימים מתמלאות חלקיקים עד אורך של אריזת 2-3 מ"מ מושגת; זה יהיה microreactor (איור 1) 20 μ.נימים מ מזהה שומרות על חלקיקי microreactor דרך שפעת Keystone. 15
  10. שוטפים את microreactor עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, ולאחר מכן עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 98: 2 V / V.

2. הכנת פתרונות לדוגמא

הערה: תפעול הכרוכות בטיפול של ממיסים אורגניים וחומצות והכנת הפתרון הם להתבצע במנדף. תלבש משקפי מגן, כפפות וביגוד מגן.

  1. לשטוף עם CH 3 OH ולייבש כמה צלוחיות זכוכית (4 מ"ל) צינורות פוליפרופילן (15 מ"ל).
  2. הכן 10 מ"ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל ידי ערבוב 9.8 מ"ל H 2 O עם 200 μl CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication.
  3. הכן 10 מ"ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל על ידי ערבוב 5 מ"ל H 2 </ sub> O עם 5 מ"ל CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication.
  4. הכן 4 מ"ל של תמיסה מימית acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ"ל H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בבקבוקון זכוכית 4 מ"ל; ומערבבים על ידי sonication.
  5. הכן 4 מ"ל של פתרון אורגני acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ"ל H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; ומערבבים על ידי sonication.
  6. לשקול 16 מ"ג NH 4 HCO 3 עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; להוסיף 4 מ"ל של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) פתרון ולפזר על ידי sonication; הדבר גורם פתרון 50 מ"מימ של NH 4 HCO 3 (pH ~ 7.8) במאגר מימי.
  7. לשקול 5 מ"ג של חלבון סטנדרטי (למשל, אלבומין בסרום שור, המוגלובין α / β, ציטוכרום C, anhydrase פחמתית, α-2-HS-גליקופרוטאין, וכו ') עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; להוסיף שתייה DI 4 מ"לr ולפזר על ידי sonication; זה בדרך כלל תוצאות פתרון ריכוז גבוהה מיקרומטר-רמה.
  8. הכן 1 מ"ל פתרון חלבון (1-2 מיקרומטר) על ידי דילול פתרון ריכוז מיקרומטר ברמה גבוהה עם נפח מתאים של NH 4 HCO 3 (50 מ"מ) חיץ מימית; ומערבבים על ידי sonication.
  9. הכן את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על ידי המסת טריפסין 20 מיקרוגרם רצף כיתה ב 170 μl NH 4 HCO 3 (50 מ"מ) חיץ מימית; לפזר על ידי sonication.

3. הגדרת ניסוי

הערה: מערכת LTQ-MS מצויד מקור ESI שונה הכוללת XYZ שלבית מובנה הביתה המאפשר התממשקות של ספקטרומטר מסה לגישות קלט מדגם שונים.

  1. ניתקתי את microreactor הנימים מהאיגוד הצץ ולהתחבר טי הצץ.
  2. הכנס ~ 2 ס"מ חוט Pt בזרוע בצד של טי הצצה; להשתמש שרוול הצצה "1/32 למתןדליפה ללא חיבור עבור בידוד חוט Pt.
  3. חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ 'אורך) נימי מדגם העברה לקצה השני של טי הצצה; להשתמש שרוול 1/32 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
  4. אבטח את טי הצצה על הבמה-XYZ ומקם את מ"מ ESI פולט ~ 2 הרחק נימי מפרצון ספקטרומטר מסה.
  5. חבר את הכבל Pt למקור אספקת החשמל ESI של ספקטרומטר מסה.
  6. חבר את הקצה השני של נימי העברת מדגם לאיחוד נירוסטה; להשתמש שרוול 1/16 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
  7. חבר צינורות PTFE 1/16 "4-5 ס"מ עד הסוף השני של האיחוד נירוסטה להכניס את המחט במזרק 250 μl בצינור PTFE; להפעיל את המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה לפי השווי הרצוי (למשל, 2 μl / min).
  8. פרמטרי רכישת נתוני הקלט טנדם MS לתוך חבילת התוכנה שולטת מכשיר MSd לשמור כקובץ שיטה ולהכין את ההתקנה לביצוע הניתוח; עבור מערכת LTQ-MS, השתמש בפרמטרי ניתוח הנתונים התלויים הבאים: הדרה דינמית הופעל עבור 180 שניות עם רוחב המוני הדרת ± 1.5 מ '/ z; אחד MS סריקה ואחריו זום אחד ו- MS 2 סריקות על 5 הפסגות האינטנסיביות ביותר העליונות, זום רוחב סריקת ± 5 מ '/ z; דיסוציאציה התנגשות מושרה (CID) פרמטרים שנקבעו ברוחב בידוד 3 מ '/ z, אנרגית התנגשות מנורמלת 35%, ש הפעלת 0.25, וזמן הפעלה של 30 מילים-שניות.

4. הגדרת Microfluidic

  1. כן מכשיר microfluidic זכוכית או מצעים פולימריים; 16-18 הפריסה של המכשיר מסופקת 2A איור, מורכב microreactor (1) (אורך רוחב 0.13 מ"מ x 2 מ"מ x 50 מיקרומטר עמוקים) מחוברים כניסה (2 ), מוצא (3) וכן יציאה בצד (4); ערוצי מקשרות מניפולציות fluidic הם ~110 מיקרומטר רחב ו ~ 50 מיקרומטר עמוק; מבנה רב (5), מורכב ~ 1.5-2 מיקרומטר עמוק x 10 מיקרומטר x הרחב 100 מיקרומטר microchannels הארוך להציב 25 מיקרומטר בנפרד, יפעל כמסנן עבור שמירה על חלקיקי microreactor.
  2. הפעל חיבורים נוזלים למסירת השבב על ידי הדבקת מחברים מיוחדים ליציאות המפרצון, או על ידי המצאת עמדת פולימריים המתאימה אבזרים למסירת נוזל (איור 2 ב). 16
  3. הכינו תרחיף של חלקיקים C18 (5 מיקרומטר) כמתואר בשלב 1.8; לספק את התערובת הדלילה אל microreactor עם מזרק באמצעות צינורות 1/16 "PTFE המחובר ליציאת שבב הצד (4); לאטום את הנמל לאחר טעינת חלקיק עם דבק אפוקסי תרופה עבור שעה 1 בתנור ב 90 ºC 16.
  4. הכנס נימי (20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD x 10 מ"מ אורך) בנמל לשקע, חותם עם דבק E6000, ולתת תרופה O / N; זה יהפוך את פולט ESI ( 6).
  5. חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ 'אורך) נימי מדגם העברה לנמל כניסת שבב (2); חבר את הקצה השני של נימי מזרק μl 250 ואת משאבת מזרק, כמתואר 3.6-3.7.
  6. מניח מחבר הצצה טי קל משקל על קו העברת מדגם קצר לפני יציאת הכניסה (2) והכניס תיל Pt על הזרוע בצד של טי, כמתואר 3.2; זה יהיה האלקטרודה ESI.
  7. אבטח את המכשיר microfluidic על הבמה XYZ עם פולט ESI ממוצבת ~ 2 מ"מ מן נימי מפרצון ספקטרומטר מסה; להכין את MS לניתוח כמתואר 3.8.

5. טוען לדוגמא, פרוטאוליטים עיכול Elution עבור ניתוח MS

הערה: כל השלבים העברה פתרון / מדגם מבוצעים בעזרת משאבת מזרק וצריך לאפשר לכמה דקות נוספות כדי להשלים, כדי לפצות על-volum מתes הקשורים קווי העברה ומן microreactor; את הזמן הדרוש יהיה תלוי את הספיקות מעורבות.

  1. שוטפים את microreactor ולהכינו ניתוח על ידי יציקת בתמיסה מימית של NH 4 HCO 3 (50 מ"מ) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
  2. טענו מדגם החלבון (1 מיקרומטר) על microreactor ידי יציקת הפתרון המדגם ב 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
  3. להשרות את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על חלבון adsorbed על microreactor ב 2 μl / דקה במשך 1-3 דקות.
  4. להרוות את תהליך העיכול פרוטאוליטים על ידי שטיפת microreactor עם בתמיסה מימית acidified של TFA (0.01% v / v) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
  5. התחל משחררי החלבון לעכל מן microreactor על ידי יציקת פתרון אורגני acidified של TFA (0.01%v / v) H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) ב 300 NL / min.
  6. הפעל את תהליך רכישת נתונים MS ואת מתח ESI (~ 2,000 V); לרכוש נתונים MS באמצעות הפרמטרים רכישת נתונים הניתנים בשלב 3.8; להתבונן elution של פפטידים tryptic.

6. עיבוד נתונים

  1. לעבד את הנתונים MS טנדם עם מנוע חיפוש תואם לפורמט נתונים MS גלם.
    1. לעבד את קבצי גלם LTQ-MS באמצעות אורגניזם ספציפי מינימאלי מסד נתוני חלבון מיותר; להעלות את הנתונים הגולמיים של מנוע החיפוש, להגדיר את העמידות המוני הורה שבר יון ל Da 2 ו -1, בהתאמה, ולהשתמש רק שברי tryptic מלא עם עד שני החמיץ שסעים עבור החיפוש; אינו מאפשר שינויי posttranslational; להגדיר את שיעורי גילוי הגבוהים וביטחון בינוני שווא (FDR) עד 1% ו -3%, בהתאמה, אינו מאפשר שינויי posttranslational.
  2. לסנן את הנתונים כדי לבחור ברמת ודאות גבוהה רקפפטיד תואם את החלבונים המופיע במאגר; להעריך את תוצאות חלבון פפטיד-רמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאת נציג של תהליך עיכול פרוטאוליטים בצעה בו זמנית על תערובת של חלבונים, עם microreactors המתואר לעיל (איורי 1 או 2), מופיע בלוח 1. הטבלה כוללת רצף הפפטידים הייחודי לזהות חלבון מסוים, הצלב מתאם ציון (Xcorr) (כלומר, ציון המאפיין את איכות המשחק הניסיון אל התיאורטי הספקטרום ההמוני טנדם המקביל), מספר שסעים החמיצו, על המדינה לגבות פפטיד (z), ואת המסה / תשלום ( מ '/ z) של פפטידים protonated. ברמת החלבון, השולחן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microreactor המתואר בעבודה זו מספק קל ליישם התקנה ניסיונית לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים כדי לאפשר ניתוח MS והזדהות תוך פחות מ -30 דקות. היתרונות הברורים של מערכת זו, בהשוואת גישות קונבנציונליות, כוללים פשטות, מהירות, צריכת מגיב נמוכה ועלויות נמוכות. בפרט, אין צורך חרוזי מחסניות טריפסין משותקים יקרים. הכנת microreactor הנימים היא פשוט (איור 1 א), והוא יכול להיות מושלם בתוך דקות מחומרים סטנדרטיים, נפוצים במעבדה כרומטוגרפיה. בעוד חלקיקים C18 שלב התהפכה ניתן לשטוף ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF/DBI-1255991 ל-IML.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלכודת יונים ESI-MSThermo ElectronLTQספקטרומטר המסה LTQ משמש לרכישת נתוני MS
טנדם שלב XYZניופורטחלקים מרוביםשלב ה-XYZ הביתי משמש להתאמת מקור הננו-ESI המסחרי LTQ לקבלת קלט ממערכות אספקת דגימות שונות
מיקרוסקופ סטריאואופטיקה אדמונדG81-278המיקרוסקופ משמש לצפייה בתהליך אריזת המיקרו-כור
איזון אנליטי / MetlerVWR46600-204האיזון משמש לשקילת דגימות החלבון
אמבט אולטרסאונד / ברנסוןVWR33995-540האמבטיה הקולית משמשת לערבוב / הומוגניזציה של הדגימות ופיזור משאבת המזרק של חלקיקי C18
22מכשירי הרווארד552222המיקרו-משאבה משמשת להעמסה, שטיפה והוצאת הדגימה והאנזים על ומהמיקרו-כור הנימי הארוז
מערכת המים האולטרה-טהוריםMilli-Q EMD MilliporeZD5311595 מערכת המים MilliQ משמשת להכנת מי DI מטוהרים
פיפטור/אפנדורף (1,000  ומיקרו; l)VWR53513-410הפיפטור משמש למדידת כמויות קטנות של תמיסות מדגם
Pipettor/Eppendorf (100  ומיקרו; l)VWR53513-406הפיפטור משמש למדידת נפחים קטנים של תמיסות מדגם
Pipettor/Eppendorf (10  ומיקרו; l)VWR53513-402הפיפטור משמש למדידת כמויות קטנות של תמיסות דגימה
נימי סיליקה התמזגו (100 ומיקרו; מזהה m x 360 ומיקרו; m OD)Polymicro TechnologiesTSP100375נימי זה משמש לייצור
נימי סיליקה התמזגו במיקרו-ריאקטור (20  ומיקרו; מזהה m x 100 ומיקרו; m OD)Polymicro TechnologiesTSP020090נימי זה משמש לייצור
נימי סיליקה התמזגו של פולט ESI (50  ומיקרו; מזהה m x 360 ומיקרו; m OD)Polymicro TechnologiesTSP050375נימי זה משמש להעברת הדגימות והחומר הנוזל ממשאבת המזרק למיקרו-כור הנימים
סכין נימיזכוכית Supelco23740-Uזהו כלי לחיתוך נימי סיליקה התמזגו באורך הרצוי
GlueEclectic ProductsE6000 Craftדבק זה משמש לאבטחת פולט ה-ESI לתוך המיקרו-כור הנימי או השבב המיקרופלואידי,
דבק אפוקסיEpo-Tek353NDTדבק זה משמש לאיטום חור הכניסה המיקרופלואידית שדרכו נטענים חלקיקי C18
שלב הפוך C18 חלקיקים (5  ומיקרו; m)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18אלו הם חלקיקי C18 שעליהם נספגים החלבונים; החלקיקים הופקו מ-4  מ"מ x 20 ס"מ עמוד C18 LC מבית Agilent
מזרק/זכוכית (250 ומיקרו; l)המילטון81130-1725RNמזרקי הזכוכית משמשים להעמסת תמיסת החלקיקים C18 במיקרו-כור הנימים ולהעברת הדגימה והחומרים למיקרו-כור
הפחתה פנימית PEEK Union (1/16 אינץ' עד 1/32 אינץ')ValcoZRU1.5FPKאיחוד זה משמש לחיבור 250 ומיקרו; l מזרק למיקרו-כור לטעינת ה-5 והמיקרו; m חלקיקים slurry
איחוד נירוסטה (1/16 אינץ')ValcoZU1XCאיחוד הנירוסטה משמש לחיבור מחט מזרק הזכוכית למחבר טי נימי עירוי
Microvolume PEEK (1/32 אינץ')ValcoMT.5XCPKטי ההצצה משמש לחיבור נימי העברת הדגימה למיקרו-כור הנימים; על זרועו הצדדית, הוא מאפשר הכנסת מחבר טי חוט Pt
(משקל קל)ValcoC-NTXFPKמחבר טי זה משמש להפעלת מתח ESI על השבב המיקרופלואידי דרך חוט העברת הדגימה
Pt (0.404 מ"מ)VWR66260-126חוט ה-Pt מספק חיבור חשמלי לייצור ESI ומחובר לספקטרומטר המסה ESI ספק כוח
צינורות PTFE (1/16 אינץ' OD)ValcoTTF115-10FTצינורות הטפלון משמשים כדי לאפשר חיבור אטום בין מחט המזרק לאיחוד הנירוסטה 
צינורות הצצה (0.015 אינץ' מזהה x 1/16 אינץ' OD)Upchurch Scientific1565צינורות ההצצה משמשים כשרוול כדי לאפשר חיבור אטום בין איחוד הנירוסטה ל-50  ומיקרו; צינורות PEEK נימיים להעברת מזהה m
0.015 אינץ' מזהה x 1/32 אינץ' OD)ValcoTPK.515-25צינורות ההצצה משמשים כשרוול כדי לאפשר חיבור ללא דליפות בין נימי הסיליקה הממוזגים לבין
חותך צינורות הפולימרValcoJR-797חותך זה משמש לחיתוך מראש של 1/16 אינץ' ו-1/32 אינץ' צינורות פולימר הצצה המשמשים כשרוול לחיבורים ללא דליפות בחתיכות באורך ~4-5 ס"מ
בקבוקון ענבר (2 מ"ל)Agilent HP-5183-2069הבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות לדוגמה ותמיסת החלקיקים C18 
בקבוקון ענבר (4 מ"ל)VWR66011-948הבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות לדוגמא
שפופרת פוליפרופילן (15  מ"ל)פישר12-565-286Dהבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות חיץ
צילינדר (100 מ"ל)VWR24710-463הגליל משמש למדידת נפחי ממס
צילינדר (10 מ"ל)VWR24710-441הגליל משמש למדידת נפחים של
קצות פיפטה ממס (1,000 ומיקרו; l)VWR83007-386קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות לדוגמא
קצות פיפטה (100 ומיקרו; l)VWR53503-781קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות לדוגמה
קצות פיפטה (10 ומיקרו; l)VWR53511-681קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות מדגם
מצעי זכוכיתננופילםB270, 3 אינץ' x 3 אינץ'מדובר במצעי זכוכית לייצור שבבים
התאמת אגוז זכר (1/16 אינץ')UpchurchP203Xאביזר זה משמש לחיבור נימי העברה לשבב המיקרופלואידי,
מכלול ננו-פורטUpchurchN-122Hאביזר זה משמש לחיבור נימי העברה לשבב המיקרופלואידי
, תקני חלבוןסיגמאמרובה #
אצטוניטריל, HPLC כיתהפישרA955
מתנול, כיתהHPLCפישרA452
חומצה טריפלואורואצטיתSigma
אמוניום ביקרבונטAldrichA6141
טריפסין, דרגת ריצוףPromegaV5111
( Peek Tee Clean-cut כתר לבן איזופרופנול, בדרגת HPLC 650447 חומצה טריפלואורואצטית Sigma 302031

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Enzymatic DigestionFlow through MicroreactorProtein DigestionTrypsin SolutionC18 ParticlesMass SpectrometryCapillary ColumnElectrospray IonizationPeptide ElutionSample Analysis

מאמרים קשורים