מאמר שיטה

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 במרץ 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

במאמר זה

סיכום

כדי לחקור את מנגנון ניצול השומנים בקרומי שק החלמון בשלבים המאוחרים של התפתחות עוברי העופות, הקמנו מערכת תרבית תאי אפיתל אנדודרמלי עובריים ראשונית של שליו יפני.

תקציר

הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 - 3 חתיכות מ"מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.

מבוא

המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7

vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות.

ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4

צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הליך זה הוא שינוי של פרוטוקול תרבות מודל עוף שפותחה על ידי באואר ואח '2013 Nakazawa ואח', 2011. 2,9..

1. הכין בריא עוברי יום 5 עובר מן השליו יפני

  1. מקום 1 זכר ונקבה 3 שליו יפני בוגרים מינית יחד באותו כלוב. Feed היצע כרצונך מים. התאם את האור בחדר חיה ל -14 שעות של אור ו -10 שעות חושך.
  2. איסוף ביצים מופרות בשקיות פלסטיק בכל יום בשעות אחר הצהריים ולשמור אותם במקרר 16 ° C לעכב את קצב הצמיחה של עוברים.
  3. לאחר איסוף מספר מספיק של ביצים בתוך תקופה של שבועיים, לדגור על הביצים המופרות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אוורור טוב במשך חמישה ימים.

2. כן בסל בינוני לשטוף פתרונות

  1. השתמש DMEM / F-12 בינוני (מותאם pH 7.2) כמדיום הצמיחה, ומשלימים זהעם 10 סרום חדש נולד% עגל (NBCS) ו -1% פן-סטרפטוקוקוס Ampho. פתרון (PSA; פניצילין, 10 5 יחידות / L; סטרפטומיצין, 100 מ"ג / L; Amphotericin B, 0.25 מ"ג / ליטר).
  2. כן בופר פוספט פתרון (PBS) בריכוז 10x לאחסון; לשימוש פתרון PBS 1x (המכיל NaCl, 137.93 מ"מ; KCl, 2.667 מ"מ; KH 2 4 PO, 1.471 מ"מ; Na 2 HPO 4 -7 ש 2 O, 8.06 מ"מ; להסתגל 7.2 pH) כדי לשטוף להרטיב אותו זמן קרום שק החלמון הפרדת endoderm מן החלמון אלבומין ביצה.
  3. השתמש בינוני DMEM (מותאם pH 7.2) מחדש להשעות כדורי האנדודרם.

אוסף 3. EECS ראשית ממנהל YSMs יפני שליו

  1. לדגור על הביצים שנאספו במשך 5 ימים (שלב 1.3). בדוק את הביצים על ידי בודק ביצים כדי לאשר התפתחות עוברית נורמלית.
    הערה: ביום עוברי יום 5, הגבול של mesoderm YSM הוא מאוד ברורה ואת 3 השכבות העובריות הן פחות בחוזקה צמודות זו לזו, כך קל OBendoderm טיין. השתמש רק את הביצים מראות פיתוח זרימת נימים נורמלי אוספים YSM.
  2. נקה את קליפת הביצה באמצעות מים מתוקים בזהירות אתנול 75%. פתח את קליפת הביצה מעמדת תא אוויר על ידי זוג מספריים, לקלף בעדינות החוצה לאסוף את כל YSM ידי מלקחיים ומניחים בצלחת תרבות 10 ס"מ מלא 37 ° C 1x PBS.
  3. בעזרת זוג מספריים להסיר את העובר, חלמון ביצה-לבן, לשטוף בעדינות את YSM עם 1x PBS שלוש פעמים ומניחים YSM בתמיסה PBS בצלחת תרבות 10 ס"מ.
  4. שימוש במלקחיים וזוג מספריים כדי להסיר את האאקטודרם מ YSM. שימוש 2 מלקחיים, אחד להחזיק את שכבת תאי endodermal בתקיפות, ושני להחזיק את המזודרם נימי.
  5. תחת מיקרוסקופ לנתח, לפרק ולהפריד את endoderm מהקצה של mesoderm בכיוון כלפי העובר. אסוף את endoderm אור צהוב 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות באמצעות טפטפת ומניחים 15 מ"ל של מדיום הגידול בתוך וואט 37 ° Cאה באמבטיה עד כל אוספי הרקמות הושלמו.

4. עיכול של פרוסות endoderm ידי Collagenase עיכול

  1. טרי לפזר 6.5 יחידות של collagenase מסוג IV ב 10 מ"ל של DMEM.
  2. צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות (3.4) ב 130 XG 3 דקות ב RT. לשאוב את המדיום ולמקם כל endoderm בצלחת תרבות 6 ס"מ בעזרת פיפטה. הוסף פתרון collagenase 1 מ"ל ל צלחת תרבות זו.
  3. פורסים את endoderm שנאספו 2 עוברים שליו עם זוג מספריים מעוקל עד לגודל של כל פרוסה הוא כ 2 עד 3 מ"מ. השתמש טפטף, לאסוף את כל הפרוסות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר יחד עם 9 מיליליטר של תמיסת collagenase הטריה.
  4. לעכל את הרקמה עם collagenase למשך 30 דקות באמבט מים רועד 37 מעלות צלזיוס ב 175 סל"ד. עיכול חלקי זה עם collagenase משמש כדי לשפר את התפשטות תאי explant.
  5. צנטריפוגה ב 130 XG 3 דקות ב RT בעדינות להסיר את החלק היחסי supernatant בעזרת פיפטה. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ"ל DMEM ולהסיר את החלק היחסי supernatant לאחר צנטריפוגה 130 XG במשך 3 דקות.
  6. Re- להשעות את גלולה עם 12 מ"ל של מדיום הגידול (DMEM / F12 עם 10% ו -1% NBCS PSA) וזרעי בעדינות שווה לתוך צלחת 24 גם (כל טוב עם 500 פתרון התא μl).
  7. דגירה explants רקמות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמות.
  8. דגירה תאים עבור 2 ימים נוספים ולאפיין עבור כדאיות התא על ידי פרוטוקול assay כדאיות התא. 15
    הערה: תאי חיים לשמור על סביבת הפחתה בתוך cytosol. Resazurin, המרכיב הפעיל, הוא תרכובת חדירה רעילה, תא זה כחול בצבע הלא ניאון כמעט. כאשר נוספו בתרביות תאים, resazurin מצטמצם resorufin ב cytosol על ידי אנזימים המיטוכונדריה. Resorufin הוא בצבע אדום ניאון מאוד. תאים חיים להמיר ברציפות resazurin כדי resorufin, increasing הקרינה והצבע הכולל של מדיום תרבות תאים הסובבים.
  9. בצע בידוד RNA הכולל תא אפיתל endoderm, הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR כמותי של ביטוי mRNA הגן סמן כמתואר. 16,17
    1. השתמש PCR transcriptase הפוך לזהות SOAT1 mRNA (במובן: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR מוצר = 168 נ"ב) כסמן ספציפי עבור תאי EEC. השתמש β-תקטין mRNA (במובן: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisense: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; מוצר PCR = 151 נ"ב) כמו גן משק ובקרה פנימית.
    2. השתמש ג'ל אלקטרופורזה כדי לזהות את גודל המוצר של RT-qPCR. כן 1% ג'ל agarose, ומערבב 10 μl מוצר qPCR עם צבע טעינה 2 μl. תערובת טען 10 μl היטב לתוך כל אחד בתוך הג'ל agarose 1%, ולהפעיל את הג'ל על ידי 100V במשך 30 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת להשיג את המטרה של הקמת מודל תא עקבי ושימושי, אנחנו צריכים להרחיב ולייצב את קצב ההתפשטות וביצועים של EECS עופות. השווינו דגירה ישירה של endoderm ללא עיכול אנזים עם endoderm מעוכל חלקית עם אנזימים פרוטאוליטים, כגון collagenase או collagenase בתוספת 0.6 U של dispase. Dispase הוא-endopeptidase אמינו hydrolyzes אג"ח פפטיד N- מסוף של שאריות חומצת אמינו לא-קוטביות. בעוד טיפולי עיכול פרוטאז גדלו התפשטות תאים בהשוואה להעדר עיכול (איור 1)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מטיפול עיכול חלקית היו גדולים יותר מן תרבות רקמות המעוכלת לאחר זריעת 2 ימים (איור 1). לכן, עיכול פרוטאוליטים חלקית הוא שלב קריטי כדי לשפר את תשואת תא מן YSM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים. לא קיבלנו שום מימון מאף חברה פרטית.

תודות

מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי "לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת" של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Modified Eagle Medium Gibco של Dulbeccoby Life technologies12800-017 10 X 1 Lלשטיפת כדורי ה-EECs
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 Lכמדיום הבסיסי בתרבות EECs
NBCSGibco by Life technologies16010-159כסרום האספקה בתרבית EECs
Pen-Strep Ampho. פתרוןBI (תעשיות ביולוגיות)03-033-1B 100 מ"ללהחלשת זיהום אפשרי 
קולגנאז סוג IVג'יבקו מבית Life technologies17104-019 1 גרם  קולגנאז הוא פרוטאז בעל ספציפיות לקשר בין חומצת אמינו ניטרלית (X) לגליצין ברצף Pro-XGly-Pro. כפרוטאז לדיסוציאציה של תאים מרקמה ראשונית.
צלחת 24 בארותFALCON® REF-353047עבור EECs לחיבור והארכה
צינורות צנטריפוגה PP 50 מ"לCorning® CentriStarTM430829להובלת ממברנות ועיכול אנזימים
50 מ"ל צינור תחתית חרוטי עם מכסהPRO TECHCT-50-PL-TWלהובלת ממברנות ועיכול אנזימים
אמבט טלטול הדדיDEAGLESB302לעיכול אנזימטי טוב יותר על ממברנות
של

מקורות

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT qPCRSOAT1cAMP

מאמרים קשורים