פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

Summary

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מעורבות באופן אינטימי כמעט בכל התהליכים הביולוגיים וצמודות למחלות רבות אנושיות. לכן, יש מאמץ גדול כדי למקד PPIs במחקר בסיסי ובתעשיית התרופות. ממשקי חלבונים הם בדרך כלל גדולים, שטוחים, ולעתים קרובות חוסר כיסים, מסבך את הגילוי של מולקולות קטנות המתמקדות באתרים כאלה. יש גישות אלטרנטיביות מיקוד באמצעות נוגדני מגבלות בשל זמינות ביולוגית ירודה אוראלית, תא-חדירות נמוכות, וחוסר יעילות ייצור.

יש שימוש בפפטידים למקד ממשקי PPI מספר יתרונות. יש לי פפטידים גמישות קונפורמציה גבוהה יותר, הסלקטיביות מוגברת, והם בדרך כלל זולים. עם זאת, יש לי פפטידים מגבלות משלהם, כולל יציבות עניה וקרום תא חוסר יעילות חצייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניתן לבצע cyclization פפטיד. Cyclization הודגם לשפר סלקטיביות פפטיד, יציבות מטבולית, וזמינות ביולוגית. עם זאת, ניבוי קונפורמציה ביו של פפטיד מחזורי הוא לא טריוויאלי. כדי להתגבר על האתגר הזה, גישה אטרקטיבית אחד אותו למסך ספרייה ממוקדת למסך שבו יש את כל פפטידים מחזורי עמוד השדרה באותו רצף ראשוני, אך שונות בפרמטרים המשפיעים על קונפורמציה, כגון גודל טבעת ומיקום.

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של פפטידים ספרייה מחזוריים עמוד השדרה מיקוד PPIs טפיל הספציפי. שימוש בגישה עיצוב רציונלים, שפיתחנו פפטידים הנגזרים מקולט eishmania L חלבון הפיגום לC-קינאז מופעל (חוסר). חוקרים שערנו כי רצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אבל לא בhomolog מארח היונקים, עשויים לייצג אתרי אינטראקציה לחלבונים שהם קריטיים ליכולת הקיום של הטפילים. פפטידים מחזוריים היו מסונתזים באמצעות קרינת מיקרוגל כדי להפחית את זמני תגובה ולהגדיליְעִילוּת. פיתוח ספרייה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה בגדלים שונים טבעת מאפשר מסך שיטתי לקונפורמציה הפעילה הביולוגית ביותר. שיטה זו מספקת דרך כללית, מהירה, וקלילה לסנתז פפטידים מחזוריים.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) לשחק תפקיד מרכזי ברוב התהליכים ביולוגיים, מהעברת אותות תאיות לתא המוות ^1. לפיכך, מיקוד PPIs הוא בעל חשיבות עליונה למחקר בסיסי ויישומים טיפוליים. יכול להיות מוסדר על ידי PPIs נוגדנים ספציפיים ויציבים, אבל נוגדנים הם יקרים וקשים לייצר ויש זמינות ביולוגית ירודה. לחלופין, יכול להיות ממוקד PPIs על ידי מולקולות קטנות. מולקולות קטנות קלות יותר לסנתז וזולים בהשוואה לנוגדנים; עם זאת, הם יחסית פחות גמישים ולהתאים טובים יותר לחללים קטנים יותר לממשקי חלבון-חלבון גדול ^2,3. מחקרים שונים הראו כי פפטידים, שהם פשוט יותר וזולים יותר מאשר נוגדנים וגמישים יותר ממולקולות קטנות, יכולים להיקשר ממשקי חלבון ולהסדיר PPIs ^4,5. שוק פפטיד הטיפולי העולמי מוערך כרבע מליארד דולרים בשינה 2013, והוא גדל annua 10.5%lly ^6. יתר על כן, יש יותר מ -50 פפטידים משווקים, סביב 270 פפטידים בשלבים שונים של ניסויים קליניים, ופפטידים כ -400 בשלבים פרה-קליניים מתקדמים ^7. למרות פפטידים רבים נמצאים בשימוש כתרופות, פפטידים עדיין מהווים מספר אתגרים המגבילים את היישום הנרחב שלהם, כולל זמינות ביולוגית ירודה ויציבות, חוסר יעילות בקרום תא מעבר, וגמישות קונפורמציה ^8,9. חלופה אחת להתגבר על החסרונות אלה היא להחיל שינויים שונים כגון (חומצת אמינו וD-N-אלקילציה) מקומיות והגלובלי (cyclization) אילוצים ^8,10-12. שינויים אלה להתרחש גם באופן טבעי. לדוגמא, ציקלוספורין, פפטיד הטבעי מחזורי לדיכוי מערכת חיסון, מכיל חומצת אמינו בודדת D-ועובר שינויי N-אלקילציה ^13,14.

שינוי של חומצות אמינו טבעיות כדי לגרום לאילוצים מקומיים, כגון D- וN-אלקילציה, לעתים קרובות משפיע על פפטיד9; של פעילות ביולוגית. עם זאת, cyclization, שבו הרצף של עניין יכול להישאר אותו הדבר, יש יותר סיכוי לשמור על פעילות ביולוגית. Cyclization היא דרך אטרקטיבית מאוד להגביל את מרחב קונפורמציה פפטיד על ידי הפחתת שיווי המשקל בין תצורות שונות. בדרך כלל זה מגביר את הפעילות והסלקטיביות ביולוגיות על ידי הגבלת פפטיד לקונפורמציה הפעילה שמתווכת רק פונקציה אחת. Cyclization גם משפר את יציבות פפטיד על ידי שמירה על פפטיד בקונפורמציה שפחות מוכרת על ידי אנזימים משפילים. ואכן, פפטידים מחזוריים הוצגו השתפרו יציבות מטבולית, זמינות ביולוגית, וסלקטיביות בהשוואה לעמיתיהם ליניארי שלהם ^15-17.

עם זאת, cyclization יכולה להיות חרב פיפיות שכן במקרים מסוימים ההגבלה עלולה למנוע פפטידים מהשגת קונפורמציה ביו. כדי להתגבר על מכשול זה, ספרייה ממוקדת שבו יש את כל פפטידים אותו sequenc העיקרייכול להיות מסונתז pharmacophores דואר וכתוצאה מכך קבוע. פפטידים בספרייה שונים בפרמטרים המשפיעים על המבנה שלהם, כגון גודל טבעת ומיקום, על מנת להקרין לאחר מכן לקונפורמציה ביו ביותר ^9,18.

יכולים להיות מסונתזים פפטידים הן בפתרון ועל ידי גישת סינתזת פפטיד מוצק שלב (SPPS), שנמצא כעת גישת סינתזת פפטיד הנפוצה יותר ויידון נוסף. SPPS הוא תהליך שבו שינויים כימיים מבוצעים על תמיכה מוצקה באמצעות מקשר להכין מגוון רחב של תרכובות סינתטיות ^19. SPPS מאפשר פפטידים הרכבה על ידי צימוד רצוף של חומצות אמינו באופן הדרגתי מC-הסופית, שמצורף לתמיכה מוצקה, לN-הסופית. הצד-השרשרות של חומצות N-α-אמינו חייבים להיות רעול פנים עם הגנה על קבוצות שהם יציבים בתנאי תגובת שימוש במהלך התארכות פפטיד כדי להבטיח את התוספת של חומצת אמינו אחת לרח 'EP. בשלב האחרון, פפטיד הוא שוחרר מהשרף והצד-שרשרת הגנה על קבוצות יוסרו במקביל. בעוד פפטיד הוא להיות מסונתז, ניתן להסיר את כל חומרים כימיים המסיסים ממטריצת תמיכת פפטיד המוצק על ידי סינון ונשטפו בסוף כל שלב צימוד. עם מערכת כזו, עודף גדול של חומרים כימיים בריכוז גבוה יכול לנהוג תגובות צימוד להשלמה וניתן לבצע את כל שלבי הסינתזה באותו הכלי ללא כל העברה של חומר ^20.

למרות שיש כמה מגבלות SPPS כגון הייצור של תגובות לא שלמות, תגובות לוואי, חומרים כימיים טמאים, כמו גם קשיי ניטור התגובה ^21, את היתרונות של SPPS עשו את זה "תקן הזהב" לסינתזת פפטיד. יתרונות אלה כוללים את האפשרות לשלב חומצות אמינו שאינם טבעיות, אוטומציה, טיהור קלה, הפסדים פיזיים ממוזערים, ושימוש בחומרים כימיים עודפים, וכתוצאה מכךתשואות גבוהות. SPPS הוכח להיות שימושי מאוד בסינתזה של רצפים קשים ^21,22, שינויי ניאון ^23, וספריות פפטיד ^24,25. SPPS הוא גם מאוד שימושי עבור מכלולים מרובה שרשרת אחרות כגון oligonucleotides ^26,27, אוליגוסכרידים ^28,29, וחומצות גרעין פפטיד ^30,31. מעניין לציין, שבמקרים מסוימים, SPPS הוצג להיות יתרון עבור סינתזת מולקולות קטנות שנעשות באופן מסורתי בפתרון ^32,33. SPPS משמש הוא בקנה מידה קטנה למחקר והוראה ^34,35, כמו גם בקנה מידה גדולה בתעשייה ^36-38.

שתי אסטרטגיות סינתזה המשמשות בעיקר במתודולוגיה SPPS לסינתזה של פפטידים הן butyloxycarbonyl (בוק) ו9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC). האסטרטגיה המקורית הציגה לSPPS הייתה בוק, אשר דורש תנאי חומצה חזקים כדי להסיר צד שרשרת הגנה על קבוצות ולדבוק פפטיד מresin. סינתזת פפטיד מבוססת FMOC, לעומת זאת, מנצלת תנאי בסיס מתונים והיא אלטרנטיבה מתונה יותר לפרוטוקול בוק חומצה יציב ^39. אסטרטגית FMOC מנצלת הגנת צד שרשרת המאונכות t-בוטיל (TBU) שהוסרה בשלב האחרון של הסינתזה תוך ביקוע פפטיד מהשרף בתנאי חומצה.

העיקרון הכללי לסינתזת פפטיד על תמיכה מוצקה מוצג באיור 1. חומצת אמינו הראשונית, רעול פנים על ידי קבוצת הגנה זמנית על N-α-הסופית, נטענת על השרף מC-סופית. קבוצת הגנת חצי קבועה כדי להסוות את שרשרת הצד משמשת גם במידת צורך (איור 1, שלב 1). הסינתזה של פפטיד היעד מורכבת מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של קבוצת הגנת N-α-הזמנית (איור 1, שלב 2) וצימוד של חומצת אמינו המוגנת הבאה (איור 1 אונג>, שלב 3). לאחר חומצת אמינו האחרונה נטענת (איור 1, שלב 4), פפטיד הוא ביקע מתמיכת השרף וקבוצות הגנת חצי הקבועה מוסרים (איור 1, שלב 5).

באיור 1. תכנית כללית של סינתזת פפטיד השלב מוצקה. חומצת אמינו המוגנת-N-α מעוגנת באמצעות קבוצת carboxyl באמצעות מקשר לשרף (שלב 1). הפפטיד הרצוי מורכב באופן ליניארי מC-הסופית לN-הסופית על ידי מחזורים חוזרים ונשנים של deprotection של הקבוצה הזמנית הגנה (TPG) מN-α (שלב 2) וצימוד חומצת אמינו (שלב 3). לאחר להשיג הסינתזה (שלב 4), קבוצות חצי קבועות הגנה (SPG) הם deprotected במהלך מחשוף פפטיד (שלב 5).תקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר ההרכבה של שרשרת הפפטיד המלאה, cyclization יכול להיות מושגת על ידי מספר חלופות: (א) ראש אל זנב cyclization - זו דרך נוחה אבל מוגבל שכן הוא מספק רק אפשרות אחת לcyclization (איור 2 א), cyclization (ב) באמצעות חומצות אמינו מהרצף של עניין המכילות קבוצות פונקציונליות ביו - עם זאת, השימוש בחומצות אמינו אלה עשויים להשפיע על הפעילות הביולוגית (איור 2), וcyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו (אבני בניין או אחר) מבלי להפריע הרצף ביו. היכרות עם מולקולות אלה היא נפוצה שכן היא מאפשרת ייצור של ספריות ממוקדות מבלי לשנות את הרצף של עניין (איור 2 ג).

Figure 2. אסטרטגיות cyclization פפטיד האלטרנטיבי ראש () לcyclization זנב, דרך קשר פפטידי בין C-הסופית וN-הסופית.; cyclization (ב ') בין קבוצות הפונקציונליות כגון אג"ח דיסולפיד בין שאריות ציסטאין (1), או קשר בין אמיד הרשתות בצד של ליזין לאספרטית / חומצה גלוטמית (2), או רשת צד לn- או C-סופית (3 -4); cyclization (C) על ידי הוספת חומצות אמינו נוספות או נגזרי חומצת אמינו או מולקולות קטנות, לדוגמא לפני (R0) ואחרי (R7) הרצף ביו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סינתזה משתמשת קרינת מיקרוגל לחמם תגובות, ובכך מאיץ כימי אורגנית בסיוע מיקרוגל תמורות ^40,41. כימיה מיקרוגל מבוססת על היכולת של המגיב / הממס לספוגמיקרוגל אנרגיה ולהמיר אותו לחום ^42. לפני הטכנולוגיה הפכה נפוצה, חסרונות עיקריים היו הצורך להתגבר, כוללים יכולת השליטה והשחזור של פרוטוקולי סינתזה וחוסר מערכות זמינות עבור פקדי טמפרטורה ולחץ נאותים ^43,44. הדו"ח הראשון של סינתזת פפטיד בסיוע מיקרוגל נעשה שימוש במיקרוגל מטבח לסנתז כמה פפטידים קצרים (7-10 חומצות אמינו) עם שיפור משמעותי של יעילות הצימוד וטוהר ^45. יתר על כן, אנרגיית מיקרוגל הוצגה כדי להקטין הצטברות שרשרת, להפחית תגובות צד, להגביל racemization, ולשפר את שיעורי צימוד, שהם קריטיים לכל רצפים קשים וארוכים ^46-53.

כיום השימוש בקרינת מיקרוגל לסינתזה של פפטידים או תרכובות הקשורות בתמיכה מוצקה הוא נרחבת, כולל סינתזה () במים במקום ממס אורגני ^54; (ב) סינתזה של פפטידים עםשינויים נפוצים לאחר translational, כגון glycopeptides ^55-58 או phosphopeptides ^59-61, סינתזה שקשה בדרך כלל עקב יעילות הצימוד הנמוכה של נגזרי חומצת אמינו הפריעו sterically; (ג) סינתזה של פפטידים עם שינוי בעמוד השדרה, כגון azapeptides, אשר יכול להיווצר על ידי ההחלפה של C (α) של שאריות חומצת אמינו עם אטום חנקן ^62, או peptoids, הצד שמחובר לשרשרת חנקן אמיד ולא אטום Cα ^63,64; סינתזה של פפטידים מחזוריים ^65-71 (ד); סינתזה ו( ה) של ספריות קומבינטורית ^51,72. במקרים רבים, החוקרים דיווחו יעילות גבוהה יותר וצמצום זמן סינתזה באמצעות קרינת מיקרוגל בהשוואה לפרוטוקול המקובל.

באמצעות עיצוב רציונאלי ^73-75, שפיתחנו פפטידים אנטי-טפילים שנגזרו מהקולט של eishmania L הפיגום FOr מופעל C-קינאז (חוסר). חוסר ממלא תפקיד חשוב בשלב המוקדם של זיהום שושנת יריחו ^76. טפילים להביע רמות נמוכות יותר של חוסר להיכשל טפילים אפילו עכברים שנפרץ חיסון ⁷⁷ כמו חוסר מעורב בתהליכי טפיל איתות חיוניים וסינתזת חלבון ^78. לכן, חוסר הוא חלבון מפתח פיגום ⁷⁹ ויעד תרופה יקר. התמקדות ברצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אך לא במעמד homolog היונקים המארח, זיהינו פפטיד חומצת אמינו 8 (RNGQCQRK) שירד שושנת יריחו sp. כדאיות בתרבות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של פפטידים עמוד השדרה מחזורית הנגזרים מרצף חלבון חוסר שתואר לעיל. פפטידים היו מסונתזים על תמיכה מוצקה באמצעות חימום במיקרוגל על ​​ידי המתודולוגיה SPPS עם פרוטוקול FMOC / TBU. פפטידים היו מצומדת לפפטיד _47-57 מוביל (YGRKKRRQRRR) TAT באמצעות אג"ח אמיד כחלק מSPPS. תחבורה של מגוון רחב של מטענים לתאים מבוססות TAT הייתה בשימוש כבר למעלה מ -15 שנים ומסירת המטען לאברונים subcellular אושרה ^80. ארבעה linkers שונה, succinic ואנהידריד glutaric כמו גם adipic והחומצה pimelic, שימש לביצוע cyclization ליצור linkers חומצה קרבוקסילית של שניים עד חמישה פחמנים. Cyclization נעשה שימוש באנרגית מיקרוגל, והצעדים deprotection מחשוף וצד-שרשרת הסופיים נעשו באופן ידני ללא אנרגיית מיקרוגל. השימוש בסינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי שיפר את טוהר המוצר, הגדיל את תשואת המוצר, וצמצם את משך הזמן של הסינתזה. פרוטוקול כללי זה יכול להיות מיושם למחקרים אחרים שעושים שימוש בפפטידים להבין מנגנון מולקולרי חשוב במבחנת in vivo ולפתח תרופות פוטנציאליות למחלות בבני אדם.

Protocol

1. ציוד וריאגנטים הכנה

1. ציוד הכנה
   1. לבצע את כל הפעולות בתוך מנדף שימוש בציוד מגן אישי מתאים.
   2. כימי לסנתז פפטידים על תמיכה מוצקה באמצעות מיקרוגל פפטיד סינתיסייזר עם מודול נוסף של גלה מצויד בבדיקת טמפרטורה של סיבים אופטיים לשליטה כוח משלוח המיקרוגל בכלי תגובת טפלון (30 מיליליטר, עם frit זכוכית) או בפוליפרופילן חד פעמי מחסנית (12 מיליליטר, עם frit גס).
   3. לערבוב נכון, להתחבר אספקת חנקן לכלי התגובה, או לחלופין לאטום את שני הקצוות של מחסנית פוליפרופילן, ומניח על שייקר סיבובי.
   4. לניקוז תערובות תגובה או שטיפות, להתחבר לואקום הבית באמצעות מלכודת פסולת.
   5. מניחים את הבדיקה הסיבים אופטיים לתוך כלי התגובה.
2. הכנת ריאגנטים
   1. הכן את השרף על ידי שקילת רשת 100-200 שרף רינק אמיד בבוקר (0.204 מ"ג), להוסיף 5 מיליליטר של 1: 1 תערובת של N, -dimethylformamide N (DMF) / dichloromethane (DCM) למחסנית הכלי / פוליפרופילן התגובה לשטוף את השרף למטה, לנער במשך 2-4 שעות להתנפח כמו שצריך, ולנקז.
   2. הכן 0.2 M-9 fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) -amino פתרונות חומצה על ידי המסת חומצת אמינו-FMOC המקבילה בDMF ומערבולת את התערובת עד חומצות אמינו הם מומסים (טבלה 1).
   3. הכן תערובת פתרון 0.45 M activator ידי המסת 18.96 גרם O - (benzotriazol-1-י.ל) - N, N, N ', N' hexafluorophosphate -tetramethyluronium (HBTU) ב 100 מיליליטר DMF וvortexing את התערובת עד המוצק מומס (טבלה 1).
   4. הכן תערובת 2 פתרון בסיס activator M על ידי שילוב של 34.8 מיליליטר N, -diisopropylethylamine N (DIEA) עם 65.2 מיליליטר 1-מתיל-2-pyrrolidinone (תמ"א) (טבלת 1).
   5. הכן תערובת פתרון 0.1 M deprotection ידי המסת מימה 3.37 g 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)ב 250 מיליליטר של פתרון 20% / V V של piperidine בDMF וvortexing את התערובת עד המוצק מומסת (טבלה 1).

2. FMOC מוגן חומצת אמין זיווגים

1. צימוד חומצת אמינו
   1. להוסיף חומצת אמינו (2.5 מיליליטר) / activator (1 מיליליטר) / בסיס activator (0.5 מיליליטר) למחסנית הכלי / פוליפרופילן תגובה ולתת את התגובה להמשיך עבור 300 שניות (25 W, 75 ° C, טבלה 2). מסננים את הפתרון.
   2. לשטוף את השרף עם DMF. להוסיף DMF לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור חמש פעמים.
2. deprotection FMOC
   1. להוסיף 7 מיליליטר של piperidine 20% בDMF עם 0.1 M HOBt מחסנית הכלי / פוליפרופילן לתגובת דגירה במשך 30 שניות (45 W, 75 ° C, טבלה 2).
   2. מסננים את תערובת התגובה.
   3. להוסיף 7 מיליליטר של piperidine 20% בDMF עם 0.1 M HOBt מחסנית הכלי / פוליפרופילן לתגובת דגירה במשך 180 שניות (45 W, 75 ° C, טבלת 2).
   4. מסננים את תערובת התגובה.
   5. לשטוף את השרף עם DMF. להוסיף DMF לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור חמש פעמים.
      הערה: לחלופין, להשהות את ההליך כאן ולחדש במועד מאוחר יותר.
3. לאחר שלב צימוד חומצת אמינו, לשטוף את השרף עם DCM וחנות לכמה ימים לפחות על 4 מעלות צלזיוס (עבור חנות תקופה ארוכה יותר השרף ב-- 20 מעלות צלזיוס).
   1. הזז את השרף מכלי התגובה למחסנית פוליפרופילן.
   2. לשטוף את השרף עם DCM. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.
   3. לאטום את מחסנית פוליפרופילן הדוק עם כובע וברזלים עליון.
   4. לפני שמתחיל סינתזה חדשה, להתנפח השרף במשך 3-4 שעות בDMF (7 מיליליטר).
4. ניטור הסינתזה
   1. השתמש בבדיקת קייזר (ninhydrin) או בדיקת Chloranil כדי לקבוע את ההתקדמות של מהירותסִינתֶזָה. לחלופין, לבצע תגובת מחשוף בקנה מידה קטנה כדי לקבוע את טוהר והמוני של פפטיד מסונתז. ראה סעיף 9.
      הערה: בפתרון בעיות נוספות ראה טבלה 3.
5. חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 כרצויים לסנתז פפטיד ממוקד: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. אנהידריד / חומצת צימוד

1. צימוד אנהידריד
   1. לשטוף את השרף עם תמ"א. להוסיף תמ"א לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.
   2. ממיסים 10 שווה של אנהידריד המקביל בתמ"א (5 מיליליטר), להוסיף 1 4-Dimethylaminopyridine שווה הערך (DMAP) ו -10 שווה DIEA לפתרון (טבלת 1).
   3. הוסף 10: 1: 10 תערובת של אנהידריד / DMAP / DIEA לשרף ודגירה של 300 שניות (25W, 75 ° C, טבלה 2). מסננים את הפתרון.
   4. לשטוף את השרף עם תמ"א. להוסיף תמ"א לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.
2. צימוד חומצה
   1. לשטוף את השרף עם DMF. להוסיף DMF לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.
   2. ממיסים 10 שווה של חומצת dicarboxylic המקבילה בDMF (5 מיליליטר). הוסף 1 DMAP שווה ושווה 10 N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) לפתרון (טבלת 1).
   3. טרום להפעיל את התערובת על ידי ערבוב במשך 30 דקות.
   4. מוסיף את התערובת לשרף והדגירה של 300 שניות (25 W, 75 ° C, טבלה 2) ולנקז את הפתרון.
   5. לשטוף את השרף עם DMF. להוסיף DMF לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז פתרון. חזור על שלב שלוש פעמים.

4. N-methyltrityl (MTT) הגנת הקבוצה Deprotectיוֹן

הערה: שרשרת צד יזין הייתה מוגנת עם N-methyltrityl (MTT) ^81, קבוצת הגנה שניתן deprotected סלקטיבי בתנאים יציב חומצה ^82,83. Deprotect MTT הגנת קבוצה באופן ידני על שייקר בלי אנרגיית מיקרוגל.

1. העבר את השרף למחסנית פוליפרופילן מצויד בתקע כובע וברזלים.
2. לשטוף את השרף עם DCM. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.
3. להוסיף 15-25 מיליליטר של תערובת של 1% חומצת trifluoroacetic (TFA), 5% Triisopropylsilane (TIS), ו -94% DCM למחסנית פוליפרופילן לגרם אחד של שרף.
   הערה: TFA הוא חומצה חזקה ומאכל והוא מאוד ממגר את העור, עיניים, ורקמת ריאה.
   1. שמור תמיסות מרוכזות של TFA בשכונה בכל העת.
   2. להשתמש בציוד מגן אישי מתאים (הגנה על העין, חלוק מעבדה וכפפות) ועבודה במכסת מנוע מאוורר היטב. כפפות שינוי מיידיאם הם באים במגע עם TFA ומייד לנקות כל נשפך. אם עור או עיניים לבוא במגע עם החומצה, לשטוף את האזור הפגוע באופן מיידי עם מים ולשטוף במשך 15 דקות נוספות.
4. הנח את מחסנית פוליפרופילן על שייקר ולנער במשך 5 דקות על RT.
5. מסננים את הפתרון ממחסנית פוליפרופילן על ידי יישום ואקום.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5 פעמים, שלוש.
7. לשטוף את השרף עם DCM. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור חמש פעמים.

5. Cyclization של פפטיד לינארי

1. לשטוף את השרף עם DCM. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור חמש פעמים.
2. בצינור פוליפרופילן 50 מיליליטר, לפזר 5 שווה benzotriazole-1-ly-אצטילן-טריס-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) בDibromomethane (DBM, 5 מיליליטר) ולהוסיף 10 שווה DIEA לפתרון (טבלת 1).
3. מוסיף את התערובת לשרף והדגירה של 300 שניות (25 W, 75 ° C, טבלה 2). מסננים את הפתרון.
4. לשטוף את השרף עם DCM. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור שלוש פעמים.

6. מחשוף וDeprotection של קבוצות צד שרשרת

1. לשטוף את השרף עם DCM ואתר diethyl.
   1. להוסיף DCM לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור על שתי פעמים.
   2. להוסיף אתר diethyl לשרף עבור 120 שניות (7 מיליליטר, 0 W, RT) ולנקז את הפתרון. חזור על שתי פעמים.
2. ייבש את השרף בייבוש ואקום ב RT לפחות 3 שעות על אשלגן הידרוקסידי (KOH, 1-10 ז).
3. לשקול את השרף המיובש ולהעביר אותו למחסנית פוליפרופילן.
4. להוסיף 10 מיליליטר של קוקטייל מחשוף מקורר מראש trifluoroacetic חומצה (TFA) (לדוגמא, 90% TFA, 2.5% מים, 2.5% פנול TIS ו 5%) לכל גרם אחד של שרף.
5. לנער במשך 3 שעותב RT.
6. לאסוף את פתרון מחשוף TFA ידי סינון השרף לתוך צינור פוליפרופילן 50 מיליליטר. לסינון, להשתמש frit שהוא במחסנית פוליפרופילן 12 מיליליטר.
7. להוסיף אתר קר diethyl (35 מיליליטר) לצינור.
8. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב1,207 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
9. למזוג את שכבת האתר.
10. חזור על שלב 6.7-6.9, חמש פעמים.

7. ייבוש עמוד השדרה המחזורי פפטיד

1. שמור את הפפטיד זירז באותו הצינור ולייבש אותו במכסת מנוע למשך 30 דקות.
2. ממיסים את הפפטיד ב1: 1 תערובת של מים ואצטוניטריל (ACN).
3. להקפיא את פתרון המוצר הסופי בחנקן נוזלי.
4. Lyophilize המוצר הסופי.

8. אפיון עמוד השדרה המחזורי פפטיד

1. ממיסים מדגם קטן (1 מ"ג) של המוצר במים (μl 400).
2. להזריק את הפפטיד המומס (10-200 μl) לchromatograp נוזל עתירים ביצועים שלב הפוךHY מערכת (RP-HPLC) כדי לבדוק את טוהר פפטיד ^34.
3. בדוק את המסה של הפפטיד באמצעות יינון ספקטרומטריית מסת desorption הלייזר בסיוע מטריקס (MS-MALDI) ^84.
   1. מערבבים פפטיד μl 1 (100 מיקרומטר) ב1: (V / V) תערובת 1 של אצטוניטריל: מים עם 1 μl של מטריצה ​​(חומצת 5 מ"ג / מיליליטר, α-cyano-4-hydroxycinnamic) ב1: 1 (נ / נ) תערובת של אצטוניטריל: מים עם TFA (0.1%).
   2. מקום 1 μl על צלחת MS-MALDI.
   3. ייבש את הדגימה ולמקם אותו בספקטרומטר המסה.
4. לשקול את הפפטיד ולחשב את תשואת אחוזים.
5. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.

9. ניטור הסינתזה

1. קייזר מבחן ⁸⁵ (ninhydrin)
   1. הכן את הפתרונות מגיב.
      1. הכן פתרון על ידי המסת 16.5 מ"ג של אשלגן ציאניד (KCN) ב 25 מיליליטר של מים מזוקקים. לדלל 1 מיליליטר של הפתרון מעל 49 מיליליטר של פירידין.
      2. הכן פתרון Bעל ידי המסת 1 גרם של ninhydrin ב 20 מיליליטר של אתנול.
      3. הכן פתרון C על ידי המסת פנול 40 גרם ב 20 מיליליטר אתנול.
   2. השתמש בבדיקת קייזר לבדוק את השלמת צימוד חומצת אמינו או deprotection של קבוצת ההגנה.
      1. העבר כמה חרוזים מהשרף למבחנה.
      2. להוסיף שלוש טיפות (~ 100 μl) של כל פתרון (A, B ו- C) ולערבב.
      3. מחממים את המבחנה על בלוק חימום ב 110 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
         הערה: חרוזים בצבע כחולים (תוצאה חיובית) מצביעות על תגובת צימוד שלמה או deprotection של קבוצת הגנת FMOC.
2. מבחן Chloranil ⁸⁶
   1. הכן את חומרים כימיים טריים עבור כל בדיקה הבאה.
      1. הכן פתרון של 2% Chloranil בDMF, א פתרון
      2. הכן פתרון של אצטאלדהיד 2% בDMF, ב 'פתרון
   2. בצע את בדיקת Chloranil לבדוק את השלמת צימוד חומצת אמינו או לאהוא deprotection של קבוצת ההגנה.
      1. שילוב של פתרון 100 μl עם הפתרון של B 100 μl בצינור 1.5 מיליליטר.
      2. זרוק את חרוזים ובעדינות לנער במשך 5 דקות.
         הערה: חרוזים חום כהים בצבע (תוצאה חיובית) מצביעים deprotection של קבוצת הגנת FMOC או תגובת צימוד שלמה.
3. תגובת מחשוף בקנה מידה קטנה
   1. הסר כמות קטנה של שרף למחסנית פוליפרופילן 3 מיליליטר מצויד בתקע כובע וברזלים.
   2. פנק עם תערובת 2 מיליליטר של 95% TFA, 2.5% מים וTIS 2.5%.
   3. לנער את התערובת למשך 30 דקות ב RT.
   4. הסר את השרף על ידי סינון באמצעות frit של מחסנית פוליפרופילן ולהתאדות הממסים על ידי זרם של חנקן.
   5. ממיסים את השאריות במים ולנתח את המוצר באמצעות HPLC ו / או MS.

10. שושנת יריחו donovani Promastigote הכדאיות בתרבות Assay

1. שושנת יריחו donovani (L. donovani) תנאי גידול וטיפול
   1. תרבות L. promastigotes donovani בשינוי של Dulbecco של בינוני של הנשר (DMEM) עם 4.5 g / L גלוקוז, L- גלוטמין, ופירובט נתרן ב 26 מעלות צלזיוס.
   2. פנק את L. donovani promastigotes עם פפטידים מחזוריים (100 מיקרומטר) למשך 24 שעות ב 26 מעלות צלזיוס.
2. donovani שושנת יריחו assay כדאיות (L. donovani)
   1. להעריך את הכדאיות טפיל עם 20 μl alamarBlue פי הפרוטוקול של היצרן.
   2. לקבוע alamarBlue הפחתה על ידי מדידת הקרינה (ב 570 ננומטר עירור ופליטת 590 ננומטר). ערכי הקרינה גבוהים יותר מצביעים על פעילות המטבולית גדולה יותר ויכולת קיום טפיל מוגברת.

Results

כאן אנו מתארים את הפיתוח של ספרייה קטנה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה שמתמקדת PPIs החיוני של הטפיל שושנת יריחו ולפעול כסוכנים נגד פרזיטים (לסקירה על פפטידים המתמקדים ב- PPI כסוכנים נגד פרזיטים ^87). באמצעות הסינתזה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה רומן, pharmacophores נשמר בפיגום של גודל להארכה. הכוח של הספרייה הממוקדת המוצעת כאן הוא היכולת להשתנות גדלי פיגום פפטיד, ובמקביל לאפשר מידה מסוימת של חופש קונפורמציה מוגבלת באמצעות cyclization. הסינתזה שלמה של פפ...

Discussion

הסינתזה של ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה נגזרים מחלבון חוסר הטפיל שושנת יריחו באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי לחלוטין מתוארת. ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים פותחה עם pharmacophores שימור וlinkers השונים. תוספת של linkers השונים כגון אנהידריד glutaric, אנהידריד succinic, חומצת adipic, חומצת pimelic, ליזין, ornithine, ואובניים בניין אחר יכולה לשמש כדי להגדיל את מגוון חלל קונפורמציה של פפטידים מחזוריים. הסינתזה של ספריית פפטידים מחזוריים ממוקדת מאפשרת לח...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ריאגנטים
תמיכה מוצקה, זירת החלקה אמיד AM שרף ML	CBL	BR-1330	טעינה: 0.49 מילימול/גרם
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg (Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-ASP (OBut) -OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys (Trt) -OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln (Trt) -OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu (OtBu) -OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-מתיל-2-פירולידינון (NMP)	סיגמא	328634	<חזק>זהירות רעיל/דליק מאוד/מגרה.
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	<חזק>זהירות רעיל. השתמש ב-DMF באיכות גבוהה כדי למנוע תגובות לוואי כגון הסרת Fmoc כתוצאה מעקבות הדימתילאמין מפירוק DMF.
דיכלורומתאן (DCM)	סיגמא	D65100	<חזק>זהירות
דיברומומתאן מזיק (DBM)	סיגמא	D41868	<חזק>זהירות
חומצה טריפלואורואצטית מזיקה (TFA)	Sigma	T62200	<חזק>זהירות
חומצה טריפלואורואצטית קורוזיבית/רעילה, בדרגת HPLC (TFA)	Sigma	91707	<חזק>זהירות דיאתיאתר קורוזיבי/רעיל
	סיגמא	31690	<חזק>זהירות
טריאיזופרופילסילן (TIS)	סיגמא	מאוד 233781	<חזק>זהירות מים מגרים/דליקים
סיגמא	270733		בדרגת HPLC
בדרגת HPLC (ACN)	Scientific	A998-4	<חזק>זהירות דליק/מגרה/מזיק
N,N-דיסופרופילאתילאמין (DIEA)	Sigma	3440	<חזק>זהירות פיפרידין סיגמא קורוזיבי/דליק מאוד
		W290807	<חזק>זהירות סיגמא פירידין רעיל/דליק מאוד
		270970	<חזק>אזהרה אתנול דליק/מזיק
מאוד (EtOH)	סיגמא	459844	<חזק>אזהרה 1-הידרוקסיבנזוטריאזול
הידראט (HOBt)	סיגמא	157260	<חזק>זהירות דליק מאוד/מגרה/מזיק
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′ - tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Sigma	12804	<חזק>זהירות מגרה/מזיק
בנזוטריאזול-1-לי-אוקסי-טריס-פירולידינופוספוניום הקספלואורופוספט (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	<חזק>זהירות
נינהידרין	סיגמא	454044	<חזק>זהירות מזיק
פנול	סיגמא	P3653	<חזק>אזהרה אשלגן ציאניד קורוזיבי/רעיל
(KCN)	סיגמא	11813	<חזק>זהירות רעיל מאוד
אשלגן הידרוקסיד (KOH)	סיגמא	221473	<חזק>זהירות רעיל
N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)	Sigma	38370	<חזק>אזהרה דליק/רעיל
4-דימתיל-אמינופירידין (DMAP)	Sigma	522805	<חזק>אזהרה אנהידריד גלוטארי רעיל/מגרה
	Sigma	G3806	<חזק>אזהרה סיגמא אנהידריד סוקסיני דליק/מגרה/מזיק
		239690	<חזק>אזהרה
מזיק חומצה אדיפית		A26357	<חזק>אזהרה< חזק> חומצה פימלית רעילה/מגרה
	סיגמא	P45001	<חזק>זהירות< חזק> סיגמא כלורניל רעיל/מגרה
		23290	<חזק>אזהרה<> רעיל/מגרה
אצטאלדהיד	סיגמא	402788	<חזק>זהירות דליק/רעיל
<חזק>ציוד
צנטריפוגה	בקמן קולטר	אלגרה 6R צנטריפוגה
ליופילייזר	Labconco	freezone 4.5
משאבת ואקום	פרנקלין אלקטריק	דגם 1101101416 עם 3/4 כ"ס	אלקטל משאבה עם פרנקלין מוטור
מחסנית פוליפרופילן 12 מ"ל	הפרדה מיושמת	2419
תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 12 מ"ל	הפרדה מיושמת	8157
מחסנית פוליפרופילן 3 מ"ל	הפרדה מיושמת	2413
תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 3 מ"ל	הפרדה מיושמת	8054
עצור PTFE	הפרדה מיושמת	2406
צינורות שטוחים, 50 מ"ל	VWR	21008-240
סעפת מיצוי, 20 חיבורים, צינורות 16 x 100 מ"מ	מים	WAT200609
שייקר, מערבל נואטור BD אדמס	פישר מדעי	22363152
Nalgene HDPE בקבוקי IP2 עם פה צר, 125  מ"ל	פישר סיינטיפיק	03-312-8
בקבוק ארלנמאייר	פישר סיינטיפיק	FB-501, 500 מ"ל
בלוק חימום	תרמולין	1760 אמבט
צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגיל	פישר סיינטיפיקט	14-961-25
מיקרופיפטות וטיפים Finnpipette	Thermo	20– 200 ו-100– 1,000 μ l
בקבוקוני HPLC - מיקרו vl עמ' 400 ומיקרו; l PK100	VWR	69400-124
בקבוקון HPLC- כחול Snap-It Cap	VWR	66030-600
אנליטי HPLC טור	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µ m C18Q, קוטר פנימי 4.6 מ"מ 150 מ"מ
עמוד HPLC הכנה, XBridge	ווטרס	OBD C18 5 ומיקרו; עמודה m	19 מ"מ ופעמים; ספקטרומטר מסה 150 מ"מ
	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
צילינדר
מייבש
מערכת RP-HPLC אנליטית Shimadzu LC-20			מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-20AD, דגימה אוטומטית SIL-20AC, מסיר גז DGU-20A5 (Shimadzu, MD, ארה"ב).
מערכת RP-HPLC הכנה Shimadzu LC-20			מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-6AD ואספן שברים FRC-10A (Shimadzu, MD, ארה"ב).