מאמר שיטה

יצירה "אנושי" דרוזופילה S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

DOI:

10.3791/53594

⸱

20 בינואר 2016

 , 
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור קו תאים של דרוזופילה S2 הרגיש למעכבי מולקולות קטנות של קינזין-5. מתואר גם השימוש בתאים אלה בבדיקת תיקון שגיאות מבוססת תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קינטוכורים הם מבנים גדולים מבוססי חלבון המורכבים על צנטרומרים במהלך חלוקת התא ומקשרים כרומוזומים למיקרו-צינורות ציר. פיזור נכון של החומר הגנטי דורש שהקינטוכורות האחיות בכל כרומוזום יהפכו לדו-כיווניות על ידי היצמדות למיקרו-צינורות מקטבי ציר מנוגדים לפני שהם מתקדמים לאנאפאזה. עם זאת, מצבי התקשרות שגויים ולא דו-כיווניים הם נפוצים וקיימים מסלולים תאיים כדי לזהות ולתקן התקשרויות כאלה במהלך חלוקת התא. התהליך שבו אינטראקציות קינטוכור-מיקרו-צינוריות לא תקינות מתערערות מכונה תיקון שגיאות. כדי לחקור תיקון שגיאות בתאים חיים, חיבורים שגויים נוצרים בכוונה באמצעות עיכוב כימי של מנוע קינזין-5, מה שמוביל להרכבת ציר חד קוטבי, והמעבר מאוריינטציה לא נכונה לדו-כיוון נצפה לאחר שטיפת תרופות. המספר הגדול של כרומוזומים בסוגים רבים של תאי תרבית רקמה מהווה אתגר בהתבוננות באירועי תיקון שגיאות בודדים. דרוזופילה תאי S2 הם נושאים טובים יותר למחקרים כאלה מכיוון שיש להם רק 4 זוגות כרומוזומים. עם זאת, מעכבי קינזין-5 של מולקולות קטנות אינם יעילים נגד דרוזופילה קינזין-5 (Klp61F). כאן אנו מתארים כיצד לבנות קו תאי דרוזופילה שמחליף ביעילות את Klp61F בקינזין-5 אנושי, מה שהופך את התאים לרגישים לעיכוב פרמקולוגי של המנוע ומתאימים לשימוש בבדיקת תיקון שגיאות מבוססת תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרדה שווה של הגנום בעת חלוקת תא דורשת אינטראקציות נכונות בין microtubules DNA והציר המשוכפל. Microtubules אינטראקציה פיזי עם הכרומוזומים באמצעות הרכב של חלבונים שמרכיב בcentromeres הידוע כkinetochore 1. הפצה נכונה של הכרומוזומים דורשת שkinetochores אחותם bioriented, שבו כל אחות קשורה microtubules מקורם קטבי ציר הפוכים. microtubule Kinetochore (KT-MT) קבצים מצורפים שאינם בקונפורמציה bioriented הם ערערו במהירות וביעילות כדי לספק את ההזדמנות להקים biorientation בתהליך המכונה תיקון שגיאות. Assay תיקון שגיאות שהוקם בעבר בתאי יונקים 5 דורש הרכבת צירים monopolar באמצעות מעכבי מולקולה קטנים הפיכים נגד Eg5 (kinesin-5). הטיפול התרופתי מייצר שפע של קבצים מצורפים syntelic שגויים שבבוטkinetochores אחות h לצרף לאותו מוט הציר. כישלון הבא של התרופה מאפשר להדמיה של תהליך תיקון השגיאות. Assay תיקון שגיאות יכול להיעשות בנוכחות של מעכבי מולקולה קטנים או knockdowns ללמוד את התרומה של חלבוני מועמד לתיקון קבצים מצורפים KT-MT שגויים.

היכולת לדמיין תיקון שגיאות בתאים חיים היא כלי רב עוצמה כדי להבין את המנגנון המולקולרי מעורב בתהליך מורכב זה עוד יותר. עם זאת, המספר הגדול של כרומוזומים קיימים ברוב שורות תאים מציב אתגר בהתבוננות קבצים מצורפים KT-MT בודדים. תאי תסיסנית S2 יהיו אידיאליים ליישום assay תיקון שגיאות כפי שהם מכילים כמה כמו 4 כרומוזומים 6, אבל מעכבי מולקולה קטנים של kinesin 5 כגון S-trityl-L-ציסטאין (STLC) וmonastrol 7-9 אינו משפיע על הרכבה ציר או kinesin-5 תפקוד מוטורי בתאי תסיסנית. לכן אנו generaטד שורת תאי תסיסנית S2 להביע kinesin-5 האדם תחת אמרגן מושרה שהוא רגיש לkinesin-5 מעכבים. פרוטוקול זה מתאר כיצד מציאה homologue תסיסנית kinesin-5 אנדוגני, Klp61F, ולהשתמש בקו זה התא בassay תיקון שגיאות מבוססי התאים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תאי transfecting S2

  1. מ25 סנטימטר 2 בקבוק תרבית בעבר, להוסיף GFP-להביע טובולין α תאי S2 10 עד נפח סופי של 2 מיליליטר ב 100% confluency, ולאפשר להם חצי לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ ל כ 1 שעה.
  2. הסר את המדיה מהצלחת. Transfect 2 מיקרוגרם של Eg5-mCherry לבנות 11 עם 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר בתוספת 10% FBS (המכונה להלן בתקשורת של שניידר) וTransfection מגיב, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. לאטום את הצלחת עם Parafilm ו דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות.
  3. הוסף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר. חזור תאים 25 ° C חממה.
  4. ביום 3 לאחר transfection, להעביר 500 μl של תאי transfected לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה 35 מ"מ המכילה 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לאינדוקצית מבחן. לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. חותם את הצלחת בParafilm ולדגור על 25 מעלות CO / N.
  5. coverslip כדי להפוך coverslips מצופה concanavalin, מספיק נפח פיפטה של concanavalin פתרון (0.5 מ"ג / מיליליטר מומס בH 2 O) למעייל חומצה שטפה, להסיר את העודפים, ולאפשר את coverslip לייבוש באוויר.
  6. מניחים coverslip מצופה concanavalin x 22 מ"מ 22 מ"מ בצלחת תרבית רקמת 35 מ"מ נקייה, אז זרע 500 μl ב 100% confluency של התאים המושרה על coverslip ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה 1 ב RT.
  7. כדי לבדוק לביטוי Eg5-mCherry, להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי הדמיה מתאימים) עם תקשורת להדמיה ב RT על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש במקורות אור מתאימים ומערכות סינון לדמיין את התאים. לדוגמא, יש מיקרוסקופ השתמש במחקר זה מקור LED לבן אור וEGFP (FITC / Cy2) וDsRed (TRITC / Cy3) קוביות מסנן. Eg5-mCherry localizes לmicrotubules ומועשר Neaקטבי כישור r.
  8. לאחר שווידאת כי התאים מביעים שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, להעביר את שארית תאי transfected, uninduced לבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים המכיל 4 מיליליטר של התקשורת של שניידר.
  9. להוסיף Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מיליליטר לבקבוק של תאי transfected ולהמשיך פיצול בנוכחות של 25 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin S HCl עד המוות של תאים מפסיק להיות בטוח כדי לבדוק ביטוי של Eg5-mCherry מעת לעת. דגירה שורות תאים ב 25 מעלות צלזיוס חממה.
    הערה: אחוז התאים לבטא עליות Eg5-mCherry לאורך זמן.
  10. ברגע שתאי transfected ביציבות, תמשיך לפצל בהעדר התרופה ולהקפיא 12 תאים לשימוש עתידי.

הפרעת 2. RNA

  1. PCR להגביר אזור נ"ב ~ 500 של Klp61F מcDNA (LD15641) באמצעות פריימר עם רצף הוסיף אמרגן T7 (רצף שנקבע בחומרי רשימה) להיותמשמש כתבנית לסינתזת dsRNA.
    1. הגדר את ארבע תגובות PCR, 50 μl כל, המכילות DNA של תבנית 100 ng, 25 מיקרומטר של כל צבע יסוד, מאגר מתאים, ופולימראז. הגדר את פרוטוקול ה- PCR על thermocycler על פי הפרוטוקול של היצרן של פולימראז.
    2. בריכה וארבע תגובות נקיות PCR באמצעות PCR לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. אחסן את התבנית נקייה ב -20 ° C.
  2. הכן RNA גדילים הכפול (dsRNA) מתבנית בעזרת ערכת שעתוק RNA T7, הבאים להוראות היצרן. מצפה ~ ריכוז 5-15 מ"ג / מיליליטר של dsRNA. אחסן dsRNA ב -20 ° C.
  3. למציאת Klp61F עם dsRNA, מאפשר לתאים S2 להביע Eg5-mCherry בconfluency 25% ללמחצה לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ לשעה 1.
  4. הסר את המדיה מהמנות ולהוסיף 5 מיקרוגרם של dsRNA נגד Klp61F (דרוזופילה kinesin-5) מדולל ל1 מיליליטר של שניידר סרום ללא 'תקשורת של.
  5. לדגור על RT עבור שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר עם 10% FBS. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס.
  6. 24 שעות לאחר טיפול dsRNA, לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה עוד 24.

3. הדמיה של תא חי

  1. מניחים 22 מ"מ x 22 מ"מ concanavalin coverslip מצופה לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ נקייה.
  2. זרע 500 μl של התאים שטופלו בdsRNA ומושרה O / N על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק כ 1 שעה.
  3. להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי מתאים) להדמיה.
  4. מצא את תאי mitotic להביע שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין.
    הערה: תאי mitotic להביע GFP-α-טובולין רק צריך צירים monopolar מאז Klp61F, אשר נדרש לדו-קוטבי ציר, הוא הפיל 10,13.
  5. לאסוף תמונות של צירים דו קוטביים (למשל, 1 מסגרת לדקה) זמן לשגות בתאים המבטאים את שני Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין.
  6. בעוד הדמיה, להסיר את המדיה מתא הוורד, ולהחליף אותו בתקשורת של שניידר מכילה STLC 1 מיקרומטר מעל 3 חילופים רצופים תקשורת (~ 5 מיליליטר סה"כ) לתוך התא לדמיין קריסת ציר.
  7. לכישלון התרופה ולהפוך את קריסת הציר, להסיר בזהירות את התקשורת המכילה STLC מתא הוורד, ולשטוף בתקשורת של שניידר 4x (סה"כ 6-8 מיליליטר) לפני מילוי תא הוורד בפעם האחרונה עם תקשורת טרי. תמשיך הדמיה.

Assay תיקון 4. שגיאה

  1. מניחים 22 מ"מ x 22 מ"מ concanavalin coverslips מצופה לתרבות מנות רקמה 35 מ"מ נקיות.
  2. זרע 500 μl של תאים שטופלו בKlp61F dsRNA על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק.
  3. לאחר תאי adherאד, להוסיף 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לכל מנה להביא את הנפח הסופי עד 2 מיליליטר.
  4. לעצור את התאים במיטוזה, להוסיף MG132 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר לכל אחד מהכלים, ודגירה עבור שעה 1.
  5. להוסיף STLC 1 מיקרומטר דגירה עבור שעה 1 כדי לאפשר ליצירת מונופולים.
  6. לשטוף את STLC על ידי שטיפת coverslips פי 3 עם 2 מיליליטר של התקשורת של שניידר הטרי בכל פעם.
  7. דגירה coverslips עם התקשורת של שניידר, בנוסף לכל תרופות תרופתיות (למשל, מעכבי קינאז אורורה) או DMSO כביקורת.
    הערה: ריכוזי מונעי להשתנות וריכוזים סופיים נכונים צריכים להיקבע על ידי הנסיין. פתרונות מניות נעשים בדרך כלל כזה שהמעכב מדולל 1: 1,000 לתקשורת. במקרה זה דילול 1: 1000 של DMSO (או ממס מתאים) משמש כשליטה ברכב. אנו משתמשים ב מעכב אורורה Binucleine 2 בריכוז סופי של 40 מיקרומטר.
  8. תקן תאי T בנקודתי זמן שונהo לבחון את ההתקדמות של היווצרות ציר דו קוטבית ולהעריך מדינות מצורפים kinetochore. לתקן:
    1. מהירות לשטוף את coverslips עם 2 מיליליטר של 1x BRB-80.
    2. תקן תאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של paraformaldehyde 10% בדילול מלא 1x BRB-80 במשך 10 דקות. paraformaldehyde Pipet זהירות במנדף כימי.
    3. Permeabilize תאים עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 1% Triton-X במשך 8 דקות.
    4. לשטוף שקופיות 3x עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 0.1% Triton-X.
    5. העברת coverslips תא-צד עם הפנים כלפי מעלה על גבי גיליון של Parafilm (השתמש סמן כדי לתייג Parafilm כראוי כדי לעקוב אחר השקופיות) בצלחת פטרי 150 מ"מ.
    6. לכסות את coverslips עם 150 סרום μl מבושל חמור (BDS) ולדגור על RT עבור שעה 1 לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב.
      שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. כדי להפוך את תא הלחות, בשורה על שפת צלחת 150 מ"מעם מעבדה רטובה לנגב ומכסה במכסת צלחת פטרי.
    7. הסר בלוק, ודגירת coverslips עבור שעה 1 ב RT עם 150 μl של נוגדנים עיקריים מדולל כראוי בBDS להכתים לkinetochores וmicrotubules לריכוזים סופיים של 2 מיקרוגרם / מיליליטר (או על פי המלצות יצרן) ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה .
      שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.
    8. לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X.
    9. דגירה coverslips במשך 30-60 דקות ב RT עם נוגדני fluorophore מצומדות המתאימים המשניים המדולל בBDS.
    10. לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X.
    11. דגירה coverslips עם 150 μl של ה- BDS המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI ריכוז סופי למשך 5 דקות.
    12. לשטוף coverslips 2x עם 1x PBS + 0.1% Triton-X, והר גoverslips צד תא על שקופית 3x1 "עם 8 μl של ההרכבה תקשורת. צבע הפינות עם לק כדי לשתק את coverslips על גבי שקופיות.
  9. תאי תמונה עם צירים דו קוטביים שמביעים Eg5-mCherry. קח סדרת Z בהיקף של 30 מטוסים במרווחים 0.2 מיקרומטר בכל הערוצים באמצעות מטרת 100X. לנתח בזהירות את kinetochores וmicrotubules כדי לקבוע את המדינות מצורפים (bioriented או קבצים מצורפים syntelic).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klp61F נדרש כדי ליצור צירים דו קוטביים. Kinesin-5 האנושי, Eg5, יכול להציל את הפונקציה של Klp61F בתאי תסיסנית S2 (איור 1 א ו- D). עם תוספת של מעכב 5 kinesin (STLC), רמות microtubule הקשורים לירידה המוטורית (איור 1 ו- E), וקריסת הציר, וכתוצאה מכך מונופול (איור 1 ג וF) בתאים חסרי Klp61F אנדוגני על RNAi המוצלח (סרט נוסף 1). ראוי לציין כי צירים דו קוטביים יקרסו על תוספת של STLC בתאים אנושי S2 כי kinesin-5 פעילות אינה נדרשת לשמור על דו-קוטבי ציר בתאים אנושיים. פער זה עשוי להיות מעניין תוצאה מהבדלים בחפיפת microtubule interpolar ו / או יציבות במערכות מודל שני 14. ניתן Reve (איור 2 א ו- E) Kinesin-5 עיכוב rsed על ידי שטיפה את התרופה וההתאוששות של ציר דו קוטבי ניתן בעקבות לאורך זמן. עם הסרת המעכב (איור 2 ו- F), Eg5-mCherry מחדש מקורבים עם microtubules כמרכיב ציר דו קוטבי (איור 2C ו- G), ותאים יכולים להתקדם לanaphase דו קוטבית (איור 2 ד ו H, סרט נוסף 2 ).

figure-results-1
איור 1. תוספת של STLC 1 מיקרומטר מוביל לצירי monopolar בתאי תסיסנית S2. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (AC) וה- GFP-α-טובולין (DF) בתוספת של 1 מיקרומטר STLC. Eg5 המעכב נוסף בבית 3 דקות. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת = דקות: שניות. "Target =" _ w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. רפורמות ציר דו קוטביות עם הסרת STLC. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית 2 להביע Eg5-mCherry (AD) וה- GFP-α-טובולין (EH) במהלך ניסוי כישלון STLC. STLC היה דהוי ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת STLC. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת: דקות:. שניות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
"Target =" _ ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov blank "> סרט נוסף 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry ( משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). STLC 1 מיקרומטר התווסף ב -2 דקות, וצורות ציר מונופול בתוך 10 דקות לאחר תוספת של המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשנייה. בר סולם = 5 מיקרומטר.

figure-results-4
סרט נוסף 2. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). ומדיה המכילה STLC 1 מיקרומטר הוסרהלשטוף ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשניה. בר סולם = 5 מיקרומטר.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חזותי תיקון שגיאות היא טכניקה רבת ערך כדי ללמוד את הצעדים כרוכים בתהליך תאי חשוב ומורכב זו. לשם כך, קבצים מצורפים שגויים נוצרים באמצעות מעכבים הפיכים, ותיקון שגיאות נצפה על כישלון של התרופה. assay זה היה במקור פותח באמצעות תאים בתרבית רקמת יונקים 5. עם זאת נוכחותם של מספר הגדול של kinetochores בסוגים רבים של תאי יונקים מודל מציבה אתגר בהתבוננות אירועי תיקון שגיאות בודדים. תאי תסיסנית S2 יש כמה כמו 4 זוגות של kinetochores, מה שהופך אותם שורת תאים עדיפה יותר להתבוננות תיקון שגיאות. עם זאת, חסרון עיקרי הוא שמעכבים רבים אינם יעילים בתאי תסיסנית S2. לפיכך, את היכולת ליצור שורת תאי תסיסנית S2 אנושית להביע kinesin-5 אנושיים מספקת כלי רב ערך כדי ללמוד תיקון שגיאות.

למרות שתאי תסיסנית S2 יכולים להיותשורת תאים טובה יותר ללמוד תיקון שגיאות, השלבים המרובים הכרוכים בהשגת שורת התאים ודריסת גנים חיוניים מציבה כמה אתגרים לטכניקה זו. לדוגמא, יעילות transfection יכולה להיות נמוכה למדי. אם פחות מ -20% מהתאים המבטאים את Eg5-mCherry, transfection יש לחזור כתהליך הבחירה ייקח זמן רב יותר. כמו כן, אחוז תאי המבטאים שני חלבוני הניאון עלול להפחית לאורך זמן. זה ניתן להתגבר על ידי פיצול תאים בנוכחות Blasticidin S HCl וhygromycin B כדי לבחור עבור תאים לבטא Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, בהתאמה. כמו כן, חשוב לשים לב שיש לי תאי תסיסנית S2 orthologues לחלבונים רבים ואנושיים; לכן, זה קריטי, כדי לייעל את התנאים למציאת החלבונים אנדוגניים. תנאי מציאה אופטימליים עשויים להשתנות בסך של dsRNA ומשך טיפול. בהתחשב בהופעתה והשיפור המהיר של CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, דור של שורת תאי תסיסנית עם גן Klp61F הוחלף על ידי Eg5 אדם מציג חלופה רבת עוצמה שהיה להתגבר על המגבלות של transfection וגישת מציאה. העבודה שלנו מוכיחה כי לטוס לאדם החלפת גן צריך להיות אפשרות מעשית במקרה זה למרות שהחומרים כימיים הדרושים כדי לעשות זאת בתאי תסיסנית S2 כרגע בשלבי פיתוח.

הליך זה אינו מוגבל לEg5, אבל יכול להיות מיושם ללמוד את הפונקציה של חלבונים אחרים בעלי עניין. אם באמצעות מעכבים שהעבר הוקם כדי להיות יעיל בתאי תסיסנית S2, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של מעכבים בתאים חיים חששות לגבי השפעות היעד בלי. שורת התאים הופקה באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם בהקרנת תפוקה גבוהה מנתח לזהות תרופות פוטנציאליות מיקוד חלבונים מעורבים בתיקון שגיאות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לפטרישיה Wadsworth על המתנה של מבנה kinesin-5. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (5 R01 GM107026) לTJM ועל ידי מענק מחקר מס '5-FY13-205 מהמצעד הפרוטות קרן לTJM, כמו גם תמיכה מקרן צ'רלס ה' הוד, Inc, בוסטון, מסצ'וסטס. לTJM

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב טרנספקציה אפקטיביQiagen301425
Klp61F cDNADrosophila Genomic Resource Center13690שם הגן LD15641
שניידר' s MediaInvitrogen21720-024
סרום בקר עוברי, מאושרInvitrogen10082-147מומת בחום, נחושת
(II) סולפט ממקור אמריקאי (CuSO4)SigmaC8027-500G500  מלאי
mM S-trityl-L-cysteineSigma164739-5G1  מלאי mM ב DMSO
Blasticidin HClInvitrogenR210015  מלאי מ"ג/מ"ל ב-1x PBS
Hygromycin BInvitrogen10687010
T7 מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדולPromegaP1320ריכוז ה-dsRNA המשוער מכל תגובה הוא כ-5-15  ומיקרו; g/µ l
Klp61F RNAi F פריימרInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTAAAA
Klp61F RNAi R פריימרInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR ערכת ניקויBio Laboratories, Inc1250
Concanavalin ASigmaC52750.5  תמיסת מ"ג/מ"ל המיוצרת על ידי המסה ב-1x PBS.
סרום חמור מבושלJackson ImmunoResearch Labs017-000-121תמיסת מלאי 5% במאגר PHEM 1x, מביאים את התמיסה לרתיחה. מאוחסן ב-4  °C.
הרכבה20  מ"מ טריס pH 8.0,  0.5% N-פרופיל גלאט, 90% גליצרול. מאוחסן ב-4  °C.
1x צינורות BRB-8080 מ"מ pH 6.9; 1  מ"מ EGTA; 1 mM MgCl2
White אור מקורLumencor Inc
ET EGFP קוביית מסנןChroma49002
DSRed קוביית מסנןChroma49005
אנטי-NDC80 נוגדן מיוצר בהתאמה אישית על ידי Maresca Lab
DM1α (אנטי-אלפא;-טובולין)SigmaT6199
נוגדן נגד CIDAbCamab10887
Mo מדיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2(2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187(2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila S25KLP61FEg5 mCherrySTLC

מאמרים קשורים