באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Dustin R. Morado; Bo Hu; Jun Liu

doi:10.3791/53608

Method Article

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

DOI:

10.3791/53608

⸱

January 30th, 2016

Dustin R. Morado¹ , Bo Hu¹ , Jun Liu¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (Cryo-ET) היא טכניקת הדמיה תלת מימדית (תלת מימדית) רבת עוצמה להדמיית קומפלקסים מקרומולקולריים בהקשר המקורי שלהם ברמה המולקולרית. הטכניקה כוללת תחילה שימור הדגימה במצבה המקורי על ידי הקפאה מהירה של הדגימה בקרח זגוגית, לאחר מכן איסוף סדרה של מיקרוגרפים מזוויות שונות בהגדלה גבוהה, ולבסוף שחזור חישובי של מפת צפיפות תלת מימדית. הדגימה הקפואה רגישה ביותר לאלומת האלקטרונים ולכן מיקרוגרפים נאספים במינונים נמוכים מאוד של אלקטרונים כדי להגביל את נזקי הקרינה. כתוצאה מכך, לקריו-טומוגרפיה הגולמית יש יחס אות לרעש נמוך מאוד המאופיין בתמונה רועשת מהותית. כדי לדמיין טוב יותר את הנושאים המעניינים, נעשה שימוש בניתוח הדמיה קונבנציונלי וממוצע תת-טומוגרפיה שבו מופקות תת-טומוגרפיות של הנבדק מהטומוגרפיה הראשונית ומיושרות וממוצעות כדי לשפר הן את הניגודיות והן את הרזולוציה. מערכי נתונים גדולים של סדרות הטיה חיוניים להבנה ופתרון של הקומפלקסים במצבים, תנאים או מוטציות שונים, כמו גם להשגת אוסף גדול מספיק של תת-טומוגרפיות למיצוע וסיווג. איסוף ועיבוד נתונים אלה יכולים להוות מכשול מרכזי המונע ניתוח נוסף. כאן אנו מתארים פרוטוקול cryo-ET בעל תפוקה גבוהה המבוסס על מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 300kV הנשלט על ידי מחשב, מצלמת מכשיר זיהוי ישיר (DDD) וספריית עטיפת תוכנה לעיבוד תמונה יעילה ביותר ואוטומטית למחצה שפותחה בבית. פרוטוקול זה שימש ביעילות כדי להמחיש את מערכת ההפרשה השלמה מסוג III (T3SS) במיני-תאים של Shigella flexneri. זה יכול להיות ישים לכל פרויקט המתאים ל-cryo-ET.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

III מערכות סוג ההפרשה (T3SS) הן גורמי אלימות חיוניים לפתוגנים גראם שלילי רבים. Injectisome, הידוע גם במתחם המחט, הוא המכונה T3SS המרכזית הנדרשת לטרנסלוקציה הישירה של חלבוני מפעיל מהחיידק לתאי מארח אוקריוטים ^{1, 2.} Injectisome כולל מחט תאית, גוף בסיסי, ומורכב cytoplasmic גם ידוע כמורכב מיון ^3. מחקרים קודמים הובהרו מבני 3-D של injectisomes המטוהר מסלמונלה וShigella, יחד עם המבנים האטומיים של חלבוני גוף בסיסיים גדולים ^{4, 5.} אחרונים במבנים באתרו של injectisomes מסלמונלה, Shigella, וYersinia נחשפו על ידי cryo-ET ^{6 , 7.} עם זאת, מורכב cytoplasmic, חיוני לבחירת מפעיל והרכבת מחט, לא דמיינו במבנים אלה.

קריו ET הוא most טכניקה מתאימה להדמיה מולקולרית מכונות ברזולוציה ננומטר בתוך הקשרה המקורי הסלולרי (באתר). עם זאת, החלטת השגה על ידי cryo-ET מוגבל על ידי עובי דגימה. כדי להתגבר על החסרון, שצלמנו injectisomes שלם במתח flexneri ארסי Shigella שמהונדס גנטי כדי לייצר minicells רזה מספיק cryo-ET. מגבלה נוספת של cryo-ET היא הרגישות של המדגם לקרינה הנגרמת על ידי קרן האלקטרונים, שהורס את המידע ברזולוציה הגבוהה במדגם מהר מאוד. כתוצאה מכך, במינונים נמוכים מאוד משמשים להטיה-תמונות בודדות, כך שמינון מתאים יכול להיות מופץ בקרב ההטיה-הסדרה המלאה. זה מוריד את יחס אות לרעש (SNR) בשחזור הגמר, מה שהופך את זה קשה להבחין תכונות המבניות של הנושא מהכמות הגדולה של רעש בtomogram ומגביל את הרזולוציה שיכול להיות מושגת על ידי הוצאה מחדר הקפאה מאוד ET. Conventiעיבוד תמונת onal כגון פורייה ומסננים אמיתיים-חלל כמו גם את הדגימה ניתן להשתמש כדי להגביר את הניגודיות, אבל על חשבון סינון הרבה של המידע ברזולוציה הגבוהה. לאחרונה, מיצוע תת-tomogram איפשר להגדיל באופן משמעותי את יחס האות לרעש ולאחר מכן ההחלטה הסופית במקרים מסוימים לרמות תת-ננומטר ^{8, 9.} ניתוח מפורט יותר של מתחמים מתאפשר על ידי המחשוב חילוץ אלפי תת-tomograms מכיל תחומי העניין מtomograms המקורי ולאחר מכן יישור וממוצע תת-tomograms לקבוע במבנים מורכבים אתר עם יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה גבוהה יותר. ניתן לשלב שיטות אלה עם גישות גנטיות לספק תובנות גדולות עוד יותר למכלולי macromolecular והתצורות הדינמיות שלהם בהקשר הסלולרי המקומי.

באופן כללי, עשרות או אפילו מאות אלף תת-tomograms צריכים להיות בממוצע על מנת לקבוע גבוהמבני -resolution באתר. הרכישה של מספר מספיק הטיה-סדרה של דרושה כדי לייצר מספר רב של תת-tomograms הופך לצוואר בקבוק במהירות. הטיה-הסדרה וכתוצאה מכך מושפעת לעתים שינוי מושרה קרן, תגובה חריפה שלב, כמו גם הגדלה, סיבוב והטית פגמים, שיש לפתור כדי להביא את ההטיה-הסדרה ליישור לפני השחזור. סדרת ההטיה מיושרת בדרך כלל על ידי סמני מעקב זהב fiducial, אשר נבחרו באופן מסורתי באופן ידני באמצעות בדיקה של ההטיה-הסדרה, וגרמו עוד צוואר בקבוק. חבילות תוכנה רבות פותחו עבור רכישת הטיה-סדרה אוטומטית באמצעות מיקרוסקופים מבוקרים מחשב אלקטרונים ^{10, 11, 12,} יישור הטיה-סדרה ושחזור ^{13, 14} ותת-tomogram ממוצע ^15-18. חבילות אלה להתמודד עם פעולות בדידות בזרימת העבודה של cryo-ET, הוא הופך להיות רצוי לבנות רמה גבוהה יותר של הפשטה בתהליך לSystematically לייעל את כל התכנית לצינור אחד. לכן, פיתחנו ספריית עטיפת תוכנה "tomoauto" שנועדה לארגן מספר החבילות אלה ליחידה חצי אוטומטי יחידה, המאפשר למבצע משתמש פשוט, תוך שמירה על תצורה מלאה של כל רכיב באופן ריכוזי. הספרייה היא קוד פתוח, מתועד היטב, שפותח ללא הרף וזמין באופן חופשי לשימוש, פיתוח מותאם או אינטגרציה נוספת באמצעות מאגר קוד מקור מרוחק מקוון (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

צינור cryo-ET תפוקה גבוהה זה נוצל כדי להמחיש injectisomes שלם בס minicells flexneri. סך של 1,917 tomograms נוצרו בשיטה זו, חושף ברזולוציה גבוהה במבנה אתר של המכונה ללא פגע כולל פלטפורמת מיון cytoplasmic נקבעה על ידי משנה tomogram ממוצע ^19. יחד עם הדמיה מולקולרית של wild-type ומטרמכונות utant, צינור התפוקה גבוהה שלנו מספקת דרך חדשה להבין את המבנה ותפקוד של injectisome שלם בהקשר הסלולרי המקומי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת Minicell

כדי להפוך ס minicells flexneri, להפוך 1 μl של פלסמיד pBS58, המבטא constitutively גני חלוקת התא הקולי Escherichia ftsQ, ftsA, וftsZ מנמוך עותק spectinomycin עמיד פלסמיד לתוך 5 μl electrocompetent סטרפטומיצין עמיד 5a סרוטיפ (M90T-SM) תאים על ידי electroporation 2.5 קילו וולט עבור 5 אלפיות שניים בcuvettes 1 מ"מ.
דגימות minicell החנות ב -80 ° C בגליצרול 15% בmicrotube קריוגני 1.5 מיליליטר. כשמוכנים לשימוש, לגרד כ 5 μl של תאים מmicrotube הופשר באמצעות קצה פיפטה ולהשעות את התאים 4 מיליליטר מרק סויה tryptic עם spectinomycin הוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
פיפטה 2 מיליליטר של התרבות ממרק סויה 1.2 לtryptic 200 מיליליטר עם spectinomycin הוסיף שוב ל -100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לשלב מאוחר יומן.
כדי להעשיר את minicells, צנטריפוגה200 מיליליטר של התרבות מ1.3 XG ב 1000 במשך 5 דקות. יוצק בזהירות את חלק supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 20,000 XG במשך 10 דקות. יוצק בזהירות ותשאיר חלק supernatant, ולערבב בעדינות את הכדור עם הנוזל שנותר באמצעות קצה פיפטה ולהעביר כ -100 μl של תערובת גלולה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.

2. EM הכנת רשת

מניחים בצד פחמן רשת נחושת 200-רשת סרט פחמן מחורר R2 / 2 עד בשקופית זכוכית.
הערה: / 2 רשת 200-רשת R2 נבחרה על מנת למקסם את מספר ההטיה סדרה-שניתן להגדיר לרכוש בכיכר רשת אחת ועדיין תומך בדגימה והצבת הקצה של סרט פחמן בתחום של המצלמה של בהגדלה הרצויה. רשתות פיינר רשת וסרטים קטנים יותר המחוררת פחמן כגון R1.2 / 1.3 400-רשת יכולה לשמש לדגימות הדמיה בהגדלה גבוהה יותר; סרטים גדולים המחוררת פחמן כגון R3.5 / 1 200 רשת יכולה להיות שימושד עבור דגימות צילם בהגדלה נמוכה או אם מיקרוסקופ לא יכיל קצה פחמן וסרטי פחמן מחוררים עם מרווח גדול יותר כגון R1 / 4 200-רשת יכול לשמש כדי לסייע עם יישור השלב לאזור של עניין והגנת אזורים מ חשיפת יתר בהתמקדות ושגרת מעקב.
מניחים את השקף על הפלטפורמה במכשיר הפרשות זוהרת.
הערה: אנו משתמשים במכשיר בבית שבו האנודה ופלטפורמה כבר במכונה לייבוש ואקום, והוא מופעל על ידי גנרטור בתדירות גבוהה. לאחר יצירת ואקום, לצרף את מחולל הבדיקה בתדירות גבוהה להאנודה והכוח על הבדיקה דקות 1 לזהור לפרוק את הרשת. הזמן הדרוש לזוהר פריקת הרשת יכולה לנוע בין כמה שניות עד דקה. שינוי זמן הפרשות זוהרת יכול לשמש כדי לאבחן בעיות בריכוז דגימה ורשתות המופיעות יבש ללא קרח זגוגית.
הסר את הרשת עם סט של מלקחיים, ולנעול את המלקחיים סגרו עם ב אלסטיו.
להוסיף 10 פתרון זהב colloidal ננומטר לצינור microcentrifuge עם minicells הערוך 1.4 100 μl ומערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינור עם אצבע. עם 4 מקום פיפטה μl חדש של התערובת על הרשת מוכנה ב 2.2.
הערה: זהב קולואיד הוא זמין במגוון של גדלים ויש להיזהר שהגודל של הזהב הוא יותר מ -5 פיקסלים בהתחשב בגודל פיקסל של micrographs להיות מעובד בהגדלת רכש, בעוד שלא היה גדול מדי לתכונות מעורפלות של עניין.
הכן את מנגנון הצעד-הקפאה; למלא את מיכל ההקפאה החיצוני עם חנקן נוזלי ולאחר מכן למלא את התא הפנימי עם אתאן הנוזלי. צרף את המלקחיים עם הרשת למוט הבוכנה ולנעול את מוט הבוכנה למצב המורם.
הערה: ראה ינקו ואח ^'20 לפרוטוקול המתאר את השימוש במנגנון צניחה-הקפאה מסחרית..
למחוק את הרשת על ידי הנגיעה בזהירות פיסת נייר סינון כדי לאהוא שחרר של מדגם עד המניסקוס בין מפריד רשת ונייר סינון והפתילה על נייר המסנן מפסיק, ואז לשחרר באופן מיידי את מוט הבוכנה, הקפאת הרשת. מוציאים בזהירות את המלקחיים ממוט הבוכנה ולמקם את הרשת לבעל רשת.
הכן את תחנת מעבר cryo-EM ידי מילוי מיכל משאבת אזור הטעינה וקליטה עם חנקן נוזלי. ברגע שאזור הטעינה הוא במקום טמפרטורת חנקן נוזלי בעל הרשת ומחסנית דגימת מיקרוסקופ באזור הטעינה.
מוציא בזהירות את טבעת הנעילה, אשר היא או טבעת נעילת הברגה קטנה על מיקרוסקופי Polara מוקדם או טבעת קליפ בסגנון C על מודלים מאוחר יותר; הנח את רשת EM לתוך המחסנית באמצעות מלקחיים ולאחר מכן בעדינות לצרף את טבעת הנעילה בחזרה אל מחסנית אבטחת הרשת.
הסר את בעל דגימה מרובה ממיקרוסקופ ולצרף אותו לתחנת המעבר. הנח את מחסנית הדגימה לתוך מחזיק באמצעות מלקחיים מחסניתd לחזור בעל מאזור הטעינה ולהעביר את בעל דגימה מרובה חזרה למיקרוסקופ.
הערה: ראה חן et al ²¹ לפרוטוקול חזותי המפרט 2.1-2.9..

אוסף הטיה-סדרה אוטומטית 3. תפוקה גבוהה

אוסף של מפות נמוכה הגדלה
1. פתח חלון Navigator חדש באמצעות לחיצה על 'פתח' בתפריט 'Navigator "של SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
2. מצא את ריבועי רשת המכילים תנאי הדמיה מקובלים (כלומר, קרח דק, אין זיהום, נושא הריבית) באמצעות מסך הניאון בהגדלה נמוכה (~ 2,300X לדגימת minicell).
  הערה: [אופציונאלי:. יכול להיות אוטומטי צעד זה עם SerialEM ידי montaging כל הרשת, אבל זה יכול להיות מהיר יותר פשוט לבחור כמה אזורים ידני]
3. התאם את השלב לגובה eucentric ידי הטיית בעל הדגימה עד 50 ° לאחר מכן להתאיםZ-הגובה עד תרגום XY של השלב הוא מינימאלי בין הנופים המוטה וuntilted.
4. לעבור למרכז כיכר הרשת ולחץ על הכפתור 'הוסף שלב ממוצע' בחלון הניווט כדי לאחסן את מיקום השלב הנוכחי.
5. המשך צעדים 3.1.1-4 מעל עד שכל עמדות שלב ריבועי רשת המקובלות נשמרו.
6. פתיחת קובץ MRC מונטאז 'חדש באמצעות לחיצה על' מונטאז 'החדש' בתפריט 'הקובץ'. בהגדרת Montage שיח שנפתחת, בחר מספר החתיכות בX ו- Y שתרכושנה את כל כיכר הרשת (לדוגמא, 10 x 10 לרשת 200 רשת סטנדרטית). השתמש binning גבוה כגון 8 ובחר את "הזז שלב במקום העברת תמונה 'ו' דלג מתאמים משמשים כדי ליישר חתיכות" כפתורי רדיו.
7. בחלון Navigator לחץ עמדת השלב הראשונה ולהגדיר אותו יירכש על ידי סימון התיבה 'רוכש את'. חזור על פעולה זו עבור כל עמדת שלב בחלון Navigator.
8. פתח את Navigator לרכוש שיח באמצעות לחיצה על 'רוכשים בנקודות' בתפריט 'Navigator ". בדוק את 'התמונה רוכשת את המפה' ותיבת סימון 'eucentricity קשוח "ולוודא שכל תיבות הסימון אחרות שלא נבדק. לחץ על 'המשך' כדי לאסוף מונטאז 'בכל עמדת שלב.
רכישת הטיה-סדרה
1. בחלון Navigator בחר באחת מהמפות שנרכשו ולחץ על הכפתור 'טען המפה'.
2. בחלון Navigator לחץ נקודות 'הוסף נקודות "כפתור ובחר במפה שבה לרכישת הטיה-סדרה. לאחר מכן לחץ על "להפסיק להוסיף נקודות" כפתור. חזור על פעולה עבור כל מפה שנאסף.
3. בתפריט המצלמה בחר 'פרמטרים' ולהגדיר את הפרמטרים למצבי פוקוס, ניסיון, והשיא. [אופציונאלי:.-מופרדת מנה יכולים להיות מוגדרים נתונים בפרמטרים למצב הקלטה]
4. בחר נקודה בחלון הניווט ולבדוק את הסדרה-Tilt '9; תיבת סימון. בחלון הדו-שיח הגדרת ההטיה הסדרה-שנפתח בחרו בפרמטרים רצויים לאוסף הטיה-הסדרה. חזור לשאר נקודות שנבחרו בחלון Navigator, אך לא יבחר המפות.
5. בתפריט הניווט בחר שוב 'רוכשים בנקודות ". בנווט רוכשים הדו-שיח לבחור "ליישר מחדש לפריט ', מיקוד אוטומטי' ו 'eucentricity קשוח" כמשימות ראשוניות, ובחר' סדרת הטיה לרכוש "כמשימה העיקרית, ובחר 'שסתומים עמודה לסגור בסוף' כדי לסגור את הטור כאשר כל מהנקודות שנאספו. על הליך הטיה-סדרה ייאסף בכל נקודה בכל מפה.

עיבוד הטיה-סדרה אוטומטית 4. תפוקה גבוהה ושיקום באמצעות Tomoauto

תיקון של תנועה מושרה קרן בנתונים מופרדים במינון [אופציונאלי]
הערה: Tomoauto משתמשת MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htמיליליטר) כדי להסיר תנועה מושרה קרן מmicrographs-מופרד מינון. NOTIONCORR ¹⁶ חייבים להיות מותקנים במערכת.
1. עם ההטיה-הסדרה המקורית, יומן הפלט מSerialEM ¹⁰ ותמונות מינון מופרד בודדות כל בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה:
  dose_fractioned_to_stack
  הוא שמו של ההטיה הסדרה לעבד.
יישור ושיקום הטיה-סדרה
הערה: Tomoauto כברירת מחדל משתמש ¹³ IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/) כדי להתמודד עם דור הטיה-סדרה אוטומטית מודל fiducial, יישור, נחישות של פונקצית ההעברה לעומת זאת, CTF-תיקון ^23, (CTF) ו שִׁחזוּר. לחלופין יש למשתמשים את האפשרות בtomoauto להשתמש ²⁴ RAPTOR (כלולה בIMOD) לדור אוטומטי fiducial מודל, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) כדי לקבוע את CTF, וtomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) לשיקום או בכל שילוב של חבילות תוכנה על ידי תְצוּרָה. תצורה זו, כמו גם את הפרמטרים זמינה בכל חבילה מתבצעת על ידי קובץ תצורה גלובלי שניתן לערוך כדי להתאים את הערכים הנפוצים ביותר במעבדה בעת גם ניתן ליצור קבצי תצורה מקומיים לפרמטרים המשמשים לפירוט דגימה ספציפית, אוסף להגדיר או הטיה-סדרה בודדת. כל החבילות שרוצות לשמש חייבת להיות מותקנות במערכת.
1. עם ההטיה-הסדרה בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה
  tomoauto --CTF --mode = ליישר
  היא ההטיה-הסדרה להיות מעובד ו< fid_diam> הוא diameter של סמני fiducial בננומטרים. פקודה זו תהיה ליישר ולהעריך את CTF של ההטיה-הסדרה באופן אוטומטי. אפשר לדלג על עיבוד CTF על ידי הסרת אפשרות --CTF מהפקודה.
2. בדוק את ההטיה-הסדרה מיושרת חזותי לטעויות בולטות בעיבוד היישור ולבדוק המוערך CTF על ידי ביצוע הפקודות:
  3dmod <שם הקובץ> .ali
  submfg <שם הקובץ> _ctfplotter.com
  בהתאמה, כאשר <שם קובץ> הוא שמו של ההטיה-הסדרה בלי סיומת. כמו כן, בדוק את הפלט של פקודת tomoauto לראות את שגיאת השייר הממוצעת שנוצרה על ידי היישור, שבו הוא נתון כמותי של איכות יישור.
3. בהתחשב יישור מקובל להמשיך עיבוד על ידי ביצוע הפקודה:
  tomoauל--CTF --mode = לשחזר
  עם אותו המשתמש כמו בהחלפות 4.2.1. פקודה זו תתקן CTF, למחוק את סמני fiducial מההטיה-הסדרה ולחשב את השחזור. שוב עיבוד CTF ניתן לדלג כמו ב4.2.1.
4. [אופציונאלי] כדי לדלג על שלב הבדיקה ויזואלית ולהפוך באופן מלא לעיבוד ושחזור לבצע את הפקודה
  tomoauto --CTF
5. [אופציונאלי] כדי להשתמש בתצורה מקומית ספציפית, עיין בתיעוד tomoauto על איך ליצור קובץ הגדרות מקומי, ולאחר מכן לבצע את הפקודה
  tomoauto [אפשרויות] ס
  כאשר הוא שמו של conf המקומיקובץ iguration.

מיצוע 5. תת-tomogram

הערה: אנו משתמשים בחבילת i3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) לעבד ניסויי מיצוע תת-tomogram, אולם הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב ניסויי מיצוע תת-tomogram תהליך packages16to תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין, עם זאת הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב חבילות תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין ^16-18.

עם tomogram המשוחזר בספריית העבודה הנוכחית לפתוח את tomogram לקטיף חלקיקים שהרצת הפקודה:
tomopick .rec <שם הקובץ>
כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב4.2.2. בחלון שנפתח להשתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי ללחוץ על ראשון גוף הבסיסי ולאחר מכן את קצה המחט כדי לבחור injectisome ולהשתמש בחץ-מפתחות למעלה ולמטה כדי ריף דרך פרוסות tomograM. בחר את כל injectisomes הגלוי באופן זה. זה מאחסן את הקואורדינטות בקובץ טקסט המגדירות את הציר של המבנה הארוך, כמו גם הערכה שתיים משלושת זוויות אוילר המתארים את הנטייה של המבנה.
תמצית המחשוב 400 ³ קוביות voxel מtomogram מרוכזות בנקודת האמצע של ציר זמן שהוגדר על ידי ביצוע הפקודה:
קליפ שינוי גודל -cx -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
<שם קובץ> .rec _001.mrc <שם הקובץ>
כאשר , , הן קואורדינטות נקודת האמצע של המבנה ו< שם הקובץ> הוא כמו ב4.2.2. הגודל של הקובייה שחולצה צריך להשתנות לפי המבנה והגדלת שימוש, וצריך להיות גדול מספיק כדי להקיף את המבנה של עניין, אשר למדגם זה הוא 400 ³ voxels כראוי.
תת-tomogram בפקטור של ארבעה כדי לצמצם את זמן חישוב ליישור ראשוני על ידי ביצוע הפקודה (סל) למטה מדגם:
binvol -B 4 <שם הקובץ> _001.mrc _001.bin4.mrc <שם הקובץ>
כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב5.2.
החל אוילר נקבע זוויות למשנה tomograms ולחשב את הממוצע העולמי לייצר התבנית הראשונית שהרצת הפקודה.
I3totsum.sh
יישר ולסווג תת-tomograms למטה נדגמו באמצעות מסכת סיווג בינארי של אזור cytoplasmic. לבצע מיצוע תת-tomogram בחלל פורייה כדי למזער את חפצי טריז חסר מאפיין של טומוגרפיה. לbinning 4 נתונים, אנא השתמש SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh
תת-tomograms באמצעות חזור על שלב 5.5 מטה-נדגמו על ידי גורם משני (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") ופעם נוספת עם נתונים המקוריים (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמאות של minicells ס flexneri נאסף ומעובד כהראה באיור סכמטי 1 באמצעות tomoauto הבא הצינור מפורט באיור 2. הטיה-סדרה נאספו באמצעות ¹⁰ SerialEM, המאפשר לרכישת הטיה-סדרת תפוקה גבוהה בנקודות שנקבעו על ידי המשתמש במפות מונטאז נמוך הגדלה (איור 3). Micrographs נאסף באמצעות מצב מינון חלוקה על מצלמה מכשיר ישיר איתור להפחית מושרה קרן תנועת ²²

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת התפוקה גבוהה המתוארות כאן אפשרה לנו להטות סדרת 1,917 cryo לעבד ולייצר מעל 4,500 תת-tomograms של ס 'שלם flexneri injectisome ^19. הנתונים שנאספו הובילו לאפיון מפורט של בinjectisome אתר, לרבות cytoplasmic מיון מורכב. השיטה נוצלה גם כדי להמחיש כמה תאים שעברו מוטציה עם מחיקה ספציפית של רכיבי חלבון משוערים, שסייעו להבהיר את ההרכב של פלטפורמת המיון של injectisome. השיטה שלנו סיפקה אפיקים חדשים כדי לחקור את יחסי מבנה-תפקוד של injectisome. כתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ויליאם מרגולין להערות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה בSerialEM מבני הזוג. דוד Mastronarde וחן שו. DM, BH וJL נתמכו על ידי גרנט R01AI087946 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מענקי R01GM110243 וR01GM107629 מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (NIGMS), וגרנט AU-1,714 מהקרן וולש. גלאי האלקטרונים הישירים מומנו על ידי המכון הלאומי לבריאות בפרס S10OD016279.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G9012
מרק סויה טירפטי	סיגמא-אולדריץ'	22092
ספקטינומיצין	סיגמא-אולדריץ'	S0692
מכשיר אלקטרופורציה	ביו-ראד	165-2100
1 מ"מ קובטה	BTX	45-0124
1.5 מ"ל צינור קריוגני	תרמו-מדעי	5000-1020
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	סיגמא-אולדריץ'	Z336769
רשתות פחמן הולי	Quantifoil (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
פריקת זוהר	בתוך הבית		חלופה מסחרית זמינה
מייבש ואקום	סיגמא-אולדריץ'	Z119016	משמש במכשיר פריקת זוהר פנימי
גנרטור בתדר גבוה	מוצרים אלקטרו-טכניים	BD-10A	המשמשים במכשיר פריקת זוהר פנימי. זהירות: מכשיר זה מייצר כרך גבוהtage.
מלקחיים צנטריפוגה
	Dumont (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)	72705-D	סגנון 5 אנטי מגנטי
קוליודלי זהב	אוריון		BSA 10nm
נייר סינון	Whatman		#2
אתאן	Matheson Tri-Gas	UN1035
חנקן	Matheson Tri-Gas	UN1977
מכשיר בוכנה	חלופה מסחרית זמינה
תיבת אחסון רשת קריוגנית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	71166-30
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	FEI		Tecnai Polara F30 (300 keV)
מצלמת מכשיר זיהוי ישיר	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM חלופות: UCSF טומוגרפיה, לגיון,
תוכנת תיקון תנועה המושרה על ידי קרן	של FEI MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html דורשת תוכנת יישור מסדרת הטיה של >2GB Nvidia GPU
Tilt	חלופות IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD: XMIPP, Protomo
תוכנת מידול סמן פידוציאלי אוטומטי	IMOD		: RAPTOR (כלול ב-IMOD0 (ניתן לשימוש ב-tomoauto)
תוכנת קביעת CTF	IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (ניתן לשימוש ב-tomoauto)
תוכנת שחזור מסדרת Tilt	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d חלופות: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series תוכנת עיבוד אוטומטי	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
תוכנת איסוף חלקיקים	i3		http://www.electrontomography.org חלופות: IMOD
i3		לתוכנת מיצוע נפח משנה	: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org

מכשיר טומוגרפיה אצווה חלופות חלופות חלופות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792(2013).
Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).
Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles