באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

Abstract

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (Cryo-ET) היא טכניקת הדמיה תלת מימדית (תלת מימדית) רבת עוצמה להדמיית קומפלקסים מקרומולקולריים בהקשר המקורי שלהם ברמה המולקולרית. הטכניקה כוללת תחילה שימור הדגימה במצבה המקורי על ידי הקפאה מהירה של הדגימה בקרח זגוגית, לאחר מכן איסוף סדרה של מיקרוגרפים מזוויות שונות בהגדלה גבוהה, ולבסוף שחזור חישובי של מפת צפיפות תלת מימדית. הדגימה הקפואה רגישה ביותר לאלומת האלקטרונים ולכן מיקרוגרפים נאספים במינונים נמוכים מאוד של אלקטרונים כדי להגביל את נזקי הקרינה. כתוצאה מכך, לקריו-טומוגרפיה הגולמית יש יחס אות לרעש נמוך מאוד המאופיין בתמונה רועשת מהותית. כדי לדמיין טוב יותר את הנושאים המעניינים, נעשה שימוש בניתוח הדמיה קונבנציונלי וממוצע תת-טומוגרפיה שבו מופקות תת-טומוגרפיות של הנבדק מהטומוגרפיה הראשונית ומיושרות וממוצעות כדי לשפר הן את הניגודיות והן את הרזולוציה. מערכי נתונים גדולים של סדרות הטיה חיוניים להבנה ופתרון של הקומפלקסים במצבים, תנאים או מוטציות שונים, כמו גם להשגת אוסף גדול מספיק של תת-טומוגרפיות למיצוע וסיווג. איסוף ועיבוד נתונים אלה יכולים להוות מכשול מרכזי המונע ניתוח נוסף. כאן אנו מתארים פרוטוקול cryo-ET בעל תפוקה גבוהה המבוסס על מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 300kV הנשלט על ידי מחשב, מצלמת מכשיר זיהוי ישיר (DDD) וספריית עטיפת תוכנה לעיבוד תמונה יעילה ביותר ואוטומטית למחצה שפותחה בבית. פרוטוקול זה שימש ביעילות כדי להמחיש את מערכת ההפרשה השלמה מסוג III (T3SS) במיני-תאים של Shigella flexneri. זה יכול להיות ישים לכל פרויקט המתאים ל-cryo-ET.

Introduction

III מערכות סוג ההפרשה (T3SS) הן גורמי אלימות חיוניים לפתוגנים גראם שלילי רבים. Injectisome, הידוע גם במתחם המחט, הוא המכונה T3SS המרכזית הנדרשת לטרנסלוקציה הישירה של חלבוני מפעיל מהחיידק לתאי מארח אוקריוטים ^{1, 2.} Injectisome כולל מחט תאית, גוף בסיסי, ומורכב cytoplasmic גם ידוע כמורכב מיון ^3. מחקרים קודמים הובהרו מבני 3-D של injectisomes המטוהר מסלמונלה וShigella, יחד עם המבנים האטומיים של חלבוני גוף בסיסיים גדולים ^{4, 5.} אחרונים במבנים באתרו של injectisomes מסלמונלה, Shigella, וYersinia נחשפו על ידי cryo-ET ^{6 , 7.} עם זאת, מורכב cyto....

Protocol

1. הכנת Minicell

1. כדי להפוך ס minicells flexneri, להפוך 1 μl של פלסמיד pBS58, המבטא constitutively גני חלוקת התא הקולי Escherichia ftsQ, ftsA, וftsZ מנמוך עותק spectinomycin עמיד פלסמיד לתוך 5 μl electrocompetent סטרפטומיצין עמיד 5a סרוטיפ (M90T-SM) תאים על ידי electroporation 2.5 קילו וולט עבור 5 אלפיות שניים בcuvettes 1 מ"מ.
2. דגימות minicell החנות ב -80 ° C בגליצרול 15% בmicrotube קריוגני 1.5 מיליליטר. כשמוכנים לשימוש, לגרד כ 5 μl של תאים מmicro....

Results

דוגמאות של minicells ס flexneri נאסף ומעובד כהראה באיור סכמטי 1 באמצעות tomoauto הבא הצינור מפורט באיור 2. הטיה-סדרה נאספו באמצעות ¹⁰ SerialEM, המאפשר לרכישת הטיה-סדרת תפוקה גבוהה בנקודות שנקבעו על ידי המשתמש במפות מונטאז נמוך הגדלה (איור 3). Micrographs נאסף באמצעות מצב מינון חלוקה על מצלמה מכשיר ישיר איתור להפחית מושרה קרן תנועת ²²

Discussion

שיטת התפוקה גבוהה המתוארות כאן אפשרה לנו להטות סדרת 1,917 cryo לעבד ולייצר מעל 4,500 תת-tomograms של ס 'שלם flexneri injectisome ^19. הנתונים שנאספו הובילו לאפיון מפורט של בinjectisome אתר, לרבות cytoplasmic מיון מורכב. השיטה נוצלה גם כדי להמחיש כמה תאים שעברו מוטציה עם מחיקה ספציפית של רכיבי חלבון משוערים, שסייעו להבהיר את ההרכב של פלטפורמת המיון של injectisome. השיטה שלנו סיפקה אפיקים חדשים כדי לחקור את יחסי מבנה-תפקוד של injectisome. כתו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G9012
מרק סויה טירפטי	סיגמא-אולדריץ'	22092
ספקטינומיצין	סיגמא-אולדריץ'	S0692
מכשיר אלקטרופורציה	ביו-ראד	165-2100
1 מ"מ קובטה	BTX	45-0124
1.5 מ"ל צינור קריוגני	תרמו-מדעי	5000-1020
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	סיגמא-אולדריץ'	Z336769
רשתות פחמן הולי	Quantifoil (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
פריקת זוהר	בתוך הבית		חלופה מסחרית זמינה
מייבש ואקום	סיגמא-אולדריץ'	Z119016	משמש במכשיר פריקת זוהר פנימי
גנרטור בתדר גבוה	מוצרים אלקטרו-טכניים	BD-10A	המשמשים במכשיר פריקת זוהר פנימי.  זהירות: מכשיר זה מייצר כרך גבוהtage.
מלקחיים צנטריפוגה
	Dumont (מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית)	72705-D	סגנון 5 אנטי מגנטי
קוליודלי זהב	אוריון		BSA 10nm
נייר סינון	Whatman		#2
אתאן	Matheson Tri-Gas	UN1035
חנקן	Matheson Tri-Gas	UN1977
מכשיר בוכנה	חלופה מסחרית זמינה
תיבת אחסון רשת קריוגנית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	71166-30
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	FEI		Tecnai Polara F30 (300 keV)
מצלמת מכשיר זיהוי ישיר	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM חלופות: UCSF טומוגרפיה, לגיון,
תוכנת תיקון תנועה המושרה על ידי קרן	של FEI MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html דורשת תוכנת יישור מסדרת הטיה של >2GB Nvidia GPU
Tilt	חלופות IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD: XMIPP, Protomo
תוכנת מידול סמן פידוציאלי אוטומטי	IMOD		: RAPTOR (כלול ב-IMOD0 (ניתן לשימוש ב-tomoauto)
תוכנת קביעת CTF	IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (ניתן לשימוש ב-tomoauto)
תוכנת שחזור מסדרת Tilt	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d חלופות: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series תוכנת עיבוד אוטומטי	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
תוכנת איסוף חלקיקים	i3		http://www.electrontomography.org חלופות: IMOD
i3		לתוכנת מיצוע נפח משנה	: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org