באמצעות מתאם תמונה דיגיטלי לאפיין זנים מקומיים בדגימות רקמת כלי דם

סיכום

אנו מתארים את השימוש במתאם תמונה דיגיטלית כדי לאפיין את שדה מתח פני השטח המקומי על דגימות רקמת כלי דם העונות לבדיקת מתיחה חד-צירית. מדידות אלו מאפשרות כימות מדויק של התגובה המכנית של הדגימה ויצירת יחסי מתח-מתח מכוננים.

תקציר

אפיון ההתנהגות המכנית של רקמות רכות ביולוגיות ומהונדסות הוא מרכיב מרכזי במחקר ביו-רפואי בסיסי ופיתוח מוצרים. יחסי מתח-מתח מתקבלים בדרך כלל מנתוני בדיקות מכניות כדי לאפשר הערכה השוואתית בין דגימות ובמקרים מסוימים זיהוי של תכונות מכניות מכוננות. עם זאת, עלולות להיווצר שגיאות באמצעות שימוש במדדי מתח ממוצעים, שכן הטרוגניות משמעותית בתחום המתח עלולה לנבוע מאי אחידות גיאומטרית של הדגימה וריכוזי מתח הנגרמים על ידי הרכבה/אחיזה של רקמות רכות בתוך מערכת הבדיקה. כאשר ההטרוגניות של שדה המתח משמעותית, הערכה מדויקת של התגובה המכנית של הדגימה דורשת מדידה של זנים מקומיים. מחקר זה מדגים פרוטוקול בדיקה ביומכני חדשני לחישוב מתחי שטח מקומיים באמצעות מכשיר בדיקה מכני יחד עם מצלמה ברזולוציה גבוהה וטכניקת מתאם תמונה דיגיטלית. סדרה של תמונות משטח דגימה נרכשות ולאחר מכן מנותחות כדי לכמת את מתח פני השטח המקומי של דגימת רקמת כלי דם הנתונה לעומס חד צירי מוגבר. גישה זו יכולה לשפר את הדיוק בביומכניקה ניסויית של כלי הדם ויש לה פוטנציאל לשימוש רחב יותר בקרב רקמות רכות מקומיות אחרות, רקמות רכות מהונדסות והידרוג'ל/חומרים פולימריים רכים. בסרטון אנו מדגימים כיצד להגדיר את רכיבי המערכת ולבצע ניסוי שלם על רקמת כלי דם מקומית.

מבוא

היסטוריה עשירה של מחקר המשתרעת על 50 שנים כבר התמקדה בכימות התכונות מכאניות של רקמות וכלי דם. מחקרים אלה מאפשרים לנו להבין טובים יותר הן ההתנהגות הפיזיולוגית ופתולוגיים של כלי דם, מספק בסיס להערכת היעילות / התאימות של התקני endovascular, וסיוע בתכנון וייצור של כלי דם מהונדסים בונה ^1-6. מדידה מדויקת של התגובה המכנית של רקמות רכות ודוגמנות מכוננת של התכונות מכאניות שלהם היא מיסוד מאתגר בשל ההטרוגניות, אנאיזוטרופיה, והליניאריות המכנית הוצגה על ידי רוב סוגי רקמות. יתר על כן, מדידות ניסיוניות לעתים קרובות מבולבלות על ידי מורכבות מקומיות הציגו בממשקים מדגם אחיזה במהלך בדיקות מכאניות (כלומר, כיפוף, חיכוך, ריכוזי מתח, קורעים) והמעבר הבלתי נמנע של תכונות מכאניות של רקמות פעם הוא נכרת מהחי.

ניסוי מתיחה uniaxial הוא בין הבדיקות מכאניות הפשוטות שניתן לבצע על דגימה עשויה מחומר מוצק, ומשמש לעתים קרובות כדי להעריך את התגובה המכנית של רקמת כלי דם. תוצאות מניסויים אלה מספקים מידע ראשוני שימושי עבור שני מקורות רקמות מהונדסים והילידים, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של טיפולים מסוימים, מצבי מחלה, או תרכובות תרופתיות על ההתנהגות המכנית של כלי דם הקיר ^7-11.

בדיקות מכאניות uniaxial של רקמות רכות מבוצעות בדרך כלל על דגימות בגיאומטריות אחידות יחסית, שהם נפוצים ביותר כלב-עצם או טבעת בצורה ^7,8,12-14. עם זאת, יציאה משמעותית מגיאומטריות אידיאליזציה אלה יכול להתרחש עקב אתגרים הקשורים לנתיחה רקמה, בידוד, והידוק בתוך מערכת הבדיקה. כל שאינם אחיד בגיאומטריה סופו של דבר לגרום ללחץ ומתח הטרוגניתשדות כאשר המדגם הוא נתון להארכת uniaxial, עם מידת ההטרוגניות תלויה בצורת מדגם בפועל, כמו גם גודל מדגם (יחסית לעובי הקורה) ואת התכונות מכאניות של החומר ^9,15,16. כאשר heterogeneities השדה הוא משמעותיים, חישובי מתח מדגם מבוססים על עמדות אחיזה היחסית הם לא מדויקים ובכך בסיס מספיק להערכת התנהגות מכאנית.

מערכות ניתוח וידאו היו בשימוש נרחב למדידות מתח של רקמות רכות, לעתים קרובות תוך שימוש בסמני צבע ניגודיות גבוהה מוחלים על פני השטח דגימת ^17,18. מתאם תמונה דיגיטלי, טכניקה המטרולוגי אופטית המודדת מתח פני השטח שדה מלא על ידי השוואת ערכי עצמת רמה אפורות על פני השטח של הדגימה לפני ואחרי העיוות, בו נעשה שימוש בשילוב עם וידאו ניתוחים של רקמות רכות ^19-21. ישנם מספר יתרונות של מתאם תמונה דיגיטלי לעומת interferometrשיטות IC שיכול להיות מועסק למדידות. ראשית, כטכניקת מדידה שאינה פנייה, היא ממזערת את תופעות בלבול של שינוי תכונות חומר בשל האופן שבו מערכת המדידה משפיעה על הדגימה. שנית, היא דורשת סביבת מדידה הרבה פחות מחמירה ויש לו מגוון רחב יותר של רגישות ורזולוציה יותר מאשר בשיטות אחרות. שלישית, ניחן ביכולת של לכידת שדה מלא של נוף, טכניקה זו יכולה לאפיין שני ממוצעת ותגובות מכאניות המקומיות. להסבר מפורט על השיטה, קוראים מוזמנים לראות את הספר על ידי ²² סאטון.

כדי להשיג שדות מתח על פני השטח הדגימה, טכניקת מתאם תמונה דיגיטלית דו-ממדית (2D-DIC) יכולה לשמש. בקיצור, תמונות של הדגימה נלכדות במדינות טעונות טעונים ושונות. התמונה הראשונה מחולקת לריבועים קטנים בשם תת (פיקסלים M × M) אשר יוצרים רשת לחישוב הבא שלשדות מתח 2D. עמדתו של כל ריבוע בדגימה מעוותת מתקבלת באמצעות אלגוריתם התאמת תמונה. התנועה של כל ריבוע אז מעקב, תמונה-אחרת-תמונה, מניב שדות עקירה אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להפיק הדרגתיים עיוות וזנים באמצעות מגוון רחב של שיטות, כולל אינטרפולציה אלמנט ההולמת או סופית פולינום. בכתב היד הנוכחית, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת להערכה של שדות מתח פני השטח על רקמות כלי דם מקומיות באמצעות שילוב של בדיקות מתיחה uniaxial ו2D-דסק"ש.

פרוטוקול

הערה: ההליכים המתוארים להלן בוצעו כחלק מפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת הדרום קרוליינה בקולומביה, דרום קרוליינה.

1. רקמות רכישה וDissection

1. לעקר את כל הכלים כירורגיים לפני נתיחת רקמה. מספריים החיטוי כירורגית ומלקחיים סטנדרטיים קנס וכן להבי כירורגים תחת לחץ של 15 psi וטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
2. לרכוש סט אחד של חזירי טרי (זכרים landrace בן 7 חודשים, 60-70 קילוגרם) כליות עם אב העורקים ללא פגע מבית מטבחיים מקומי. רקמת תחבורה בחזרה למעבדה בפתרון פוספט 1% קרים שנאגרו מלוח (PBS).
3. מייד עם הגעתו, לבודד את אב העורקים בבטן מרקמות באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים.
4. לשטוף את הכלי שלוש פעמים באמצעות מזרק 50 מיליליטר מלא PBS (pH 7.2). בעזרת המספריים והמלקחיים, להסיר כמה שיותר רקמת perivascular כpossידיהם מבלי להתפשר על שלמות המדגם.
5. אנכי למקם סכין גילוח חד על החלק האמצעי של כלי השיט ולוודא שהוא ניצב לציר אורך הכלי. צור שתי דגימות טבעת כל אחד עם רוחב של כ 20 מ"מ על ידי יישום שלושה חתכים היקפיים רציפים עם סכין הגילוח.
6. אנכי למקם סכין גילוח חד על מדגם טבעת אחד כזה שהלהב מכוון בכיוון רדיאלי. החל כוח חריף להניב חתך רדיאלי, וכתוצאה מכך לדוגמה בצורת רצועה לבדיקות מכאניות uniaxial. מניחים את המדגם בצלחת פטרי מ"מ זכוכית 100 ולצלול בPBS עד היישום של ככתמי פני השטח. חזור למדגם הטבעת השני.

2. יצירת תבנית רבב Surface

1. חבר את מברשת האוויר לשסתום הלחץ.
2. התאם את קוטר הנחיר של airbrush להניב כתמים של 60-100 מיקרומטר (טווח מתאים לקוטר נחיר צריךייקבע ממחקרים ראשוניים).
3. יוצקים כ 2 מיליליטר של צבע סימון רקמה שחורה במזין הכובד של airbrush.
4. מניחים את מברשת האוויר כ -0.5 מ 'מהמדגם.
5. הסר את המדגם מצלחת פטרי. ריסוס צבע רקמת סימון על פני השטח intimal של המדגם לכ -5 שניות תחת לחץ ריסוס של 100 psi. חזור שלוש פעמים כדי לוודא שדפוס רבב אחיד מכסה את פני השטח המדגם.

3. ביצוע ניסויים

1. צרף כל קצה של המדגם לרצועת פלסטיק (עובי אורך x 0.5 סנטימטרים רוחב x 1 סנטימטר 1 סנטימטר) באמצעות דבק רקמות. מניחים את המדגם על קרש חיתוך רקמות. מקם את המדגם כך שהוא שוכב ולמדוד את ממדיו באמצעות קליפר דיגיטלי.
2. ליזום פקדי מערכת לבדיקות מכאניות. במערכת שולטת במסך הבית, בחר "צורת גל" בשורת המשימות ממוקמות בכרטיסיית "ההגדרות".
3. מוֹדָעָהרק את עמדתו של האחיזה העליונה של הבוחן המכני ל-4 מ"מ (הרחבה 4 מ"מ ביחס למצב הראשוני המיועד במערכת). בעדינות לאבטח רצועת פלסטיק אחד (שצורף לדגימה ב3.1) לאחיזה העליונה של הבוחן המכני ולאפשר המדגם לתלות באופן חופשי. השתמש בקליפר הדיגיטלי כדי להבטיח שהמרחק בין המדגם והאחיזה העליונה הוא פחות מ -2 מ"מ.
4. באופן ידני להתאים את המיקום של האחיזה נמוכה יותר, כך שהקצה החופשי של המדגם יכול להיות מאובטח ללא הארכה. בעדינות לאבטח את רצועת הפלסטיק מחוברת לקצה החופשי של המדגם לאחיזה התחתונה של הבוחן המכני.
   1. השתמש בקליפר הדיגיטלי כדי להבטיח שהמרחק בין המדגם והאחיזה הנמוכה הוא פחות מ -2 מ"מ. אפס תא עומס המערכת. מדוד את האורך של המדגם ולהשתמש בזה כאורך התייחסות לחישוב זנים היקפיים הגלובליים.
5. הזן את פרוטוקול הבדיקה המכני. הפרוטוקול המשמש בtההפגנה שלו כרוכה 4 מחזורי עקירת uniaxial אשר האריכו המדגם של 18% בקצב תזוזה של 0.01 מ"מ / שנייה.
6. לסירוגין לרסס PBS על המדגם בכל פרוטוקול הבדיקה שנותר כדי להבטיח שהוא נשאר התייבשות.
7. הר המצלמה (מצלמה 5 מגה פיקסל, עדשת 100 מ"מ, גודל פיקסל של 3.49 מיקרומטר) על גבי חצובה אשר ממוקמת 1.5 מ 'מהמסגרת הטעינה. להבטיח את המצלמה ומשטח מדגם הם ניצבים על ידי הגדרת המצלמה לשדה זמין הנמוך ביותר של עומק ומניפולציה יישורה כך שכל שדה הראייה הוא בפוקוס.
8. פתח את תוכנת לכידת תמונה.
9. בחר "PGR-2" ב" המערכת בחר "האפשרות.
10. בחר את נתיב פרויקט כדי להציל את התמונות כדי להיות מנותח.
11. לחץ על סמל "כיכר הזמן" ולציין את מרווח הרכישה כ5 שניות.
12. התאם את החשיפה, צמצם מספרי, ומוקד של העדשה כדי לקבל תצוגה ברורה של המדגם.
13. להתאים את המיקום של נורית לספק תאורה נאותה על המדגם.
14. לחץ על הסמל "התחל" בתוכנה ללכידה תמונה כדי להשיג תמונה של פני השטח הדגימה.
15. פתח את תוכנת ניתוח תמונה.
16. לייבא את התמונה המתקבלת. קרב על רבב בודד, ולאחר מכן לספור מספר הפיקסלים בתוך רבב אדם זה.
    הערה: זהה רבב שחור נציג. הגדר את גודל רבב כמרחק ליניארי בין פיקסלים בשני הצדדים של רבב שיש ערכים גבוהים דומים. לגודל רבב מקובל, מספר הפיקסלים לרוחב רבב טיפוסי צריך להיות גדול מ 3 פיקסלים. כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית במדידות, צריכים רוב כתמים לא יותר מ 5-7 פיקסלים לרוחב רבב, בכל הזדמנות אפשרית. לפיכך, רבב טיפוסי למקרה זה היה נע בין 10 מיקרומטר בקטנים ביותר ו -23 מיקרומטר בגודלה בממד ליניארי. כדי לקבוע משנה מתאיםגודל, משנה טיפוסי צריך לפחות לבנים 3 ו -3 כתמים שחורים על פני רוחבה. אם רבב טיפוסי הוא 5 פיקסלים בממד ליניארי, ואז כל קבוצת משנה 31x31 תהיה לפחות 105 מיקרומטר בממד ליניארי. המרווח בין מרכזי משנה צריך להיות לפחות 1/6 מהממד ליניארי. לפיכך, לגודל קבוצת משנה 31x31, המרחק הוא 5 פיקסלים המייצג 18 מיקרומטר במרחק יניארי.
17. לאחר אימות איכות דפוס רבב, בו זמנית לחץ על הסמל "הפעל" במערכת וסמל "התחל" בתוכנה ללכידה תמונה כדי להתחיל בבדיקה.
18. ללכוד סדרה של תמונות בכל בדיקות באמצעות תוכנת המצלמה ולכידת תמונה.

4. נהלים נקיים-עד לאחר הניסוי

1. מניחים את המדגם שהושלך בשקית Biohazard ולסגור את התיק. התקשר המחלקה לבריאות הסביבה והבטיחות (EHS) באוניברסיטת הדרום קרוליינה לסילוק נאות.
2. הכן זרחןפתרון חיטוי חינם עם יחס 1:64 דילול של חומר חיטוי חומר ניקוי למים מזוקקים. משרים את הכלים כירורגיים בפתרון זה עבור 20 דקות.
3. לשטוף ביסודיות את הפריטים מתוארים ב4.2 עם מים מזוקקים. ייבש את הכלים בעזרת מגבת נייר ולאחר מכן לרסס אותם עם פתרון אתנול 70%. שוב לייבש את הכלים כירורגיים באמצעות מגבת נייר ולשים אותם בחזרה בארגז הכלים כירורגיים.

5. ניתוח תמונה למדוד שדה הזנים המקומי

1. פתח את תוכנת ניתוח תמונה.
2. לחץ על כרטיסיית "תמונות רבב", לבחור את כל התמונות שצריכות להיות מנותחים.
3. לחץ על כלי מלבן ובחר את האזור של עניין בתמונה הראשונה.
4. הזן את גודל קבוצת משנה 41 × 41 פיקסלים וגודל צעד 5 פיקסלים.
5. לחץ על התחל כרטיסיית ניתוח בתוכנה, בחר באינטרפולציה כ8-מלכודת מותאמת; בחר את הקריטריון כהבדלי אפס מנורמל בריבוע ומשקולות משנה אופציה כגאוס.
6. הגדר את אפשרויות סף כברירת מחדל בתוכנה.
7. לחץ על כרטיסיית משנה שלאחר עיבוד בכרטיסיית ניתוח התחלה. לחץ חישוב מתח אפשרות לעזוב וגודל מסנן וסוג של מסנן כברירת מחדל בתוכנה. מותח בחר את סוג גראנז '.
8. בחר בכרטיסיית נתונים ולאחר מכן בחר כל תמונה ניתחה להדמיה של שדה מתח פני השטח.

תוצאות

נתונים מכאניים שנרכשו מבדיקת ארכה uniaxial ramped ברקמת כלי דם מורכב מעומס לעומת יחסי עקירת מדגם מוטלים בשיעור עקירה נתון. במחקר זה, 2D-דסק"ש בשיתוף עם בדיקות מכאניות uniaxial משמש למדידת שדות מתח פני השטח של הדגימה בכיוונים מאונך במדינות שונות מעוותות. טבע viscoelastic של רקמת כלי דם מתבטא במידה ראויה לציון של hysteresis בעקומות עומס עקירה לפני נפשית מראש מכאניים. כדי לקדם את שחזור של בדיקות מכאניות ולקבל תגובה מכאנית אלסטי, רקמת preconditioned בא...

דיון

למרות שהמחקרים קודמים השתמשו במגוון רחב של שיטות מעקב וידאו-צבע להעריך מתח מדגם ^{18,20,21,23,24,} המטרה הנוכחית שלנו היא לספק מתודולוגיה מקיפה לזוג בדיקות מתיחים uniaxial עם 2D-דסק"ש להערכה זני משטח בדגימות רקמת כלי דם. עם מצלמה ברזולוציה גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה בבית, שדה המתח ניתן למדוד בתוך אזור משטח שנקבע מראש כמדגם עובר טעינת uniaxial. רלוונטי במיוחד לבדיקות מכאניות של רקמת כלי דם, הטכניקה שהוצגה ניתן להתאים באופן ישיר כדי להעריך זני משטח בבדיקות דו-ציריות מישור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בודק מכני מתיחה חד צירי	Enduratec	3230 AT/HR
צבע סימון רקמות כחול http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696
מרסס	Anest-iwata	CM-B	מותאם אישית מיקרון B
מצלמה	נקודת אפור	GS2-GE-50S5M-C
עדשה	טוקינה	AT-X M100
רקמת כלי דם	Caughman Inc
0.9% הזרקת נתרן כלורי PBS	BAXTER HEALTHCARE CORP.
Vic_snap	פתרונות מתאמים
Vic_2D	פתרונות מתאמים
Wintest 4.1	Bose ElectroForce
	3 מיליון ווטבונד	1469SB
חומר חיטוי	פישר סיינטיפיק	04-355-13	Decon BDD Bacdown חומר חיטוי חומר ניקוי