Method Article

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג'ל Bioink

DOI:

10.3791/53606

⸱

April 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest Univeristy Health Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שמאפשרים bioink הידרוג'ל המחקים רקמות שבה פונקציונלי קיימא בונה רקמות 3-D ניתן bioprinted לשימוש ביישומי הקרנה במבחנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדפסה ביולוגית התגלתה כגישת ייצור ביולוגי רב-תכליתית ליצירת מבני איברים מהונדסי רקמות. למבנים אלה יש שימוש פוטנציאלי כתחליף איברים להשתלה בחולים, וגם, כאשר הם נוצרים בקנה מידה קטן יותר כמודל "אורגנואידים" שניתן להשתמש בהם במערכות מבחנה לבדיקת תרופות וטוקסיקולוגיה.

למרות הפיתוח של מגוון רחב של התקני הדפסה ביולוגית, היישום של טכנולוגיית הדפסה ביולוגית יכול להיות מוגבל על ידי הזמינות של חומרים המזרזים הליכי הדפסה ביולוגית ותומכים בכדאיות התא ובתפקודו על ידי מתן רמזים ספציפיים לרקמה. כאן אנו מתארים חומצה היאלורונית רב-תכליתית (HA) ומערכת הידרוג'ל מבוססת ג'לטין המורכבת מפרוטוקול הצלבה רב-שלבי, שיכול לספק אותות ביוכימיים ספציפיים לרקמות ולחקות את התכונות המכניות של רקמות in vivo.

גורמים ביוכימיים מסופקים על ידי שילוב חומרי מטריצה חוץ-תאיים שמקורם ברקמות, הכוללים גורמי גדילה חזקים. מאפיינים מכניים של רקמות הם שילובים מבוקרים של קישורים צולבים מבוססי PEG עם משקלים מולקולריים משתנים, גיאומטריות (ליניאריות או מרובות זרועות) וקבוצות פונקציונליות כדי להניב דיו ביולוגי הניתן לשחול וערכי קשיחות גזירה של מבנה סופי בטווח רחב (100 Pa עד 20 kPa). באמצעות פרמטרים אלה, נעשה שימוש בדיו ביולוגי הידרוג'ל להדפסה ביולוגית של ספרואידים ראשוניים בכבד בדיו ביולוגי ספציפי לכבד כדי ליצור מבני כבד במבחנה עם כדאיות תאים גבוהה ותפוקת אלבומין ואוריאה פונקציונלית מדידה. מתודולוגיה זו מספקת מסגרת כללית הניתנת להתאמה אישית עתידית של הידרוג'לים לייצור ביולוגי של מגוון רחב של סוגי מבני רקמות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, במגוון טכנולוגיות הפך זמין מתייחס לצורך המקורות חלופיים של איברים ורקמות תפקודיים על ידי המבקש לייצר, או biofabricate, אותם. Bioprinting התפתחה כאחד המבטיחים ביותר של טכנולוגיות אלה. Bioprinting יכול להיחשב כסוג של ייצור כתוסף רובוטית של חלקים ביולוגי, שניתן להשתמש בהם כדי לבנות או מבנים איבר דמוי או מרקמה דמוית דפוס קיימא ב 3 מימדים. 1 ברוב המקרים, bioprinting מעסיקה 3-ממדי (3 -D) תקן ההדפסה כי היא נוהלה על ידי מחשב להפקיד תאים וחומרים ביולוגיים לעמדות מדויקות, ובכך משחזרים ארכיטקטורות פיסיולוגיות-מחק אנטומית. 2 התקנים אלה להדפיס "bioink", אשר יכול ללבוש הצורה של אגרגטים תא, תאים גלומים הידרוג או ונוזלים צמיגים, או microcarriers תא זרע, כמו גם פולימרים ללא תאים המספקים מבנה מכאני או לפעול PLA תא ללאceholders. 3,4 בעקבות תהליך bioprinting, המבנה וכתוצאה מכך ניתן התבגר לתוך מבנים רקמה או איבר פונקציונלי, ומשמש ליישום הסוף המיועד. 5,6 עד כה, איבר אנושי בגודל תפקודי מלא לגמרי לא הודפס, אבל זה נשאר המטרה ארוכת הטווח העיקרית של bioprinting מחקר ופיתוח. 2 עם זאת, בקנה מידה קטן "organoid" בונה רקמות מיושמים כיום מספר יישומים, כולל מודלים פתולוגיה, פיתוח תרופות, והקרנת טוקסיקולוגיה.

אחד המכשולים העיקריים כי חוקרים נתקלו ביישום טכנולוגית bioprinting הוא כי חומרים מעטים פותחו לצורך bioprinting המפורש. כדי להצליח ביעילות bioprinting, ביולוגי חייבים לעמוד 4 דרישות בסיסיות. ביולוגי צריך להיות 1) תכונות מכניות שראוי לאפשר בתצהיר (אם זה שחול דרך נחיר כג'ל או אניnkjet כמו טיפה), 2) את היכולת להחזיק את צורתו כמרכיב של מבנה 3-D לאחר בתצהיר, 3) את היכולת למשתמש שליטה של ​​2 המאפיינים המוקדמים, ו 4) סביבה ידידותית ותומכת תא בכלל שלבי הליך bioprinting. 7 הסטוריים, bioprinting עבודה ניסו לעתים קרובות להעסיק biomaterials המסורתי קיים במכשירי bioprinting ללא תמורה עבור התאימות שלהם, במקום בעיצוב ביולוגי יש את המאפיינים דרושים bioprinting ויישומים שלאחר ההדפסה הבאות.

מגוון bioinks פותח לאחרונה ממשק טוב יותר עם החומרה בתצהיר ייצור. מערכות הידרוג'ל תקן מציבות בעיות משמעותיות משום שהם קיימים בדרך כלל כמו גם מבשרים פתרונות נוזלים עם תכונות מכאניות מספיק, או הידרוג'ל polymerized שאם מודפס יכול לסתום פיות או להיות שבור על תהליך שהחול. הצוות שלנו, כמו גם וטיהורrs, בחן ניסוחים הידרוג'ל שונים כדי לטפל בבעיות bioprinting אלה, כולל הדפסת אליפטית תא לתוך מצעים הידרוג'ל, 5,8 תא נימת הידרוג'ל שחל משפופרות microcapillary, 9-11 חומצה היאלורונית extrudable (HA) הידרוג ננו-חלקיקי -gold עם תכונות crosslinking דינמיות , 12 שליטה זמנית של קשיחות הידרוג'ל באמצעות photopolymerizable methacrylated HA ו ג'לטין, 13 crosslinking פיברינוגן מבוסס-תרומבין, 14,15 ג'ל אלגינט-קולגן חליפין יוניים, 16 ואור אולטרה הסגול polymerizing המהירה לאחרונה (UV) crosslinking -initiated, 17

דוגמאות אלה להוכיח את ההיתכנות של חומרים ליצירה שיכולה ידי bioprinted ביעילות. עם זאת, בנוסף לאינטגרציה עם חומרה, כדי ליצור קיימא ופונקציונלי 3-D רקמה בונה בהצלחה, בביו-חומרים חייבים לכלול רמזי ביוכימיים מכנים מסייעות בשמירה הסלולרכדאיות ותפקוד. גורמים נוספים אלה, פרופילי ביוכימיות מכאניים, יכולים להיות השפעה משמעותית על התפקוד המוצלח של מבני רקמות bioprinted.

שני התאים ואת תאי מטריקס הילידים (ECM) אחראי הצגת מגוון רחב של מולקולות איתות כגון גורמי גדילה וציטוקינים אחרים לתאים אחרים. השילוב של אותות אלה משתנה בין רקמה לרקמה, אבל יכול להיות מאוד חזק ובעל השפעה בויסות התנהגות תאים ורקמות. 18 העסקת רכיבי ECM ספציפי רקמות מאיברים שונים ויישום בתור הידרוג'ל או כחלק הידרוג'ל נחקר עם הצלחה. 19-21 גישה זו, אשר מורכבת decellularizing רקמה נתון, מפוררת את זה, ואת פירוקה, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר אותות ביוכימיים רקמות ספציפיות מכל רקמות ניתן לשלב בונה הידרוג'ל 3-D. 22

בנוסף,שהיא מתועדת בהרחבה כי ורקמות בגוף לכבוש מגוון רחב של stiffnesses. 23 ככזה, את היכולת לכוון את התכונות המכאניות של חומרים ביולוגיים, כגון E מודולוס אלסטיות 'או ז מודולוס אלסטיות גזירה', הוא כלי שימושי בהנדסת רקמות . כפי שתואר לעיל, שליטה על תכונות מכאניות bioink מאפשרת biofabrication שחול מבוסס באמצעות ג'ל רך, אז מה שיכול להשפיע עוד יותר על ידי crosslinking המשנית בשלב מאוחר יותר, שבו רמות מודולוס אלסטיות ניתן להשיג שתואמות מן סוג איבר המטרה. לדוגמא, חומרים ביולוגיים יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים נוקשות של 5-10 kPa כמו כבד ילידים, 23 או להתאים נוקשות של 10-15 kPa כמו ברקמת לב ילידים, 24,25 בתאורית הגדלת היכולת של organoids אלה לתפקד באופן דומה עמיתיהם רקמות מולדתם. ההשפעה של קשיחות הסביבה על פנוטיפ התא כבר explored בשנים האחרונות, במיוחד ביחס לתאי גזע. אנגלר et al. מפגין גמישות המצע כי סייעה נהיגה בתאי גזע mesenchymal (MSC) כלפי שושלות עם גמישות רקמת ההתאמה של המצע. 25 רעיון זה נחקר נוסף לבידול לתוך שריר, תפקוד לב, פנוטיפ הכבד, התפשטות תאי גזע hematopoietic , ותחזוקה של פוטנציאל הטיפולי של תאי גזע. 24,26-29 יכולת לכוון הידרוג'ל כדי moduli אלסטי השונה היא תכונה חשובה של ביולוגי אשר ישמש כדי biofabricate בונה רקמות. 30

כאן אנו מתארים פרוטוקול מייצג גישה תכליתית המשמשת במעבדה שלנו לגבש מערכת הידרוג'ל שניתן שחול bioprinted, והוא מותאם אישית כדי 1) מכיל את הפרופיל הביוכימי של סוג רקמה מסוים ו -2) לחקות את מודולוס האלסטיות מסוג זה רקמה . על ידי טיפול בדרישות אלה, אנו שואפים provide חומר שיכול לשחזר את מאפייני physiochemical וביולוגיים של in vivo רקמה. 31 המערכת מרוכבי הידרוג'ל מודולרית המתוארת כאן מנצלת בגישה רבה-crosslinking להניב bioinks extrudable, ומאפשרת crosslinking משני לייצב ומגבירה את הנוקשות של מוצרי קצה להתאים מגוון של סוגי רקמות. התאמה אישית ביוכימיים מתקיימת באמצעות רכיבי ECM רקמות ספציפיות. כמו הפגנה, אנו מעסיקים מגוון כבד ספציפית של מערכת הידרוג'ל זה bioprint בונה organoid כבד פונקציונלי. הפרוטוקול המתואר משתמש במכשיר bioprinting מותאם אישית 3-D. באופן כללי, פרוטוקול זה ניתן להתאים רוב המדפסות מבוססות שחול, פרמטרי הדפסה ספציפיים להשתנות באופן דראמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים בדיקה על ידי המשתמש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פורמולציות Bioink הידרוג'ל והכנה

  1. על מנת לספק פרופילים ביוכימיות רקמות ספציפיות, להכין רקמות ספציפיות ECM לעכל פתרונות כפי שתוארו לעיל עבור כבד. 20
    הערה: באופן כללי, זה ECM לעכל יהוו 40% מנפח bioink הידרוג'ל הסופי כי הוא מועסק. כמה מאות מיליליטרים של פתרון ECM לעכל יכול להיות מוכן, aliquoted, קפוא ב -80 ° C לשימוש עתידי.
  2. לפני הידרוג'ל ניסוח, להמיס photoinitiator, 2-הידרוקסי-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone, במים ברמה של 0.1% w / v.
    הערה: כרכים בטווח 50-100 מ"ל ניתן להכין מראש ולאחסן מוגן מפני אור על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
  3. כדי ליצור bioinks הידרוג'ל, ראשון לפרק את מרכיבי חומר בסיס מן החומצה ההיאלורונית הערכות הידרוג'ל (HA) בפתרון המים photoinitiator.
    1. ממיסים את הג'לטין HA ו thiolated thiolated בנפרד במים-pפתרון hotoinitiator (שלב 1.2) לעשות 2% w / פתרונות v.
    2. ממיסים diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA), את crosslinker ב ערכות הידרוג'ל, בתמיסה במים photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v.
    3. ממסי פוליאתילן גליקול (PEG) אלקין 8-Arm (10 kDa MW) בתמיסת מי photoinitiator (שלב 1.2) כדי להפוך פתרון 8% w / v.
  4. באופן כללי, ליצור הידרוג באמצעות הסכימה הבאה, אם כי התאמה אישית נוספת אפשרית.
    1. שלב 4 חלקים 2% thiolated HA, 4 חלקים ג'לטין 2% thiolated, 1 חלק crosslinker 1, 1 חלק crosslinker 2 עם פתרון ECM 8 חלקים רקמות התקשורת והתרבות 2 חלקים hepatocyte (HCM) (או 10 חלקים מים כמו-רקמות שאינן גנריות הידרוג'ל -specific).
      הערה: נוסף ללא שינוי HA או ג'לטין ניתן להוסיף כדי להפוך את extrude bioink בצורה חלקה יותר. זה מתואר להלן.
  5. וורטקס את התערובת וכתוצאה מכך על גבוהה (מהירות 10 מתוך 10) במשך 10 שניות כדי לערבב לפני השימוש.
  6. השימוש הידרוג'ל bioink
    1. עבור שחול או בדיקות bioprinting, להעביר את התערובת לתוך מחסנית מזרק או מדפסת ולאפשר לו crosslink ספונטני למשך 30 דקות (crosslinking שלב 1) על 37 מעלות צלזיוס.
    2. עבור מדידות rheological, להעביר את התערובת לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ ולאפשר לו crosslink למשך 30 דקות.
      הערה: התערובת מייד מתחילה crosslink דרך היווצרות קשר תיאול-acrylate תתחיל להגדיל צמיגות. התערובת צריכה להיות מועברת מזרק, מחסנית הדפסה, או מיקום היעד בתוך 10 דקות כדי למנוע סתימת פיפטה או מזרק במהלך העברה.
    3. כאשר crosslinking המשנית (שלב 2) היא רצויה, מקרין את הבמה 1-crosslinked הג'לי עם אור אולטרה סגול (365 ננומטר, 18 W / 2 סנטימטר) ליזום תגובת פילמור אלקין-תיאול.
      הערה: משך ההקרנה תלוי שטח הפנים של החומר. באופן כללי, סנטימטר מרובע של חומר רק דורש 12 שניות של חשיפה UV בהספק UV זה.

2. בדיקת תאימות מדפסת

  1. לפני בדיקות אינטגרציה עם מכשירי bioprinting, מאפייני שחול מבחן על ספסל המעבדה עם בדיקות שחול פשוטות באמצעות מזרקים סטנדרטיים טיפי מחט מד קטנים (20-30 מד).
    1. דחוף את bioink באמצעות מזרק סטנדרטי להשיג חוטים מעוקמים בצורה חלקה של הידרוג'ל עם מעט או ללא בליטות. לשיחול של קווים או דפוסים פשוטים מספיק כדי לקבוע את מידת ההצלחה.
  2. לשילוב bioprinter, לטעון bioink ההכנות ידי pipetting אותם לתוך דיו למדפסת, ולאפשר 30 דקות עבור bioink לעבור crosslinking שלב 1 ספונטנית בתוך המחסנית.
    הערה: נפח של bioink תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. מחסניות מדפסת עשויות להיות דומות או להיות מזרקים התואמים את מכשיר bioprinter.
  3. הערכת תאימות שחולעבור bioprinting ידי הדפסת דפוס פשוט באמצעות bioink. לדוגמה, להדפיס דפוס 7 x 7 מ"מ המורכב של קווים מקבילים. החל הלחץ (למשל, 20 kPa לחץ פנאומטי) ואילו ראש ההדפסה זז במישור XY במהירות של כ 300 מ"מ / דקה.
    הערה: בקטרי זרבובית ראש הדפסה בגדלים שונים ניתן להשתמש, אך חרירי חרוטים עם פתחים בקוטר 400-500 מיקרומטר הם אופטימליים עבור הדפסת spheroids בטווח 250-350 מיקרומטר.
    1. אם החומרים מעוקמים הם גבשושיים או לא סדירים, ראה שלב 2.4, או להפחית את כמות PEGDA כדי לרכך את חומר crosslinked שלב 1. כראוי ניסוחי bioink מוכנים extrude חלק, המאפשרים בתצהיר מדויק בדפוסים רצויים או ארכיטקטורות.
      הערה: ההליכים bioprinting והשימוש בו המתוארים מכשיר מותאם אישית 3-D bioprinting נועד בבית במיוחד עבור רקמות לבנות הדפסה 32 כפרמטרים הדפסה כגון, הספציפיים משתנים באופן דרמטי עבור כל סוג של מכשיר ודורשים כיול.g על ידי המשתמש.
  4. כדי לשפר את תכונות שחול, להשלים ללא שינוי HA ו ג'לטין אל bioinks (1.5 מ"ג / מ"ל ​​ו -30 מ"ג / מ"ל, בהתאמה).

3. אימות ידי Bioprinting עם בונה כבדה ראשונית

  1. כן 3-D spheroids הכבד תא ראשוני בתליית שיטות ירידה כמרכיב הסלולר 33
    הערה: Bioprinting יכול להתבצע ללא spheroids, אבל במקום עם תאים בודדים המרחפים bioinks הידרוג'ל גם כן. Spheroids מועסקים כאן כדי להאיץ אינטראקציות תאים תאים ולבנות פונקציונליות. מספר spheroids או התאים מועסקים תלוי ביישום הספציפי צריך להיקבע על ידי המשתמש. פעולות אלה אמורות להתבצע בתנאים סטריליים, באמצעות אספקה ​​סטרילית.
    1. כן HCM על ידי הוספת התוכן המופשר של ערכת רכיב תוספת HCM לתקשורת הבזליים hepatocyte (HBM) וסינון סטרילי.
      1. הפשרת un רכיבי תוספתtil נוזלי.
      2. מוסיפים את הרכיבים תוספת (חומצה אסקורבית, 0.5 מ"ל; אלבומין בסרום שור [חומצות השומן החופשיות], 10 מ"ל; גנטמיצין B סולפט / amphotericin, 0.5 מ"ל; הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 0.5 מ"ל; אינסולין, 0.5 מ"ל; גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי , 0.5 מ"ל; העברת, 0.5 מ"ל) ל -500 מ"ל HBM.
      3. סינון סטרילי דרך פילטר מיקרומטר 0.45 מיקרומטר או 0.22 באמצעות יחידת מסנן בקבוק העליונה או מסנן קצה המזרק.
    2. לקבוע את צפיפות התאים של hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate ידי ספירת על hemocytometer לאחר כל סוג תא הופשר פי הוראות היצרנים.
    3. שלב hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, תאים Kupffer, ותאי stellate המאופיינים ביחס 80:10:10 על ידי מספר הסלולרי במדיה HCM כי כבר חימם עד 37 מעלות צלזיוס צינור חרוטי.
      הערה: היקף בתקשורת לשמש תלוי את מספר הסלולרי הכולל ספציפי לבקשה צריך להיקבע על ידי הדואר אלקטרוני למשתמש.
    4. צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 520 XG ב 20 ° C.
    5. לשאוב supernatant, משאירים מאחור את התא גלולה.
    6. Resuspend התא גלולה בתקשורת HCM להניב ההשעיה תא המכיל 1,000 תאים לכל 40 מדיה μl. הנפח הכולל תלוי במספר spheroids שיופק.
    7. מעבירים את ההשעיה תא צלחות Drop Hanging בפורמט 96-היטב. להוסיף סך של כ 1,000 תאים לכל היטב HCM ולשמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 ימים שבמהלכה יוצר spheroids רב-תאי.
    8. אסוף spheroids הכבד מהצלחת Drop Hanging באמצעות pipettor. מעבירים צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי.
  2. spheroids הכבד Bioprint ב bioink הידרוג'ל הכבד ספציפי
    1. הכן גיבוש bioink הידרוג'ל ECM המכיל כבד כמתואר שלב 1, העסקת 8% PEGDA ו -8% 8-Arm אלקין PEG כפי crosslinkers. השתמש השילוב הזה עבור היכולת שלה resulting בתוך הידרוג'ל קרוב מודולוס אלסטיות גזירת רקמת כבד ילידים.
    2. תן spheroids ליישב לתחתית של צינור החרוטים שבו הם הונחו שלב 3.1.7. זה משתנה בהתאם לגודל וצפיפות אליפטית, אך בדרך כלל מתרחש בתוך 1-2 דקות. הסר את כל התקשורת על ידי aspirating או עם pipettor בזהירות.
    3. מעבירים את העוצמה הרצויה של פתרון הידרוג'ל bioink מוכן טרי אל צינור חרוטי המכיל את spheroids. באופן כללי, נפח מתאים הוא 10% -25% יותר מאשר הנפח של לבנות 3-D המיועד להדפסה. בזהירות פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend הספרואידים בפתרון הידרוג'ל bioink. מעבירים מחסנית bioprinter באמצעות pipettor או פיפטה סרולוגיות.
    4. בתוך המחסנית bioprinter, לאפשר הפתרון לעבור לשלב crosslinking הראשון (התגובה תיאול-acrylate) למשך 30 דקות.
      הערה: בהתאם לגודל אליפטית, המחסנית ייתכן שתהיה צורך לאט לסובב או התוכן ייתכן שיהיה צורך מהולמרית סטרילי כדי לשמור על spheroids מופצים ברחבי bioink במהלך crosslinking שלב 1. זהו פחות של הכרח bioinks מוכן עם תאים מושעים במקום spheroids.
      הערה: בעקבות crosslinking שלב 1, למשתמשים יש חלון הפעלה של כמה שעות. עם זאת, מומלץ לבצע את תהליך bioprinting במהירות כדי לשפר את כדאיות התא.
    5. בעקבות crosslinking שלב 1, השתמש בהתקן bioprinting ליצור מבנים הידרוג'ל רצויים המכילים את spheroids הכבד הראשוני (או תאים אחרים).
      הערה: טכנולוגיה זו מספקת מערכת biofabricating מגוון רחב של מבנים. פרמטרים כגון נפח הכולל, מספר התאים או spheroids, גיאומטרית המבנה המודפסת, ואת מצע שעליו בונה מודפסות הם תלויים במידה רבה על המטרות של המשתמש.
    6. לאחר בתצהיר לתוך התצורה המבוקשת, לנהל אור UV למשך 2-4 שניות כדי להפעיל את מנגנון crosslinking המשני, ייצוב השיתוףnstructs וקשיחות הגדלה לרמה הרצויה.
      הערה: ריכוז-אלקין PEG, ובכך צפיפות crosslinking הסופית הכוללת, בעיקר שולטת קשיחות המבנה הסופי.
    7. חזור על שלבי 3.2.4 ו 3.2.5 כדי ליצור מבנים רבים-שכבתיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר ההליכים המתוארים לעיל הוא אחריו בצורה נכונה, הידרוג צריך להכיל פרופיל ביוכימיים ספציפי לסוג רקמת היעד, 20 לאפשר רמה גבוהה של שליטה על bioprinting מודולוס אלסטיות סופי, 34 ולתמוך תאים פונקציונליים קיימא בונת רקמות.

התאמה אישית הידרוג'ל
כדי כבד היליד לחקות טובים ביותר, bioink הידרוג'ל נוסף פתרונות ECM ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר מרכיבים חיוניים שכדאי להביא בחשבון כאשר מנסים biofabricate בונה רקמות 3-D, לשימוש עתידי בבני אדם או עבור יישומים ההקרנה חוץ גופית. העסקת מרכיבים תאיים המתאים קובע את הפונקציונליות הפוטנציאל בסופו של דבר, כאשר המכשיר biofabrication עצמו קובע את המתודולוגיה הכללית להשגת מבנה סוף. המרכיב השלישי, ביולוגי, חשוב לא פחות, כפי שהוא משמש תפקיד כפול. באופן ספציפי, המרכיב הביולוגי חייב להיות תואם הוא את חומרת biofabrication (כלומר, bioprinters) וגם לתמוך רכיבי תא ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים בתודה להכיר במימון הסוכנות הפחתת האיום הביטחון (DTRA) תחת שטח וחיל הים Warfare מערכות מרכז השקט (PACIFIC SSC) חוזה מס N6601-13-C-2027. פרסום חומר זה אינו מהווה אישור על ידי הממשלה של ממצאים או מסקנות בזאת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה היאלורוניתSigma53747
ג'לטיןSigmaG6144
2-הידרוקסי-4&פריים;-(2-הידרוקסיאתוקסי)-2-מתילפרופיופנוןערכת
HyStem-HP)ערכת ESI-BIOGS315מכילה את הרכיבים Heprasil (חומצה היאלורונית עם תיולציה והפרין), Gelin-S (תיולציה ג'לטין), ואקסטרלינק (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10  kDaCreative PEGWorksPSB-887
הפטוציטים אנושיים ראשונייםמעבדות מחקר משולשHUCPM6
תאי כוכב ראשוניים בכבד אנושיScienCell5300
תאי קופפר אנושיים ראשונייםחייםHUKCCS
הפטוציטים מדיה בזאלית (HBM)LonzaCC-3199
הפטוציטים מדיה ערכת תוסף תזונהLonzaCC-3198HCM SingleQuot (מכילה חומצה אסקורבית, 0.5  מ"ל; אלבומין סרום בקר [ללא חומצות שומן], 10  מ"ל; גנטמיצין סולפט/אמפוטריצין B, 0.5  מ"ל; הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינט, 0.5  מ"ל; אינסולין, 0.5  מ"ל; גורם גדילה אפידרמיס רקומביננטי אנושי, 0.5  מ"ל; העברה, 0.5  מ"ל)
טריטון X-100סיגמאT9284יצרנים אחרים בסדר.
אמוניום הידרוקסידפישר סיינטיפיקA669יצרנים אחרים בסדר.
רקמת גופת חזיר טרייהn/an/a
ליופילייזרכלn/a
טחנת מקפיאכלn/a
מדפסת ביולוגיתn/an/aהמדפסת הביולוגית המתוארת כאן נבנתה בהתאמה אישית בבית. באופן כללי, מכשירים אחרים מתאימים בתנאי שהם תומכים בהדפסה מבוססת שחול מבוקרת מחשב של חומרי הידרוג'ל.
צלחת תרבית תאי טיפה תלויהInSpheroCS-06-001InSphero GravityPlus פלטפורמת תרבות תלת מימד
הידרוג'ל חומצה היאלורונית וג'לטין סיגמא 410896 ( טכנולוגיות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
  2. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
  3. Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
  4. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
  5. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
  7. Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
  10. Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
  11. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105(2014).
  12. Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
  13. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
  14. Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
  15. Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001(2013).
  16. Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
  17. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
  18. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  19. Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
  20. Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
  21. Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
  22. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935(2014).
  23. Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
  24. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
  25. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  26. Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
  27. Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
  28. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  29. Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
  30. Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
  31. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
  32. Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. , 2012/00889238 A1 (2011).
  33. Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
  34. Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
  35. Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
  36. Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
  37. Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
  38. Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
  39. Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
  40. Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
  41. Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
  42. Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
  43. Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
  44. Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
  45. Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
  46. Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BioprintingHydrogel BioinkTissue specific HydrogelExtracellular MatrixLiver SpheroidsConfocal MicroscopyUV CrosslinkingPEG CrosslinkersHyaluronic AcidGelatin based Hydrogel

Related Articles