מאמר שיטה

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

DOI:

10.3791/53570

⸱

1 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מומים מולדים המערבות קליפת המוח – המכונה גם מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD) — הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של אפילפסיה עמידים לתרופות בילדות. הדמיה מוחית ברזולוציה גבוהה הנחתה ויוו זיהוי של קבוצה גדולה של פנוטיפים MCD. למרות ההתקדמות הדמיה מוחית, אנליזה גנומית, דור של מודלים בעלי חיים, זרימת עבודה פשוטה כדי לקבוע עדיפויות באופן שיטתי של המועמד גנים, כדי לבדוק את ההשפעות פונקציונלי של מוטציות בשם חסר. כדי להתגבר על בעיה זו, אסטרטגיית ניסיוני המאפשרים הזיהוי של הרומן גנים סיבתי עבור MCD פיתח, לאמת. אסטרטגיה זו מבוסס על זיהוי אזורים גנומית המועמד או גנים באמצעות מערך-CGH או כל-exome רצף ואפיון את ההשפעות של איון שלהם או של ביטוי של מוטציות ספציפיות בפיתוח המוח מכרסמים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה. גישה זו הובילה הזיהוי של הגן C6orf70 , קידוד עבור חלבון בשם vesicular, בפתוגנזה של הטרוטופיה קשרי periventricular, MCD הנגרמת על ידי הגירה העצבית פגומה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קליפת המוח ממלא תפקיד מרכזי בתהליכי קוגניטיבית ואינטלקטואלית, ומעורב שליטה רגשית כמו גם בלמידה ובזיכרון. לכן זה לא מפתיע כי מחלות והפרעות פסיכיאטריות רבות תוצאה של מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD). האטיולוגיה של MCD מורכבים מאז רכשה, מעורבים גורמים גנטיים. השכיחות המצטברת של שיעור נקבע גנטית MCD היא כ- 2% והם סדיר ברוב המקרים. למשל, השכיחות של מוח מולדים dysgenesis נאמד להיות גבוה מ- 1% באוכלוסייה האנושית ולאחר כמה צורות של MCD הם נצפו יותר מ 14% של כל חולי אפילפסיה ו- 40% של אפילפסיה חמורה או סורר1, 2.

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) הוא אחד MCDs הנפוצה ביותר והיא נגרמת על ידי העברה חריגה של נוירונים מאזור חדרית (VZ) אל קליפת המוח המתפתח. הכשל של נוירונים להעברת תוצאות אשכולות של נוירונים הטרוטופי לאורך קירות החדרים הצדדיים אשר בדרך כלל ניתן לאבחן באמצעות תהודה מגנטית (MRI). המאפיינים הקליניים, אנטומי, הדמיה של PNH הם הטרוגנית. גושים עשויים לנוע בין קטן ולא חד-צדדי דו צדדיות ולא סימטרי. Sequelae קליניים נפוצים כוללים לקויות אפילפסיה אינטלקטואלי3. מוטציות בגן Filamin A (או FLNA), אשר מפות ב Xq28, נמצאו ב- 100% מהמשפחות עם X-linked PNH הדו-צדדיים וב -26% של חולים סדיר3,4. צורה נדירה, רצסיבי של PNH נגרמת על ידי מוטציות בגן ARFGEF2 , אשר מפות ב- 20q13, דווח בשתי משפחות consanguineous5. לאחרונה, biallelic מוטציות בגנים קידוד הזוג קדהרין קולטן-ליגנד DCHS1 ו- FAT4 זוהו ב תשעה חולים מושפע על ידי הפרעה multisystemic הכולל PNH6. PNH הייתה קשורה גם שביר X תסמונת7, תסמונת וויליאמס8, תסמונת microdeletion 22q119, כפילויות ב 15 p 510, מחיקות-1 p 3611, 5q14.3-q1512, p 6 2513 6q מחיקה מסוף תסמונת14,15,16,17,18,19, רומז כי גנים סיבתי נוספים פזורים ברחבי הגנום. עם זאת, כ- 74% מהחולים PNH סדיר בסיס גנטי נשאר עד מבואר17.

מיפוי גנים קלאסית גישות כמו מערך הכלאה גנומית השוואתית (מערך-CGH) הוכיחו להיות כלים רבי-עוצמה הגילוי של תת-מיקרוסקופיים העיוותים כרומוזומלית, אולם האזורים גנומית מזוהה באמצעות גישה זו הם לעיתים קרובות גדולים מכילים גנים רבים.

כניסתו של רצף מקביל מסיבית טכניקות (כלומר רצף שלם-Exome (ווס) ואת כל הגנום רצפי (WGS)) הפחיתה באופן משמעותי הן את העלות והן את הזמן הנדרש כדי רצף של exome האנושי כולו או גנום. יחד עם זאת, הפרשנות של ווס ונתונים WGS נותר מאתגר ברוב המכריע של המקרים, מאז עבור כל גרסאות החולה עשרות עד מאות (או אפילו אלפים, תלוי מתוך הסוג של ניתוח) מגיחים סינון נתונים.

כדי להאיץ את התהליך של זיהוי הרומן גנים סיבתי של MCD, אסטרטגיה שיטתית חדשניים המשלבים CGH מערך, ווס, בתוך הרחם ההקרנה אלקטרופורציה (הצמיגים) של המועמד גנים תוכנן. . הצמיגים מאפשר להשבית באופן סלקטיבי (או overexpress) גנים ספציפיים או מוטציות במוח מכרסמים, ראפיד הערכה מעורבותן18,corticogenesis19. RNAi בתיווך מצרי-נוקאאוט או ביטוי של גנים מועמד אחד או יותר צפוי לגרום, כאשר הגן מזוהה עם התפתחות המחלה, פגמים מקומי הגירה העצבית ו/או התבגרות. על זיהוי גנים של מי איון (או ביטוי) מתרבה על פנוטיפ אצל חולים בחולדות, הוא הופך להיות מועמד מצטיינים להקרנה בחולים סדיר עם MCD. באמצעות גישה זו, אנחנו חשפה לאחרונה את התרומה מכריע של הגן C6orf70 (הידוע גם בשם ERMARD) ב- PNH פתוגנזה בחולים יקולל מחיקות כרומוזומלית 6q2716.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתיקה במשפט: חולדות Wistar היו הזדווגו ומתוחזק בשימוש במתקני בעלי חיים INMED, מסכים עם החקיקה באיחוד האירופי וצרפתית.

1. DNA החילוץ, כימות מערך-CGH, ווס

  1. תמצית הדנ א (gDNA) של דם אנושי לויקוציטים מחולים באמצעות רובוט אוטומטי של בידוד דנ א או זמינים מסחרית ערכות חילוץ ידני הדנ א על פי הפרוטוקול של היצרן. לכמת כל דוגמאות שימוש ספקטרופוטומטרים.

2. מערך-CGH פרוטוקול

  1. עיכול הגבלה של gDNA
    1. כפול תקציר 500 ננוגרם של מטוהרים gDNA חולה, פקד האנושי זמינים מסחרית DNA עם RsaI ו- AluI עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש μl 0.5 של האנזים U/μL 10 עבור כל תגובה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 65 ° C בטל האנזימים ולעבור הצינורות דגימת קרח.
  2. Labelling מדגם
    1. להוסיף נפח מתאים של תחל אקראי הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש כדי כל שפופרת התגובה (למשל 5 µl עבור מיקרו-מערכים 1-pack 2-pack, רביעיית). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות.
    2. להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי. דגירה 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. להכין cyanine 3 ואחת אחת cyanine 5 Labelling מיקס מאסטר על הקרח על ידי ערבוב אמצעי האחסון הבאים: 10.0 µl 5 X תגובת מאגר, x dNTPs µl 10 5.0, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP או Cyanine 5-dUTP, µl 1.0 Exo (-) Klenow האנזים, µl 2.0 נוקלאז ללא מים. בחר את הנפח של כל מגיב על פי התבנית microarray בשימוש.
    4. להוסיף את תערובת מאסטר Labelling כל שפופרת התגובה המכיל את gDNA. מערבבים היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
    5. להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לשמור את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.
  3. טיהור של gDNA עם תוויות ברורות
    1. להוסיף µl 430 של טה 1 x (pH 8.0) כל שפופרת התגובה.
    2. למקם את עמודת טיהור צינורות אוסף 2 מ"ל, תוויות העמודות כראוי. לטעון את כל gDNA עם תוויות ברורות על עמודה טיהור.
    3. צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך ולמקם את העמודה בחזרה בצינור אוסף 2 מ"ל.
    4. להוסיף µL 480 1 x TE (pH 8.0) של כל אחת מהעמודות. צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך.
    5. היפוך העמודה לתוך טריים mL 2 אוסף שפופרת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 1000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר כדי לאסוף דגימת מטוהרים.
    6. להביא את אמצעי האחסון מדגם ביקש עבור התבנית microarray בשימוש באמצעות רכז או הוספת x 1 TE (pH 8.0). לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להביא את אמצעי האחסון ל- 80.5 µL. דגירה המדגם על קרח למשך 5 דקות, ואז pipette את הפתרון לכל אורך 10 פעמים.
  4. הכנת gDNA עם תוויות ברורות של הכלאה
    1. לשלב דוגמאות בדיקה ועיון באמצעות cyanine המתאים התווית על-ידי 5 מדגם cyanine התווית על-ידי 3 מדגם צינור טריים mL 1.5 ללא RNase. לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להבטיח כי אמצעי האחסון הסופי הוא 158 µL. בחר את הנפח של כל דגימה על פי התבנית microarray בשימוש.
    2. להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד תפוקה, מידת פעילות labelling או ספציפי על-ידי מדידת את ספיגת A260 ננומטר (DNA), A550 nm (cyanine 3), וכן A650 nm (cyanine 5).
      1. חישוב תשואה תוך שימוש בנוסחה: [DNA concentration(ng/µl) x נפח דגימה (µl)] / 1,000 (ng/µg). לחשב את פעילות ספציפית באמצעות הנוסחה: pmol לכל µl של צבע/µg לכל µl של gDNA.
        הערה: לדוגמה, עבור µg 0.5 של קלט ה-DNA, התשואה צריכה להיות µg 8 עד 11, פעילות ספציפית (pmol/µg) אמור להיות 25 עד 40 עבור Cyanine-3 מתויג ולדגום 20 עד 35 עבור המדגם שכותרתה Cyanine-5.
    3. כדי להכין את הכמות של מיקס מאסטר הכלאה הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש, לערבב את ריאגנטים הבאים: 50 µL מתקפלת-1 DNA (1.0 mg/ml), 52 µL 10-aCGH הסוכן חסימת ו- 260 µl 2 x מאגר הכלאה HI-סל ד.
    4. להוסיף נפח מתאים של המיקס הכלאה מאסטר הצינור ml 1.5 ללא RNase המכיל את gDNA עם תוויות ברורות כדי להשיג את הנפח הכולל הנדרש עבור התבנית microarray בשימוש. לדוגמה, עבור microarray 1 pack, ודא שעוצמת הסופי עבור כל תגובה 362 µl.
    5. לערבב את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז במהירות צנטריפוגה ב 14,000 x g, תקופת דגירה של 3 דקות ב 95 ° C ו- 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. הכלאה והאסיפה צ'יימברס
    1. לטעון שקופית אטם נקי לתוך הבסיס קאמרית עם אטם את התווית פונה כלפי מעלה, מיושר עם המקטע מלבני של הבסיס קאמרית. ודא כי השקופית אטם מיושר עם הבסיס קאמרית אינה פתוחה.
    2. לוותר על התערובת מדגם הכלאה על הבאר gasket, מוודא כי המדגם מופץ בצורה אחידה.
    3. . תניח שקופית microarray על גבי השקופית אטם הערכת הכריך-הזוג מיושר כראוי לאחר מכן, להרכיב את התא התגובה לשים המכסה על השקופיות sandwiched על יד-הידוק המלחציים.
    4. ודא שקופיות משתין על-ידי סיבוב תא שהורכב אנכית. ודא כי בועות אינם נוכחים בבית הבליעה. במקרה הצורך, הקש על מכלול על משטח קשה להזיז את בועות נייח.
    5. הכניסו הצ'יימברס שקופית שהורכב מתלה מסובב להגדיר כדי לסובב במהירות של סל ד 20. לשים את התא הכלאה בתנור, לבצע הכלאה ב 65 ° C h 24 או 40 על פי התבנית microarray בשימוש.
  6. כביסה Microarray וסריקה
    1. להוציא הכלאה קאמרית תנור ויציפו אותה במאגר שטיפת 1. המשך פירוק שלה.
    2. הסר את השקופית microarray, להכניס את זה לתוך ארון שקופית במאגר שטיפת 1 בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את השקופית מערך עבור חמש דקות עם ערבוב (להשתמש הפשפשים ו של פגים). כוון את מהירות קדירות להגדרה של 4 (מהירות בינונית), כדי לקבל טוב אבל לא יותר מדי נמרצת ערבוב.
    4. לשטוף את השקופית מערך במאגר לשטוף 2 עבור ערבוב s 90. בעדינות להתאושש השקופית המאגר (זה אמור לצאת יבש) לטעון אותו לתוך מחזיק שקופיות בסיועם של מגן שקופיות.
    5. לטעון את השקופית לתוך הסורק מערך ולבצע סריקה לפי הוראות היצרן מערך.
    6. לנתח את התוצאות תוך שימוש השזורות בתוכנת מסופק עם הסורק בשימוש על פי הוראות היצרן (V.9.1.3.1).

3. ווס פרוטוקול

  1. היעד העשרה
    1. להשתמש את dsDNA BR Assay כדי לקבוע הריכוז של הדגימה gDNA לפי הפרוטוקול כלי נגינה.
    2. לדלל 5 µg באיכות גבוהה כפולה גדיל DNA עם 1 x נמוך טה מאגר של צינור bind נמוך 1.5 mL הנפח הכולל של 50 µL.
    3. להגדיר את sonicator ושם microtube של תחנת טעינה ופריקה של-פי הוראות היצרן. תסתום את הפה ברכבת התחתית
    4. לאט לאט להעביר את דגימת דנ א 50 µl דרך septa מראש לפצל ללא היכרות עם בועות.
    5. הטיית ה-DNA בהתאם להגדרות הציע מיצרן של sonicator והערכת איכות שימוש של Bioanalyzer על פי הוראות היצרן. המטרה גודל מקטע ה-DNA היא 150-200 bp.
  2. תיקון ה-DNA מסתיים
    1. להכין את תערובת התגובה סוף תיקון על ידי ערבוב µL 40 של סיום תיקון אנזים לערבב עם µL 10 של סיום תיקון Oligo מיקס. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
    2. דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בהצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק אותם ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
    3. הוסף µL 50 של המיקס התגובה תיקון סוף מוכן בשלב 3.2.1 על כל µL 50 לכסנתם דנ א. טוב. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
    4. לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
  3. פוליאדנילציה של 3' מסתיים.
    1. הוסף 20 µl של מיקס מאסטר dA-עוקב כל סוף תוקן, מטוהרים דנ א (כ-20 µL).
    2. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
    3. דגירה הדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק את זה ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
  4. מצדו של מתאם יצירת אינדקס לכידת מראש.
    1. להוסיף 5 µL של מיקס מאסטר מצדו כל דגימת דנ א-זנב.
    2. להוסיף 5 µL של הפתרון המתאים של אינדקס לכידת קדם כל דגימה.
    3. חותם הבארות, לערבב ביסודיות על ידי vortexing על 5 ס' בקצרה צנטריפוגה הדגימות.
    4. דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
    5. לטהר את הדגימות עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
  5. הגברה של הספרייה באינדקס.
    1. הכן האחסון המתאים של לכידת קדם PCR התגובה מיקס על ידי ערבוב µL 1 של פריימר מיקס 25 µL של מיקס מאסטר PCR. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
    2. לשלב µL 26 של תערובת הגברה בבארות נפרדים של צלחת PCR µL 24 של כל מדגם ספריית gDNA באינדקס.
    3. הפעלת תוכנית ה-PCR עם השלבים הבאים: 98 ° C למשך 2 דקות, 5 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 10 דקות להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
    4. לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
    5. להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
  6. איגום של אינדקס דגימות די אן איי של הכלאה
    1. בכל בריכה התגובה לכידת, לשלב את עוצמת הקול המתאים של כל מדגם ספריה באינדקס gDNA היטב אחד של צלחת PCR. לדוגמה, עבור האדם או ספריות ללכוד אקסון-כל של העכבר, לשלב 8 ספריות לכל בריכה באמצעות 187.5 ng של כל ספריה באינדקס. להבטיח כי בכל בריכה התגובה לכידת הסופית מכילה 1,500 ng של gDNA באינדקס.
    2. להפחית את נפח בכל טוב ל < µL 7 באמצעות רכז ואקום. להימנע לחלוטין ייבוש המדגם.
    3. להוסיף מים נטולי נוקלאז מספיק בכל בריכה gDNA מרוכז כדי להביא עוצמת הקול הסופי טוב µL 7 ואז מערבולת לצלחת המכילה gDNA נמרצות עבור צנטריפוגה ס' 30 ב ספינר צנטריפוגה או בצלחת מיני כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הבארות.
  7. הכלאה של gDNA בריכות הספרייה לספרייה ללכוד
    1. לבריכת gDNA כל µL 7 אינדקס ', להוסיף µl 9 של חסימת מיקס. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    2. קאפ הבארות, להעביר את הצלחת אטום המכיל gDNA כדי הצנטרפוגה תרמי, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז תחזיק על 65 ° C. ודא כי הצלחת מוחזקת 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
    3. להכין דילול המתאים RNase בלוק, על בסיס גודל הספרייה הלכידה (10% דילול עבור ספריות < 3.0 מגה-בתים ו- 25% דילול עבור ספריות > 3.0 Mb).
    4. על-פי גודל הספרייה ללכוד, לשלב את הכמות הנכונה של ספריית ללכוד ו לדלל RNase בלוק פתרון בצלחת PCR שמרה על קרח. מערבבים היטב בעזרת pipetting. עבור לכידת ספריות < 3.0 מגה, שימוש 2 µl של ספריית ו µL 5 של גוש RNase ב 10% דילול. עבור לכידת ספריות > מגה 3.0, שימוש 5 µl של ספריית ו- 2 µl של גוש RNase ב 25% דילול.
    5. להוסיף µL 37 הכלאה מאגר כל טוב המכיל 7 µL של לכידת בלוק ספריה/RNase מיקס. מערבבים היטב בעזרת pipetting, בקצרה centrifuge לצלחת המכילה את המיקס.
    6. לשמור על הלוח בריכת gDNA ב 65 ° C תוך שימוש פיפטה רב ערוצית כדי להעביר את µL 44 כל תערובת ספריית ללכוד צעד 3.7.5 כל מדגם טוב של צלחת הבריכה gDNA. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 8-10 פעמים.
    7. חותם הבארות עם רצועת כיפה כיפות. ודא כי כל בארות אטומות לחלוטין. מניחים מזרון דחיסה יניף PCR ב הצנטרפוגה תרמי.
    8. דגירה התערובת הכלאה במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס. הערה: דגימות ייתכן שהוכלא על עד 72 שעות, אך עליך לוודא כי הכלאה מורחב אינו גורם אידוי נרחב ב הבארות מדגם.
  8. הכנת beads מגנטי מצופה streptavidin
    1. Prewarm מאגר לשטוף 2 ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש טורקי או חום המים.
    2. Resuspend נמרצות את החרוזים מגנטי Streptavidin על מערבל מערבולת. החרוזים מגנטי להתיישב במהלך האחסון.
    3. עבור כל דגימה הכלאה, להוסיף 50 µL של חרוזים resuspended בארות של צלחת PCR.
    4. לשטוף את החרוזים, resuspend אותם ב- 200 µL מאגר מחייב.
  9. ללכוד את ה-dna hybridized באמצעות streptavidin חרוזים.
    1. מעריכים ולהקליט את עוצמת הקול של פתרון הכלאה שנשאר אחרי הדגירה 24 שעות ביממה.
    2. לשמור על הצלחת הכלאה ב 65 ° C, שימוש פיפטה רב-ערוצי כדי להעביר את אמצעי האחסון כולו (כ-60 µL) כל התערובת הכלאה הבארות צלחת המכיל 200 µL של streptavidin שטף חרוזים. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 3 עד 5 פעמים.
    3. קאפ הבארות, דגירה את הצלחת הלכידה Nutator מיקסר או שווה ערך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ודא כי הדגימות הם ערבוב כראוי בתוך הבארות.
    4. Centrifuge בקצרה את הצלחת הלכידה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
    5. לשים את הצלחת הלכידה מפריד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים מההשעיה. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend את החרוזים ב 200 µL שטיפת מאגר 1. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עד החרוזים הם resuspended באופן מלא.
    7. בקצרה צנטריפוגה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
    8. לשים את הצלחת ההפרדה מגנטי.
    9. המתן פתרון ברור, ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  10. פוסט ללכוד מדגם עיבוד רצף מרובבת
    1. להכין את אמצעי האחסון המתאים של תערובת התגובה PCR על ידי ערבוב הבאות: מים נטולי נוקלאז µL 9, 25 µL מיקס מאסטר, 1 µL פריימר לערבב לפי מספר amplifications. מערבבים היטב בעזרת מערבל מערבולת ולשמור על קרח.
    2. עבור כל תגובה הגברה, מקום µL 35 של תערובת התגובה PCR מ שלב 3.10.1 הבארות של צלחת PCR.
    3. פיפטה כל של הדגימות בריכה ספריית שנתפסו מאוגד-חרוז למעלה ולמטה כדי להבטיח כי ההשעיה חרוז הומוגנית.
    4. להוסיף 15 µL של כל ספריית שנתפסו בריכה חרוז השעיה לתערובת PCR התגובה המתאימה היטב. לערבב ביסודיות על ידי pipetting עד המתלה חרוז הוא הומוגני.
    5. למקם את הצלחת מוכן. למשל 3.10.2 ב הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל את התוכנית הבאה של הגברה PCR: 98 ° C למשך 2 דקות, 8 עד 11 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C עבור s 30 ו-72 מעלות עבור 1 דקות, ולאחריה סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות. להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
    6. לטהר מדגם בטהרה חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
    7. להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
  11. מוכנות דגימות מרובב רצף
    הערה: הדגימות מועשר הסופי להכיל בריכות של ספריות אינדקס 8 או 16, של בהתבסס על גודל הספרייה ללכוד וכתוצאה לכידת מראש איגוד האסטרטגיה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד.
    1. לחשב את מספר אינדקסים שניתן לשלבם לכל ליין, בהתאם לקיבולת של הפלטפורמה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד. לדוגמה, בספריה v5 אקסון כל האדם, מומלץ רצף הנתונים לכל ספריה באינדקס הוא 4 Gb והוא מומלץ רצף הנתונים לכל לכידת טרום בריכה 32 ג'יגה-בתים (8-אינדקס בריכות).
  12. רצף של הספריות.
    1. לטעון את הספריות על פלטפורמת רצף הדור הבא של הבחירה ולבצע את הרצף לפעול בהתאם למפרטים כלי נגינה.
  13. ניתוח נתונים רצף exome.
    1. הפעל את הצינור התוכנה של בחירה עבור חיוג הבסיס. לדוגמה, השתמש Stampy כדי למפות קריאות20, להסרת כפילויות עם פיקארד (http://broadinstitute.github.io/picard/), לזהות נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים, ההוספה או המחיקה של בסיסים (indels) עם ברווזן21. לסנן גרסאות נרדף ואלו נצפו בתדר אלל < 5% ונתונים השוואה עם אלה של exomes הורים לזהות משתנים de novo .

4. פלסמיד DNA הכנה אלקטרופורציה בתוך הרחם

  1. עיצוב מספר RNAs סיכת ראש קצר (shRNAs) מיקוד או את רצף קידוד או את 3' UTR של גנים המועמד כפי שתואר לעיל22.
  2. כדי למנוע מהמטרה אפקטים מבחן ירידה לפרטים shRNAs על ידי חיפוש הפיצוץ מול מסדי נתונים תוך שימוש בשיטות הרגילות. הכללת shRNAs מציג יותר מ-50% משלימים את החסר עם גנים אחרים חולדה.
  3. שיבוט annealed oligonucleotides לתוך וקטור mU6-pro כפי שתואר לעיל23.
  4. לטהר פלסמיד DNA עם מקסי-הכנה לפי הנחיות היצרן ובצע ריכוז הסופי של µg 3/µL.
  5. Aliquot 20 µl של ה-DNA (0.5 מ"ג/מ"ל pCAGGS-GFP גם לבד או עם 1.5 מ"ג/מ"ל של shRNA לבנות) ולהוסיף 2 µL הצום גרין דיי (2 מ"ג/מ"ל) כדי לאפשר מעקב ויזואלי של הזריקה.

5. בתוך הרחם אלקטרופורציה

  1. הליך כירורגי
    1. עזים ומתנגד E15.5 בהריון חולדות נקבות (E0 מוגדר כהיום של אישור של הכנס הנרתיק זרע-חיוביים), באמצעות שילוב עם תערובת של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (0.1 ו- 0.01 מ"ג לכל הגוף משקל, בהתאמה), אשר ניתנת דרך בקרום הבטן זריקה עבור אינדוקציה הרדמה.
    2. ודא כי החיה הוא מורדם לחלוטין על ידי התבוננות היעלמותו של הבוהן קמצוץ רפלקס.
    3. גילוח הבטן התחתונה של החיה משתמשים בטלוויזיה כדי להסיר את הפרווה. לחטא את העור באמצעות קרצוף povidone יוד, אלכוהול 70%. החל וטרינר משחה על העיניים למניעת יובש בזמן תחת הרדמה.
    4. במקום החיה על מקור חום ושם תלוי סטרילי (עם חלון פתוח של 4-5 ס מ באמצע) על החתך. ללבוש מסכות, חלוק המעבדה, כובעים, כפפות כירורגי סטרילי. לשמור על עקרות עד הסוף של הניתוח.
    5. באמצעות מספריים חדות עושים חתך אנכי (2-2.5 ס מ) של העור לאורך האמצע בבטן סימטרית ולאחר מכן לבצע חתך של הקיר שריר מתחת לעור – גם של 2.5 ס מ — לאורך הקו האמצעי.
    6. בזהירות לחשוף אחד הרחם הקרן חלל הבטן. ירידה 37 ° C מראש ומחוממת רגיל תמיסת לחות את העוברים. לשמור על הרחם לח כל הזמן.
  2. הזרקה של DNA ו אלקטרופורציה
    1. בעדינות להחזיק אחד של הקרניים הרחם עם מלקחיים מחויג ודחף בזהירות אחד העובר לדופן הרחם. להחזיק את העובר ביד אחת ועם את תותב יד אחרים בקפידה נימים זכוכית 1 מ מ האמצע לתוך החדר הלטראלי השמאלי (2-3 מ מ עמוקה) ולהזריק כ 1 µL של ה-DNA עם ירוק מהר כדי לאפשר חזותי ניטור באמצעות הזרקה microinjector.
    2. ירידה נורמלית תמיסת מלח על פני 3 x 7 מ מ2 אלקטרודות. מניחים את האלקטרודה החיובית סטרילי בצד מוזרק (החדר הלטראלי השמאלי), סטרילי האלקטרודה השלילית על החדר הימני. לספק 5 פולסים חשמליים במרווחי זמן 950 ms עם דוושה שבשליטת רגל (לחייב 40 V עם electroporator קבל 4000 mF).
  3. Post הליכים אלקטרופורציה
    1. תחזיר את הקרניים הרחם אל חלל הבטן, להוסיף טיפות של תמיסת מלח רגיל חלל כדי לאפשר עוברי מוצבים באופן טבעי יותר, להביא בחשבון פוסט ניתוחית לאיבוד נוזלים.
    2. סגור הקיר שריר הבטן בתפרים נספגים כירורגי, ואז העור בעזרת תפר פשוטה-הפרענו.
    3. לשים את החולדה בחזרה לכלוב ונטר החיה עד שייצא החוצה מן ההרדמה.
    4. לניהול כאב לנהל הבופרנורפין (0.03 נקודות מ"ג/ק"ג) לבעל-החיים על-ידי זריקה תת עורית כל ה 8-12, עבור עד 48 שעות.

6. הכנת הדוגמא המוח

  1. שיטת קיבוע
    1. להקריב את החולדה בהריון 5 ימים לאחר הליך כירורגי באמצעות גז הרדמה (איזופלוריין) ואחריו תאמת צוואר הרחם מהירה.
    2. עושים חתך אנכי כדי לפתוח מחדש את חלל הבטן.
    3. לחשוף את הקרניים הרחם, להסיר את העוברים מן הרחם, לכרות אותם באמצעות מספריים חדות.
    4. מסירים את המוח עם מינימום נזק לרקמת: באמצעות מספריים חדות, עושים חתך קטן לאורך הצד האחורי (המוח הקטן) / ציר קדמי (נורות olfactive) של הראש כדי לחדור את העור ואת הגולגולת, ולאחר מכן שימוש זוג מלקחיים הקילוף הגולגולת כדי לחשוף המוח, להסיר אותו באמצעות מרית קטנה.
    5. לטבול המוח בין לילה ב 4 ° C ב- a 4% Paraformaldehyde 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS).
  2. המוח חלוקתה
    1. לשטוף את המוח ב- PBS 1 x 10 דקות.
    2. להטביע את המוח ב- 4% אגר פלסטיק והטבעה בתבניות.
      1. להכין 50 מ של 4% אגר ב- 1 x PBS הטבעה המוח העוברי 5. להבטיח את agarose מומס ב יותר מ 50 º C.
    3. לשמור על המוח ב- agarose כדי פולימריזציה במשך לפחות שעה ב 4 º C. להסיר את עודף agarose סביב המוח.
    4. הדבק את המוח ללוחית התחתונה vibratome, בכיוון הציר הקדמי/אחוריים של המוח הוא בניצב הלהב. המתן מספר דקות על הדבק לייבש מקום לצלחת עם המוח מודבק אל החדר vibratome.
    5. למלא את vibratome 1 x PBS. פורסים 100 מיקרומטר מקטעים עבה.
    6. העברת פרוסות המוח בשקופיות, להסיר עודפי נוזלים, להוסיף כמה טיפות של הרכבה בינונית, מקום של coverslip על המוח

7. קונאפוקלית הדמיה וניתוח כמותי

  1. תן את יבש הרכבה בינונית למשך הלילה לפני הדמיה. התמונה סעיפים 10 X במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
  2. באמצעות תוכנה לניתוח תמונה כמותית, המירו את התמונה בתא 8 סיביות, בחר אחד נציג GFP חיובי פלורסנט ולהגדיר באופן ידני את צורתו. לשם כך, לחץ על "הערכה" וצייר את הגבול של התא בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית. זה דרך הקוטר ואת עוצמת סף של התא נשמרות באופן אוטומטי על-ידי התוכנה.
  3. לחץ על "חיפוש תאים" כדי לאפשר את התוכנה להתאים לשפה transfected תאים בכל רחבי קליפת המוח. לאחר מכן, אם יש צורך, להסיר באופן ידני תוצאות חיוביות שגויות.
  4. לחלק כל עובי הקליפה 8 תחומי עניין מנורמל במקטעים בודדים. כדי להשיג זאת, לחץ על "אזור כלי", בחר 8 "אזור פסים" איפה הראשון (1) והאחרונה (8) פסים תואמים את VZ וכדי העליון של CP בהתאמה. לחץ על "החל" כדי לאפשר את התוכנה לספור את המיקום היחסי של GFP transfected תאים בקליפת שלם. ולבסוף ללחוץ על "שמור כימות" לייצא את הנתונים בקובץ Excel לניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האסטרטגיה הניסיונית נועדה לזהות גנים סיבתי הרומן של MCD היא recapitulated באיור1.

על ידי ביצוע מערך-CGH במדגם של 155 חולים עם הפרעות התפתחותיות במוח variably המשלב PNH (איור 2 א), כפיס המוח dysgenesis, colpocephaly, אסטרוציטומה hypoplasia and polymicrogyria הקשורים עם אפילפסיה, אטקסיה, פגיעה קוגניטיבית, זיהינו מחיקה מינימלי 1.2 Mb קריטי ב 6q27 משותף על ידי 12 חולים (איור 2B)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCDs הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של הילדות עמידים לתרופות-אפילפסיה-1,-2. עניין MCDs גדל באופן דרמטי בעשור האחרון בשל שני גורמים עיקריים. הראשון הוא השיפור המוח הדמיה (MRI במיוחד), מה שמאפשר רופאים ומדענים לדמיין הרבה מומים המוח לא הכיר קודם לכן. השני הוא ההתפתחות של כלים גנטיים אשר אפשרו את הזיהוי של הרומן MCD סיבתי גנים רבים. זה השתפר בהרבה, הידע שלנו על המנגנון מושתתות התפתחות המוח ותפקוד ולאחר המותר עבור ייעוץ גנטי מדויק יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר ג'י McGillivray, pr. ג'יי קלייטון-סמית '..., pr. פינצ'יאוטי Dobyns, pr. פ Striano, pr. קרי שפר, pr. פ מ Roberston ו- pr. S.F. Berkovic למתן חולים MCD. אנו מודים מישל פ ד ר ומיי ד על עצות טכניות ולעזור. עבודה זו נתמכה על ידי מימון 7 בתכנית המסגרת של האיחוד האירופי, הרצון בפרוייקט, מספר חוזה: בריאות-F2-602531-2013, (כדי וייטקונג, R.G., ע. ר, פ. ס. ס), INSERM (לס. ס. ע. ר), לז'ן ג'רום Fondation (R13083AA A.F, E.P.P, C.C), Région פרובנס אלפ Côte d ' azur (APO2014 - דמוטית ס. ס, A.A.D). D.A.K חוקר צעיר EMBO והיא נתמכת על-ידי FWF מעניקה (I914 ו- P24367).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900מערכות חלוקת מיקרו-הזרקה תוך תאיות
ירוק מהיר FCFSigma-AldrichF7252ירוק מהיר מאפשר ניטור חזותי של ההזרקה
BTX ECM 830 אלקטרופורטורBTX הרווארד מנגנון45-0002ה-ECM 830 הוא מחולל דופק גל מרובע המיועד ליישומי
in vitro ו-in vivoMicrotome HM 650 VMicrom10076838Microtome HM 650 V ויברטום 240V 50/60Hz עם להב רוטט
FluoView 300OlympusOlympus FluoViewTM 300 הוא מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי לסריקת נקודות, זיהוי נקודות, קונפוקלי המיועד ליישום מחקר ביולוגיה
תוכנת eCELLenceGlance Vision TechnologieseCELLence היא תוכנה המיועדת לניתוח כמותי של נדידת תאים
מערךחבילות חבילות
Microarray עבור 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K או 8 x 15KAgilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA או G2565BA
עבור 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K או 8 x 60KAgilentAgilent p/n G4900DA או G2565CA
היברידיזציה,AgilentAgilent p/n G2534Aלהכלאת
CGH של מערךשקופיות אטם תא היברידיזציה, אטם של 5 חבילותעבור מערך היברידיזציה של CGH
עבור מיקרו-מערכים של חבילה אחת אוAgilentAgilent p/n G2534-60003
עבור מיקרו-מערכים של 2 חבילות אוAgilentAgilent p/n G2534-60002
עבור מיקרו-מערכים של 4 חבילות אוAgilentAgilent p/n G2534-60011
עבור מיקרו-מערכים של 8 חבילותAgilentAgilent p/n G2534-60014
תנור היברידיזציהAgilentAgilent p/n G2545A
מסובב תנור היברידיזציה עבור תאי הכלאה של Agilent MicroarrayAgilent Agilentp/n G2530-60029
מחזורי תרמי עם מכסה מחומםAgilentAgilent p/n G8800A או שווה ערךTermal cycler לדגירה
1.5 מ"ל אמביון צינור מיקרופוגה ללא RNasep/n AM12400 או שווה ערךמיקרוצנטריפוגה
מוט ערבוב מגנטיקורנינגp/n 401435 או שווה ערךמכשיר לערבוב
קיוביט פלואורומטרטכנולוגיות חייםp/n Q32857מכשיר לכימות DNA
ערכת בדיקת Qubit dsDNA BR, לשימוש עם ערכת הפלואורומטר של קיוביטInvitrogenp/n Q32850עבור פלואורומטר קיוביט
UV-VIS ספקטרופוטומטרThermo ScientificNanoDrop 8000 או 2000, או שווה ערךמכשיר לכימות DNA
P10, P20, P200 ו-P1000 פיפטותPipetman או חלוקת DNA שווה ערך
רכז ואקוםThermo Scientificp/n DNA120-115 או
שווה ערך		מכשיר לריכוז DNA
SureTag ערכת תיוג DNA מלאהAgilentp/n 5190-4240ערכת תיוג DNA (לדגימות אנושיות)
עמודות טיהור (50 יחידות)Agilentp/n 5190-3391(לדגימות אנושיות)
AutoScreen A, צלחות 96 בארותGE Healthcarep/n 25-9005-98ערכת תיוג DNA (לדגימות אנושיות)
ערכת ניקוי GenElute PCRSigma-Aldrichp/n NA1020ערכת תיוג DNA (לדגימות אנושיות)
גנומי אנושי ערכתp/n G1521(לדגימות אנושיות)
עבור מיקרו-מערכי CGH:Promega(נקבה) או p/n G1471 (זכר)מערך בקרת CGH
DNA עבור מיקרו-מערכי CGH+SNP:Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 או NA18579מערך בקרת CGH
ערכת חיץ כביסה DNA Oligo aCGH/ChIP-on-chip ערכת חיץ כביסה אוAgilentp/n 5188-5226מערך CGH הכלאה ושטיפה
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1ו-Agilentp/n 5188-5221Array CGH הכלאה ושטיפה
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2Agilentp/n 5188-5222Array CGH הכלאה ושטיפה
פתרון ייצוב וייבושAgilentp/n 5185-5979מערך CGH הכלאה ושטיפה
Oligo aCGH/ChIP-on-chip ערכת הכלאהAgilentp/n 5188-5220 (25) או p/n 5188-5380 (100)מערך CGH הכלאה ושטיפה
Human Cot-1 DNAAgilentp/n 5190-3393מערך CGH הכלאה ושטיפה
סורק Agilent C סורקAgilentלמערך שקופיות CGH
ערכתלהעשרת יעד
פלטפורמת HiSeq (HSQ), 16 דגימותAgilentp/n G9621A
פלטפורמת HiSeq (HSQ), 96 דגימותAgilentp/n G9621B
פלטפורמת HiSeq (HSQ), 480 דוגמאותAgilentp/n G9621C
פלטפורמת MiSeq (MSQ), 16 דוגמאותAgilentp/n G9622A
פלטפורמת MiSeq (MSQ), 96 דוגמאותAgilentp/n G9622B
פלטפורמת MiSeq (MSQ), 480 דוגמאותAgilentp/n G9622C
ערכת DNA 1000Agilentp/n 5067-1504ערכה להפרדה, גודל וכימות של שברי dsDNA מ-25 עד 1000 bp.
ערכת DNA ברגישות גבוההAgilentp/n 5067-4626ערכה לניתוח ספריות DNA או DNA מקוטעות.
AMPureלטיהור PCR אוטומטי.
5 מ"לAgencourtp/n A63880
60 מ"לAgencourtp/n A63881
450 מ"לAgencourtp/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1בידוד וטיפול בחומצות גרעין ביוטיניליות
2 מ"לLife TechnologiesCat #65601
10 מ"לLife TechnologiesCat #65602
ערכת בדיקה Quant-iT dsDNA BR, עבור כימות ה-DNA של קיוביט פלואורומטר
100 מבחנים, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 מבחנים, 2-1000 ngLife Technologies#Q32853
צינורות בדיקה של קיוביטLife Technologiesp/n Q32856כימות DNA
SureSelec tXT2 ספריות לכידתAgilentבהתאם לניסויערכה לספריות לכידת
SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8800Aהגברת DNA
מודול צלחת 96 באר עבור SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8810Aהגברת DNA
SureCycler 8800-תואמות 96 בארות צלחות Agilentp/n 410088DNA הגברת
פס אופטי כובעיםAgilentp/n401425 הגברת DNA
רצועות כובע צינור, כיפהAgilentp/n 410096הגברת DNA
מחצלות דחיסהAgilentp/n 410187הגברת DNA
2100 חבילת מחשב נייד BioanalyzerAgilentp/nG2943CA הגברת DNA
2100 סט אלקטרופורזה ביו-אנלייזרAgilentp/n G2947CAהגברת DNA
מערכת הכנת דגימה של Covaris, סדרה E או סדרת Sגזירת DNAשל Covaris
מחזיקיCovaris p/n 520078גזירת DNA
מערבל צלחות NutatorDiagnosticsp/n 421105 או שווה ערךמיקסר צלחות
GaIIxIlluminaמכונת ריצוף מהדור הבא
סורק Agilentתא תא אל חלד ערכת תיוג DNA תיוג DNA ערכת ריאגנטים SureSelect XT2 ערכת ערכת XP של Cat דגימות BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C6orf70PCR

מאמרים קשורים