הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)

19.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53643

⸱

25 במרץ 2016

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפעלה חיסונית אימהית (MIA) היא מודל לגורם סיכון סביבתי לאוטיזם וסכיזופרניה. מטרת מאמר זה היא לספק הליך שלב אחר שלב כיצד לגרום ל-MIA בעכברים בהריון על מנת לשפר את יכולת השחזור של מודל זה.

תקציר

מודל הפעלה חיסונית אימהית (MIA) מוערך יותר ויותר כמודל מכרסמים לגורם הסיכון הסביבתי להפרעות פסיכיאטריות שונות. מחקרים רבים הוכיחו כי מודל MIA מסוגל להראות תוקף פנים, בנייה וניבוי הרלוונטיים לאוטיזם וסכיזופרניה. כדי לדגמן MIA, החוקרים משתמשים לעתים קרובות בחיקוי ויראלי פוליאינוסיני: חומצה פוליציטידילית (poly(I:C)) כדי להפעיל את מערכת החיסון במכרסמים בהריון. בדרך כלל, הצאצאים מסכר המופעל על ידי מערכת החיסון מציגים חריגות התנהגותיות ושינויים פיזיולוגיים הקשורים לאוטיזם וסכיזופרניה. עם זאת, הזרקת פולי (I:C) במינונים שונים ובנקודות זמן שונות עלולה להוביל לתוצאות שונות על ידי הפרעה להתפתחות המוח בשלבים שונים. כאן אנו מספקים שיטה מפורטת להשראת MIA על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של 20 מ"ג/ק"ג פולי (I:C) באמצע ההריון 12.5 ימים (E12.5). שיטה זו הוכחה כגורמת לתגובה דלקתית חריפה בציר האם-שליה-עובר, מה שבסופו של דבר מביא להפרעות במוח ולפנוטיפים התנהגותיים הקשורים לאוטיזם וסכיזופרניה.

מבוא

הרעיון של הפעלת החיסון האמהית (MIA) מקורו מחקרים באפידמיולוגיה על הקשר בין זיהום אימהי עם אוטיזם וסכיזופרניה 1. בשל העדר של פתוגנים ויראליים שכפול לגילוי בשליה או במוח העוברי לאחר זיהום ויראלי אימהי 2,3, השפעת הזיהום על הצאצאים משערת להיגרם על ידי הפעלת המערכת האימהית החיסון ולא פתוגנים עצמם .

כדי להבהיר את היחס אפקט-ו-הגורם בין MIA והפרעות פסיכיאטריות, הזרקת מסונתז כימית, polyinosinic גדילי RNA כפול ויראלי לחקות: חומצה polycytidylic (פולי (אני: C)) לתוך מכרסמים בהריון כבר בשימוש נרחב כמו במודל חיה עבור MIA 4,5. פולי (אני: C) הוא מוכר על ידי קולטן לחיוג כמו 3 (TLR3), ומנהל מערכתי של פולי (אני: C) גורם לתגובה דלקתית חריפה ויראלי דמוי. אחד המנגנונים שבאמצעותם פולי (אני: C) יחסי ציבורליקויי neuropathologies התנהגותי oduces אצל צאצאיהם הם לגרום לחוסר איזון של ציטוקינים דלקתיים פרו ואנטי בציר האימהי-שליה-העוברי 6. כמה קבוצות אימצו את המודל MIA להבין את האטיולוגיה של הפרעות פסיכיאטריות 7, ובשל אינטרסים מגוונים בקרב קבוצות מחקר, בנקודות זמן שונות של הפעלה חיסונית שימשו להשיג הפרעות שונות על התפתחות המוח והתנהגויות 7.

המעבדה פול ה פטרסון במכון הטכנולוגי של קליפורניה מאמצת את האסטרטגיה של הזרקת פולי (אני: C) לעכברים בהריון עובריים 12.5 ימים (E12.5), אשר הוכיחה בהצלחה כי MIA הוא מסוגל גרימת התנהגותי, נוירולוגיות, ושינויים אימונולוגיים אצל צאצאיהם המשויכים אוטיזם וסכיזופרניה 8-11. העבודות הקודמות שלנו מראות כי צאצאי MIA להציג ליקויים התנהגותיים (למשל, impairmen החברתיt, גירעון תקשורת, התנהגות שחוזרת על עצמו, התנהגות כמו חרדה, ונסתרי עיכוב גירעון 8,10,12), חוסר איזון dysregulation וציטוקינים חיסוני 8,13,14, שינוי של ביטוי גנים במוח עוברי 15, אובדן של תאי פורקינג ב lobule VII של מוח קטן 11, שינוי של נכסים הסינפטי בהיפוקמפוס 9, אינטראקצית סביבת x גן 13, שינוי של חדירות מעי, ורכב חיידקים במעיים 16. יתר על כן, אסטרטגיות טיפוליות-מונעות מפותחות גם 13,16,17 מערכת מודל זה. גרימת MIA ב E12.5, ואחרים הראו כי MIA מייצרת ההפעלה microglial עוברית שינוי התפתחותי כולינרגית בקידמתו הבזליים 18, אינטראקציה ספציפית זן 19, המוח מוחין synaptosomal מומים ultrastructural, מומים hyperfunction שרשרת הנשימה במיטוכונדריה מוחין, downregulation של מולקולות synaptosomal מוחין 17 ,התנהגויות דיכאוניות דמוי, ירידת קוגניציה הגברה לטווח ארוך בהיפוקמפוס (LTP), והגירעון הנוירוגנזה בהיפוקמפוס מבוגר 20.

כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת של איך לגרום MIA ב E12.5 ידי פולי (אני: C), כמו גם פרדיגמות של איך ליישם מודל זה ללמוד את האטיולוגיה של אוטיזם וסכיזופרניה. חשוב לציין כי MIA הוא גורם סיכון עבור מגוון רחב של הפרעות 4, ותוצאותיה רגישות במיוחד את הזמן ואת שיטת האינדוקציה וכן הבעלים של הסכרים בהריון. ככזה, אפילו סתירות קלות בין מעבדות לעתים לגרום שחזור נמוך ו / או פנוטיפים שונים אצל צאצאיהם. השיטה שלנו היא תוכננה במיוחד עבור אלו המעוניינים ללמוד MIA כגורם סיכון סביבתי לאוטיזם וסכיזופרניה, ואת התיאור המפורט הניתנים יסייע לחוקרים לשפר השחזור של הנתונים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים בוצעו תחת האישור של המכון בקליפורניה של טיפול בבעלי חיים מוסדי טכנולוגית ועדת השימוש (IACUC).

1. הכנה עבור זוגות מתוזמן-הזדווגות

  1. השתמש לפחות 6 סכרים עבור ניסויים התנהגותיים ו -3 עבור ניתוח ביטוי גנים.
    הערה: משתמש כפול ממספר עכברות מוערכות, כמו שרק כ -50% מהעכברים יהיו פקוק מן-הזדווגות מתוזמן.
  2. השתמש עכברות ללא הריון מוקדם ועל פי 8-16 שבועות של גיל.
    הערה: עכברות שיש חשיפה מינית לפני עכברי זכרים אבל לא הייתה בהריון כשרים.
  3. בית נקבות העכברים יחד ומניחים הכלובים אחד ליד השני כדי לסנכרן מחזור הייחום שלהם. השתמש כלוב עכברים רגיל עם גובה של מעל 5.5 אינץ ורצפת אינץ 'מרובע פן 75 על מנת לאפשר דיור 5 עכברים בוגרים. לייבל כל עכברה באמצעות אגרוף באוזן.

2. הגדרת מתוזמן-מחצלתing זוג

  1. הגדרת שעות 0-2-הזדווגות מתוזמן לפני המחזור הכהה מתחיל. מניחים שתי עכברות בכלוב אחד. להוציא העכברים ולשקול אותם בנפרד. רשום את משקל הגוף של כל עכבר נקבה.
  2. יש לשים את סמן אחד זכר לתוך כל כלוב עם שני נקבות העכברים. השתמש הזדווגות שלישייה כדי למזער את השפעת הבלבול האבהית.

3. בדוק תוסף הנרתיק (E0.5)

  1. בדוק את hr נקבת עכברי 0-4 לאחר חושך המחזור מסתיים. הרם בעדינות את העכברה מבסיס הזנב ולאפשר בעכבר כדי לתפוס את רשת התיל, עליון כלוב, או קצה כלוב.
  2. חפש סימני תוסף הנרתיק: תוסף הנרתיק הוא מסה לבנבן גלוי פתח הנרתיק. אם התקע אינו מובן מאליו, בעדינות להכניס קצה פיפטה 200 μl לתוך פתח הנרתיק. התנגדות מן הקרישה מאשר היווצרות תוסף נרתיק. בדוק את תוסף הנרתיק פעם ביום.
    הערה: תוסף הנרתיק הוא רק אינדיקציה לכך הזדווגות התרחשה, ולכן לא גרםהריון uarantee. תוסף הנרתיק עלול להיות קשה לזהות זנים מסוימים של עכברים. פנה לעזרה מתוך מטפלת עכברים מנוסית כדי להגדיל את הדיוק של זיהוי תקע.
  3. הזז את העכברים הם מחוברים כלוב חדש וקבוצה לשכן אותם. הגדר את היום של הופעת תוסף נרתיק כמו 0.5 יום עוברי (E0.5).

4. ביום E10.5-11.5, בדקו הריון

  1. הרם בעדינות את בבסיס הזנב ולאפשר בעכבר כדי לתפוס את רשת תיל, העליון כלוב, או קצה הכלוב. שים את אזור הבטן כדי לבדוק סימנים של הריון, למשל, בליטה באזור הבטן (איור 1).
    הערה: הסימן של הריון הוא תמיד יותר מובן מאליו E11.5 מאשר E10.5.
  2. לשקול את העכברים כדי לוודא הריון. העכבר בהריון בדרך כלל שוקל כ 20% יותר כבד ב E10.5 ו -30% יותר כבד ב E12.5 בהשוואה לעכבר שאינן בהריון (איור 2). בית בודד העכברים בהריון בכלובים נקיים.

5. 20 מ"ג /ק"ג פולי (אני: C) הכנה

  1. השתמש לפחות 6 סכרים לכל קבוצה עבור ניסויים התנהגותיים ו -3 לכל קבוצה עבור ניתוח ביטוי גנים. הכן את הסכום המתאים של פולי (אני: C) פתרון.
  2. לשקול את פולי (אני: C) אבקת צינור חרוטי 50 מ"ל לעשות לריכוז סופי של 40 מ"ג / מ"ל. על מנת למזער ולתקנן את הלחץ שנגרם על ידי נפח הזרקה, להזריק 5 μl של פולי (אני: C) פתרון עבור כל גרם של משקל גוף העכבר (5 μl / g, או 5 מ"ל / ק"ג). כדי לגרום MIA, אנו מזריקים 20 מ"ג של פולי (אני: C) לק"ג.
    הערה: ריכוז פולי (אני: C) הפתרון הנדרש הוא (20 מ"ג / ק"ג) / (5 מ"ל / ק"ג) = 4 מ"ג / מ"ל. מאז פולי (אני: C) אבקת מכיל 10 פולי% (אני: C), אנחנו צריכים לעשות לריכוז סופי של (4 מ"ג / מ"ל) /0.1= 40 מ"ג / מ"ל ​​של פולי (אני: C) פתרון.
    זהירות: פולי (אני: C) אבקה קלה מאוד. תיזהר לא לאבד את כל אבקה בעת ההעברה מן המרית אל צינור החרוטים.
  3. מוסיף את הנפח המקביל של נתרן כלורי 0.9% (מלוח) לתוך האמבטיה חרוטידואר ולסגור את המכסה. ממס את האבקה על ידי הגלגול המלוח האגל בעדינות על פולי (אני: C) האבקה עד הפתרון הוא ברור. צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG דקות 1 (איור 3 ג). סנן את פולי (אני: C) פתרון על ידי 0.22 מיקרומטר הסינון. מעבירים את פולי (אני: C) הפתרון צינור 1.5 או 2 מ"ל microcentrifuge. אופציונלי: השתמש ספקטרופוטומטר למדוד את היחס 260/280 של פולי (אני: C) פתרון. ודא היחס הוא בין 1.54-1.82 (איור 3) כפי שתואר על ידי היצרן. הערה: המלח משמש כדי לפזר פולי (אני: C) אבקה ולשמש הזרקת בקרה צריכה להיות בכיתת סטרילית תרופות.

6. מלוחים או פולי (אני: C) הזרקה על E12.5

  1. לשקול את העכבר על הסקאלה והחזיר אותו לתוך הכלוב. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ההזרקה הן מליחים פולי (אני: C) עכברים: משקל גוף (ז) כפול 5 = נפח הזרקה הרצוי (μl). השתמש insul 0.3 מ"לב מזרק לצייר את הווליום של תמיסת מלח או 20 מ"ג / ק"ג פולי מחושב (אני: C) פתרון, למשל, 150 μl עבור עכבר 30 גרם.
  2. בעדינות להרים את העכבר על ידי בבסיס הזנב ולמקם אותו על גבי הכלוב. להתמודד עם העכבר בעדינות כדי למנוע תופעות של בלבול הנגרמות על ידי מתח. הכנס את המחט, שפוע עד, בערך בשעה 20 ° ביחס העכבר למרכז שתי פטמות העליונות (איור 4), ולהזריק את מלוחים או פולי (אני: C) פתרון. הערה: המחט צריכה להיות מוחלף עבור כל עכבר לאחר ההזרקה.
  3. מניחים את העכבר חזרה לכלוב בבית שלו. מניח את הכלובים בחדר תנועה שקט, נמוך כדי למנוע את תופעות בלבול האחרות.

7. היום שאחרי פולי (אני: C) הזרקה (E13.5)

  1. בדקו את העכברים שהוזרקו על למחרת. השתמש בקנה מידה למדוד משקל גוף.
    הערה: פולי (אני: C) מוזרקת עכברות הרות בדרך כלל משמין פחות מלוח מוזרק עכברים ביום שאחרי injשיקוף.
  2. נא לא להפריע העכברים עד הצאצאים נולדים.

מד 8. Offspring MIA

  1. על מנת למזער את ההשפעות של בלבול אינדוקצית MIA, פעל בהתאם להנחיות שלהלן, כדי לאמוד את השימוש של צאצאי MIA.
    1. אל תכלול את ההמלטות מן מוקדם או לידה מתעכבת, או אם גודל ההמלטה הוא קטן מ -5.
    2. להרדים את הגורים המופרזים על ידי ה- CO 2 אם גודל ההמלטה הוא גדול מ -10.

9. אופציונליים: לבחון את התגובה הדלקתית החריפה לאחר MIA

  1. להקריב את עכברי 3 שעות להריון לאחר מלוחה או פולי (אני: C) הזרקה בשיטה כמתואר בפרוטוקול הוועדה שאושרה לטיפול בבעלי החיים של המוסד.
    הערה: נקע בצוואר רחם בדרך כלל עדיף כפי שהוא ממזער את ההשפעה של CO 2 / המתת חסד תרופות על הסכר עובר.
  2. אסוף את הטחול של עכברים בהריון מבוגר ולבודד את השליה החזייה עובריתב תחת סטראו.
    1. לקבלת אוסף הטחול, להניח את העכבר על צלחת לנתיחה ולרסס 70% אתנול על אזור הבטן של עכברים בהריון. השתמש זוג מספריים סטרילי לעשות חתך אנכי במרכז אזור הבטן מתחת בית החזה דרך העור.
    2. הטחול יושב ברבע הבטן המעולה השמאל. שימוש במלקחיים כדי לבודד את הטחול. מגלגל את הטחול על מגבי משימה עדינים להסיר את רקמת השומן סביב האיבר. אסוף בערך 50 מ"ג של רקמת טחול ומניח אותם בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol כדי למנוע שפלת חומצות גרעין. אחסן את דגימות ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
    3. לקבלת אוסף השליה, משוך בעדינות את קרן הרחם מהגוף. מניח את קרן הרחם בצלחת פטרי המלאה בופר פוספט autoclaved (PBS) ולהשאיר את המנה על קרח. השתמש בשתי מלקחיים לקרוע את דופן הרחם ולחשוף את שק מי השפיר.
      1. בזהירות להשתמש במלקחיים כדי לפתוח את שק השפיר מבלי לפגוע השליה והעובר. הפרד את השליה של העובר ולחתוך את חבל הטבור קרוב השליה ככל האפשר. הסר את פסולת שק השפיר מהשליה. מניחים את השליה בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol. חנות המדגם ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
    4. לקבלת אוסף המוח העוברי, לאחסן העובר RNA לייצב חיץ משלב 9.2.2 עד לנתיחה. להקניט את קרום pial ומהחדר של המוח באמצעות # 5 מלקחיים עדינים תחת סטראו. מוציאים בזהירות את כל קרום מהמוח עוברי. מניחים את המוח העוברי בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol. חנות המדגם ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
  3. חלץ את RNA מרקמות ולהמיר את RNA ל cDNA. ניתוח ביטוי גנים Il6 ב cDNA ידי-t אמיתיIME PCR.
  4. חלץ את RNA מן הרקמות על ידי ביצוע הפרוטוקול לייצור TRIzol. אם הרקמות מאוחסנות במאגר ייצוב RNA. להפשיר את המדגם ומסובב למאגר. העברת רקמה על ידי טיפ eppendorf אחר עם 500 μl TRIzol ולהמשיך מיצוי RNA.
  5. השתמש ספקטרופוטומטר למדידת ריכוז, 260/280 ו 260/230 יחס של RNA. ודא היחסים הם מעל 2.0.
  6. לחסל את זיהום הדנ"א על ​​ידי טיפלו RNA עם DNase I. מערבבים 1 מיקרוגרם RNA, 1 μl חיץ התגובה 10X, 1 μl RNase ללא DNase, ומים חופשי nuclease לנפח סופי של 10 μl. דגירת תערובת האמן על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 1 פתרון DNase להפסיק μl כדי לסיים את התגובה. דגירה את התערובת על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  7. הפוך לתמלל את RNA ל cDNA. השתמש 20 תגובות μl, ועד 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל לכל תגובה. מערבבים 4 μl 5x שעתוק לאחור (RT) חיץ תערובת התגובה, 1 μl reverse טרנסקריפטאז, 11 תבנית RNA μl לאחר הטיפול עם DNase אני 4 μl nuclease ללא H 2 O לבצע פתרון 20 μl הסופי. לתכנת את תנאי Cycler תרמית עבור RT. תנאי הגנרית כוללים: שלב 1: 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 2: 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות; שלב 3: 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 4: להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס. לדלל את cDNA 5 פעמים. עבור אחסון לטווח קצר, אחסן את cDNA ב 4 ° C.. עבור אחסון לטווח ארוך, להקפיא את cDNA ב -20 ° C.
  8. ניתוח ביטוי גנים Il6 ב cDNA על ידי PCR בזמן אמת לנרמל את ביטוי הגנים Il6 כדי בטא אקטין ביטוי גנים.
    1. הכן תערובת אב Il6 וזיהוי β-אקטין. השתמש 25 התגובה μl, מיקס מאסטר עבור כל גן כולל 12.5 μl SYBR גרין מיקס, 0.5 μl של 10 פריימר מיקרומטר קדימה, 0.5 μl של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה ו -6.5 μl nuclease ללא H 2 O.
    2. מקום 5 μl 5x cDNA מדוללt בתחתית הבאר של צלחת תגובה 96-היטב אופטית. פיפטה 20 μl של תמהיל אמן זה טוב לעשות תערובת PCR 25 μl סופי. בשלושה עותקים כל גן עבור כל דגימה. חותם את הצלחת באמצעות סרט דבק אופטי. ספין למטה את הצלחת ב 800 XG 3 דקות ב 4 ° C השתמש בתכנית הרמה בזמן האמת PCR: שלב 1: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב 2: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות; שלב 3: 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות וטמפרטורה 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. להוסיף צעד נוסף עבור עקומת דיסוציאציה.

10. בדוק את חריגות ההתנהגות Offspring למבוגרים MIA (אופציונלי):

  1. לבצע את בדיקות התנהגות בגילי 8-12 שבועות. שנה את המצעים כלוב לפחות 3 ימים לפני הבדיקה. להסתגל העכברים לחדר בדיקות התנהגותיות לפחות 30 דקות לפני הבדיקה.
  2. עבור עיכוב prepulse (PPI), לרסן את העכברים גליל פרספקס עם חיישן piezo חשמלי מתחתיו. להסתגל העכברים אל PPIתא למשך 5 דקות. לחשוף את העכברים עם 6 ניסויים של 120 רעש לבן dB (בהלה).
  3. ואז לחשוף את העכברים עם תערובות אקראיות של 14 מחקרים של רעשי רקע, 14 מחקרים של רתיעה, 14 מחקרים של prepulse 5 dB (5 dB גבוה רעש רקע) + הרתיעה (PPI5), ו -14 ניסויים של prepulse 15 dB (15 dB גבוה מ רעשי רקע + רתיעה (PPI15).
  4. הממוצע את תגובת בהלה עבור 6 הניסויים הראשונים של 120 ניסויים dB. הממוצע את תגובת בהלה עבור גירויים בודדים אחרים. סמוי ערך עיכוב prepulse ידי (רתיעה - PPI5 או PPI15) / רתיעה.
  5. עבור בדיקת שדה פתוח, במקום את העכבר בפינה של זירת כיכר פתוחה (50 x 50 x 50 סנטימטרים 3). רשום את מסלולו של העכבר במשך 10 דקות באמצעות מצלמת רכוב תקרה. הגדר את מרכז הזירה כאזור מרכז (17 x 17 ס"מ 2). לכמת את המרחק, ערכי אזור המרכז, ואת משך זמן באזור המרכז ידני או על ידי תוכנת ניתוח אוטומטי מבוסס תמונה.
  6. עבור בדיקה לקבור שיש, לאקלם את העכבר לכלוב בדיקה עם עמוק 5 סנטימטר דחוס, נקיים, מצעי אורן אספן במשך 10 דקות. החזר את העכבר homecage שלה. למקם בעדינות 20 גולות זכוכית 1.5 ס"מ קוטר כחול כהה בצורה של 4 x 5 ההסדר. מניחים את העכבר חזרה לכלוב הבדיקה עם גולות במשך 10 דקות. ספירת גולות כי כבר קבור משך הבדיקה 10 דקות.

11. בדוק בנוירופתולוגיה המוח הקטן אצל צאצאיהם למבוגרים MIA (אופציונלי):

  1. להרדים את מליחי צאצאים בוגרים MIA על ידי הרדמה. Perfuse את העכבר עם 50 מ"ל PBS ולאחר מכן 50 מ"ל 4% paraformaldehyde דרך מערכת הלב וכלי הדם.
  2. הסר את המוח בזהירות postfix המוח paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס. שוטפים את המוח עם PBS שלוש פעמים ולאחסן את המוח ב- PBS עם אזיד הנתרן 0.02% ב מקרר 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: המוח postfixed ניתן לאחסן PBS עם 0.02% טפשאזיד ium במקרר עד חודש.
  3. סעיף המוח לתוך 50 מיקרומטר פרוסות דקות sagittally באמצעות vibratome. אסוף את החלקים במוח באמצעות עט מברשת רך. להפסיק את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים את הסעיפים מי חמצן 0.6% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. דגירת מקטעי נוגדן אנטי calbindin מדולל למאגר חסימה (סרום עיזים 10% עם יזיד הנתרן 0.1% Triton X-100 לבין 0.02% ב PBS) למשך הלילה בטמפרטורת חדר. ואז דגירה את הסעיפים המתאימים נוגדנים משני biotinylated מדולל חסימת חיץ עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. דגירת מקטעי DH avidin - חיץ peroxidase H מורכב Biotinylated לזהות את ביוטין עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. לפתח את החלקים באמצעות מצע peroxidase לדמיין את האנטיגן. שטפו את החלקים עם PBS שלוש פעמים בין השלבים. הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ. תמונת הסעיפים תחת מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרקה של 20 מ"ג / קילו פולי (אני: C) ב E12.5 יכולה לעורר תגובה דלקתית חריפה בציר האימהי-שליה-עוברית לזרז השפעה כרונית להתפתחות מוח פנוטיפים התנהגותיים 12,13. רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת, Interleukin (IL) -6, הוא אינדיקטור אמין של תגובה דלקתית חריפה לאחר MIA. זמן השיא עבור ביטוי גנים Il6 בשליה והמוח של העובר נמצא hr 3 שלאחר פולי (אני: C) הזרקת 12,13. הראינו פולי (אני: C) גורם ביטוי גני Il6 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MIA אינדוקציה בחלונות זמן שונים מדאיגה אירועי התפתחות המוח שונים במכרסמים, וכתוצאה מכך מובילה ליקויי neuropathologies התנהגותיים שונים אצל צאצאיהם. כאן, אנו תארנו פרוטוקול לגרום MIA בעכברים עם פולי (אני: C) הזרקה ב E12.5. שיטה זו של אינדוקצית MIA מובילה התנהגותי, נוירולוגיות, אימונולוגית, וחריגות עיכול הקשורים לאוטיזם וסכיזופרניה אצל צאצאיהם 8,10,11,16. חשוב לציין, כי MIA הוא גורם סיכון סביבתי, את הפנוטיפ של הצאצאים צפויים להיות וריאציה גבוהה מזו של עכברים ממודלים גנטיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו לכבד את פול ה פטרסון המנוח ד"ר על תרומתו התקדמות המודל MIA, אוטיזם, סכיזופרניה ומחקר. אנו מכירים סרקיס ק Mazmanian עבור אהדתו הגדולה על פרוטוקול זה; רובן מ באיון, איווט גרסיה-פלורס, קארן ג Lencioni, ולסלי א נוימן לסיוע מינהלי; עלי Khoshnan ויאן ג Ko על הסיוע על הצילומים; איליין י סיאו ונטליה Malkova עבור עצתם על אינדוקציה MIA; ג'פרי ס Cochrane, חואקין גוטיירז, קוואן פ לי, חיימה רודריגז, לורנה ג סנדובל, ונטלי א Verduzco לגידול צאן המומחה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס מרכז NIH קונטה (NIH 5P50MH086383-04, לפול ח פטרסון); Autism Speaks (# 7670, לפול ח פטרסון); סימונס קרן (# 322,839, כדי סרקיס ק Mazmanian); אימון NIH גרנט (NIH / NRSA T32GM07616 כדי ק-HC); מלגת מחקר לתואר ראשון קיץ Caltech (SURF) (כדי ZY); Amgen חוקרים תוכנית בקלטק (כדי ZY); ו fr אחוות דוקטוריםאום הלאומית למדע המועצה, טייוואן (המל"ל 101-2917-I-564-039, לו'-LW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פולינוזיני– חומצה פוליציטידילית מלח אשלגןSIGMAP9582
0.9% נתרן כלורי INJ. USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT אינסולין סירינג' 3/10 מ"ל 29 גרם x 1/2 אינץ'COVIDIEN8881600145
50 מ"ל צינורות כובע בורג חרוטיארה"ב SCIENTIFIC1500-1211
Nanodrop 1000 ספקטרופוטומטרTHERMO SCIENTIFIC1000
סטריאומיקרוסקופאופציונלי Wild HeerbruggM5Aאופציונלי
Dumont #5 מלקחיים קצה אינוקס גודל .10 X .06 מ"מRobozRS-5045מגיב
ייצוב RNA אופציונלי RNAlaterQiagen76104מגיב
TRIzolLife Technologies15596-026 אופציונלי
RQ1 ללא Rnase, DNasePromegaM610Aערכת
סינתזה אופציונלית iScript cDNABio-Rad170-8891אופציונלי
FastStart אוניברסלי SYBR ירוק מאסטר תערובת עם ROX Roche4913922001אופציונלי
PCR בזמן אמתABI7300אופציונלי
: Il6 forwardLife TechnologiesTAGTCCTTCCCCCCCAATTTCCאופציונלי
: Il6 ReverseLife TechnologiesTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCאופציונלי
: beta-actin forwardLife TechnologiesAGAGGGAAATCGTGCGTGACאופציונלי
פריימר: בטא-אקטין טכנולוגיות חיים הפוכותCAATAGTGATGACCTGGCCGTאופציונלי
מיקרו-אמפ אופטי 96 בארותצלחת תגובה טכנולוגיות חיים4306737Optionl
MicroAmp סרט דבק אופטי Life Technologies4311971Optionl
EthoVisionNoldusEthoVisionOptionl
מכשירי SR-LAB (PPI)San Diego Instruments SR-LABOptionl
שישPENN-PLAXאבני חן כחולות Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Life Technologies21600-069Optionl
ParaformaldehydeMACRON2621-59Optionl
VibratomeLeicaVT1000 SOptionl
נתרן אזידSigmaS2002Optionl
Triton x-100SigmaX100Optionl
תמיסת מי חמצןSigma18312Optionl
Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
Optionl Rabbit נוגדן נגד קלבינדיןAbcamab11426
Optionl עז ביוטינית נגד ארנב IgGantibodyVector LaboratoriesBA-1000Optionl
VECTASTAIN ABC KitVector LaboratoriesPK-4000Optionl
אופציונלי פריימר פריימר פריימר

מקורות

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98(2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380(2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240(2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363(2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Poly I C12 5peritonealPre pulse InhibitionIl6
אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.