Method Article

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

DOI:

10.3791/53589

January 26th, 2016

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מעורבות באופן אינטימי כמעט בכל התהליכים הביולוגיים וצמודות למחלות רבות אנושיות. לכן, יש מאמץ גדול כדי למקד PPIs במחקר בסיסי ובתעשיית התרופות. ממשקי חלבונים הם בדרך כלל גדולים, שטוחים, ולעתים קרובות חוסר כיסים, מסבך את הגילוי של מולקולות קטנות המתמקדות באתרים כאלה. יש גישות אלטרנטיביות מיקוד באמצעות נוגדני מגבלות בשל זמינות ביולוגית ירודה אוראלית, תא-חדירות נמוכות, וחוסר יעילות ייצור.

יש שימוש בפפטידים למקד ממשקי PPI מספר יתרונות. יש לי פפטידים גמישות קונפורמציה גבוהה יותר, הסלקטיביות מוגברת, והם בדרך כלל זולים. עם זאת, יש לי פפטידים מגבלות משלהם, כולל יציבות עניה וקרום תא חוסר יעילות חצייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניתן לבצע cyclization פפטיד. Cyclization הודגם לשפר סלקטיביות פפטיד, יציבות מטבולית, וזמינות ביולוגית. עם זאת, ניבוי קונפורמציה ביו של פפטיד מחזורי הוא לא טריוויאלי. כדי להתגבר על האתגר הזה, גישה אטרקטיבית אחד אותו למסך ספרייה ממוקדת למסך שבו יש את כל פפטידים מחזורי עמוד השדרה באותו רצף ראשוני, אך שונות בפרמטרים המשפיעים על קונפורמציה, כגון גודל טבעת ומיקום.

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של פפטידים ספרייה מחזוריים עמוד השדרה מיקוד PPIs טפיל הספציפי. שימוש בגישה עיצוב רציונלים, שפיתחנו פפטידים הנגזרים מקולט eishmania L חלבון הפיגום לC-קינאז מופעל (חוסר). חוקרים שערנו כי רצפים בחוסר הנשמרים בטפילים, אבל לא בhomolog מארח היונקים, עשויים לייצג אתרי אינטראקציה לחלבונים שהם קריטיים ליכולת הקיום של הטפילים. פפטידים מחזוריים היו מסונתזים באמצעות קרינת מיקרוגל כדי להפחית את זמני תגובה ולהגדיליְעִילוּת. פיתוח ספרייה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה בגדלים שונים טבעת מאפשר מסך שיטתי לקונפורמציה הפעילה הביולוגית ביותר. שיטה זו מספקת דרך כללית, מהירה, וקלילה לסנתז פפטידים מחזוריים.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) לשחק תפקיד מרכזי ברוב התהליכים ביולוגיים, מהעברת אותות תאיות לתא המוות 1. לפיכך, מיקוד PPIs הוא בעל חשיבות עליונה למחקר בסיסי ויישומים טיפוליים. יכול להיות מוסדר על ידי PPIs נוגדנים ספציפיים ויציבים, אבל נוגדנים הם יקרים וקשים לייצר ויש זמינות ביולוגית ירודה. לחלופין, יכול להיות ממוקד PPIs על ידי מולקולות קטנות. מולקולות קטנות קלות יותר לסנתז וזולים בהשוואה לנוגדנים; עם זאת, הם יחסית פחות גמישים ולהתאים טובים יותר לחללים קטנים יותר לממשקי חלבון-חלבון גדול 2,3. מחקרים שונים הראו כי פפטידים, שהם פשוט יותר וזולים יותר מאשר נוגדנים וגמישים יותר ממולקולות קטנות, יכולים להיקשר ממשק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציוד וריאגנטים הכנה

  1. ציוד הכנה
    1. לבצע את כל הפעולות בתוך מנדף שימוש בציוד מגן אישי מתאים.
    2. כימי לסנתז פפטידים על תמיכה מוצקה באמצעות מיקרוגל פפטיד סינתיסייזר עם מודול נוסף של גלה מצויד בבדיקת טמפרטורה של סיבים אופטיים לשליטה כוח משלוח המיקרוגל בכלי תגובת טפלון (30 מיליליטר, עם frit זכוכית) או בפוליפרופילן חד פעמי מחסנית (12 מיליליטר, עם frit גס).
    3. לערבוב ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים את הפיתוח של ספרייה קטנה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה שמתמקדת PPIs החיוני של הטפיל שושנת יריחו ולפעול כסוכנים נגד פרזיטים (לסקירה על פפטידים המתמקדים ב- PPI כסוכנים נגד פרזיטים 87). באמצעות הסינתזה של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה רומן, pharmacophores נשמר בפיגום של גודל להארכה. הכוח של הספרייה הממוקדת המוצעת כאן הוא היכולת להשתנות גדלי פיגום פפטיד, ובמקביל לאפשר מידה מסוימת של חופש קונפורמציה מוגבלת באמצעות cyclization. הסינתזה שלמה של פפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסינתזה של ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים עמוד השדרה נגזרים מחלבון חוסר הטפיל שושנת יריחו באמצעות סינתיסייזר מיקרוגל אוטומטי לחלוטין מתוארת. ספרייה ממוקדת של פפטידים מחזוריים פותחה עם pharmacophores שימור וlinkers השונים. תוספת של linkers השונים כגון אנהידריד glutaric, אנהידריד succinic, חומצת adipic, חומצת pimelic, ליזין, ornithine, ואובניים בניין אחר יכולה לשמש כדי להגדיל את מגוון חלל קונפורמציה של פפטידים מחזוריים. הסינתזה של ספריית פפטידים מחזוריים ממוקדת מאפשרת לח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לורן ואן Wassenhove, Sunhee הוואנג, ודריה מושלי-רוזן לדיונים מועילים. העבודה נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות NIH מענק RC4 TW008781-01 C-רעיון (ניצוץ) לNQ היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ריאגנטים
תמיכה מוצקה, זירת החלקה אמיד AM שרף MLCBLBR-1330טעינה: 0.49 מילימול/גרם
Fmoc-Ala-OHAdvanced ChemtechFA2100
Fmoc-Arg (Pbf)-OHAdvanced ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAdvanced ChemtechFN2152
Fmoc-ASP (OBut) -OHAdvanced ChemtechFD2192
Fmoc-Cys (Trt) -OHAdvanced ChemtechFC2214
Fmoc-Gln (Trt) -OHAdvanced ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu (OtBu) -OHAdvanced ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHAdvanced ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHAdvanced ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHAdvanced ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHAdvanced ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHAdvanced ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHAdvanced ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHAdvanced ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHAdvanced ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHAdvanced ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHAdvanced ChemtechFT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHAdvanced ChemtechFW2527
Fmoc-Tyr(But)-OHAdvanced ChemtechFY2563
Fmoc-Val-OHAdvanced ChemtechFV2575
1-מתיל-2-פירולידינון (NMP)סיגמא328634<חזק>זהירות רעיל/דליק מאוד/מגרה.
N,N-Dimethylformamide (DMF)Alfa Aesar43465<חזק>זהירות רעיל.
השתמש ב-DMF באיכות גבוהה כדי למנוע תגובות לוואי כגון הסרת Fmoc כתוצאה מעקבות הדימתילאמין מפירוק DMF.
דיכלורומתאן (DCM)סיגמאD65100<חזק>זהירות
דיברומומתאן מזיק (DBM)סיגמאD41868<חזק>זהירות
חומצה טריפלואורואצטית מזיקה (TFA)SigmaT62200<חזק>זהירות
חומצה טריפלואורואצטית קורוזיבית/רעילה, בדרגת HPLC (TFA)Sigma91707<חזק>זהירות דיאתיאתר קורוזיבי/רעיל
סיגמא31690<חזק>זהירות
טריאיזופרופילסילן (TIS)סיגמאמאוד 233781<חזק>זהירות מים מגרים/דליקים
סיגמא270733בדרגת HPLC
בדרגת HPLC (ACN) ScientificA998-4<חזק>זהירות דליק/מגרה/מזיק
N,N-דיסופרופילאתילאמין (DIEA)Sigma3440<חזק>זהירות פיפרידין סיגמא קורוזיבי/דליק מאוד
W290807<חזק>זהירות סיגמא פירידין רעיל/דליק מאוד
270970<חזק>אזהרה אתנול דליק/מזיק
מאוד (EtOH)סיגמא459844<חזק>אזהרה 1-הידרוקסיבנזוטריאזול
הידראט (HOBt)סיגמא157260<חזק>זהירות דליק מאוד/מגרה/מזיק
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′ - tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)Sigma12804<חזק>זהירות מגרה/מזיק
בנזוטריאזול-1-לי-אוקסי-טריס-פירולידינופוספוניום הקספלואורופוספט (PyBOP)Advanced ChemtechRC8602<חזק>זהירות
נינהידריןסיגמא454044<חזק>זהירות מזיק
פנולסיגמאP3653<חזק>אזהרה אשלגן ציאניד קורוזיבי/רעיל
(KCN)סיגמא11813<חזק>זהירות רעיל מאוד
אשלגן הידרוקסיד (KOH)סיגמא221473<חזק>זהירות רעיל
N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)Sigma38370<חזק>אזהרה דליק/רעיל
4-דימתיל-אמינופירידין (DMAP)Sigma522805<חזק>אזהרה אנהידריד גלוטארי רעיל/מגרה
SigmaG3806<חזק>אזהרה סיגמא אנהידריד סוקסיני דליק/מגרה/מזיק
239690<חזק>אזהרה
מזיק חומצה אדיפיתA26357<חזק>אזהרה< חזק> חומצה פימלית רעילה/מגרה
סיגמאP45001<חזק>זהירות< חזק> סיגמא כלורניל רעיל/מגרה
23290<חזק>אזהרה<> רעיל/מגרה
אצטאלדהידסיגמא402788<חזק>זהירות דליק/רעיל
<חזק>ציוד
צנטריפוגהבקמן קולטראלגרה 6R צנטריפוגה
ליופילייזרLabconcofreezone 4.5
משאבת ואקוםפרנקלין אלקטריקדגם 1101101416 עם 3/4 כ"סאלקטל משאבה עם פרנקלין מוטור 
מחסנית פוליפרופילן 12 מ"להפרדה מיושמת2419
תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 12 מ"להפרדה מיושמת8157
מחסנית פוליפרופילן 3 מ"להפרדה מיושמת2413
תקע מכסה למחסנית פוליפרופילן 3 מ"להפרדה מיושמת8054
עצור PTFEהפרדה מיושמת2406
צינורות שטוחים, 50 מ"לVWR21008-240
סעפת מיצוי, 20 חיבורים, צינורות 16 x 100 מ"ממיםWAT200609
שייקר, מערבל נואטור BD אדמספישר מדעי22363152
Nalgene HDPE בקבוקי IP2 עם פה צר, 125  מ"לפישר סיינטיפיק03-312-8
בקבוק ארלנמאיירפישר סיינטיפיקFB-501, 500 מ"ל
בלוק חימוםתרמולין1760 אמבט
צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגילפישר סיינטיפיקט14-961-25
מיקרופיפטות וטיפים FinnpipetteThermo20– 200 ו-100– 1,000 μ l
בקבוקוני HPLC - מיקרו vl עמ' 400 ומיקרו; l PK100   VWR69400-124
בקבוקון HPLC- כחול Snap-It CapVWR66030-600
אנליטי HPLC טורPeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 µ m C18Q, קוטר פנימי 4.6 מ"מ 150 מ"מ
עמוד HPLC הכנה, XBridge ווטרסOBD C18 5 ומיקרו; עמודה m19 מ"מ ופעמים; ספקטרומטר מסה 150 מ"מ
Applied BiosystemsVoyager DE-RP 
צילינדר
מייבש
מערכת RP-HPLC אנליטית Shimadzu LC-20מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-20AD, דגימה אוטומטית SIL-20AC, מסיר גז DGU-20A5 (Shimadzu, MD, ארה"ב).
מערכת RP-HPLC הכנה Shimadzu LC-20מצוידת ב: בקר מערכת CBM-20A, גלאי SPD-20A, תנור עמודים CTO-20A, 2 x יחידת אספקת ממס LC-6AD ואספן שברים FRC-10A (Shimadzu, MD, ארה"ב).
דליק/מזיק , אצטוניטרויל, פישר מגרה סיגמא מגרה / דריחנקן

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Backbone Cyclic PeptidesMicrowave IrradiationProtein Protein InteractionsLeishmania ReceptorPeptide CyclizationSolid Phase SynthesisMass SpectrometryHPLC AnalysisAntiparasitic TherapeuticsConformational Diversity

Related Articles