Method Article

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-מערך נוגדנים כטכנולוגיה מפותחת מאותגר כיום על ידי כמה טכנולוגיות מבוססות או מתפתחות אחרות בעלות תפוקה גבוהה. בדוח זה, אנו מחדשים את טכנולוגיית מיקרו-מערך הנוגדנים על ידי שימוש בגישה חדשה לייצור ועל ידי הצגת תכונות חדשות. הייצור של מיקרו-מערך הנוגדנים בצפיפות גבוהה שלנו מושג באמצעות דפוס זרימה מכוון בניצב של DNA חד-גדילי והמרה לאחר מכן בתיווך מצומדים של נוגדנים ל-DNA. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים בדפוס זרימה של DNA, ייצור וטיהור מצומדים של נוגדנים ל-DNA, והערכת איכות המיקרו-מערך המפוברק. האחידות והרגישות ניתנות להשוואה למיקרו-מערכים קונבנציונליים, בעוד שייצור המיקרו-מערך שלנו אינו דורש סיוע של מדפסת מערך וניתן לבצע אותו ברוב מעבדות המחקר. היתרון העיקרי הנוסף הוא שגודל יחידות המיקרו-מערך שלנו קטן פי 10 מזה של מערכים מודפסים, מה שמציע את היכולת הייחודית לנתח חלבונים פונקציונליים מתאים בודדים בעת התממשקות עם עיצובי שבבים גנריים. ניתן להשתמש בטכנולוגיית ברקוד זו באופן נרחב בזיהוי סמנים ביולוגיים, מחקרי איתות תאים, הנדסת רקמות ומגוון יישומים קליניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microarrays הנוגדן היה בשימוש נרחב במחקרי proteomic במשך עשרות שנים כדי לבחון את נוכחותם של חלבונים ממוקדים, כוללים סמנים ביולוגיים חלבון 1-3. למרות שתחום זה ניצבת כיום בפני אתגרים גדולים מטכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות כגון ספקטרוסקופיית מסות (MS), יש עדיין הרבה מקום לשירות של microarrays נוגדנים, בעיקר משום שמכשירים אלה להרשות לעצמם נתונים לפרשנות פשוטה וממשק קל עם מבחני אחרים. בשנים האחרונות, שילוב של microarrays לפיגומי שבב סיפק microarray נוגדן הזדמנות חדשה לשגשג 4-7. לדוגמא, microarray ברקוד המשולב בשבב תא בודד בו נעשה שימוש במחקרי תקשורת סלולארי 8,9. טכנולוגיה זו יש יתרונות ייחודיים על פני טכנולוגיות microarray זמינות אחרות. הוא כולל אלמנטים במערך ב10-100 מיקרומטר, קטן בהרבה מהגודל הטיפוסי 150 מיקרומטר משמש בelemen microarray הקונבנציונליTS. הבנייה של אלמנטים במערך קטנים יותר מושגת באמצעות גישות זרימת דפוסים שיטתיות, וזה מעורר microarrays הקומפקטי שיכול לזהות חלבוני תא בודד מופרשים וחלבונים תאיים. יתרון נוסף הוא השימוש בהתקנה פשוטה, ללא מכשיר. הדבר חשוב במיוחד, משום שרוב המעבדות וחברות קטנות לא יכולים להיות מסוגלות לגשת למתקני גרעין microarray. microarrays הנוגדן ברקוד כגון תכונה משופרת תפוקת assay וניתן להשתמש בו כדי לבצע מבחני מרובבים מאוד על תאים בודדים תוך השגת רגישות גבוהה וספציפיות דומה לזו של assay immunosorbent כריך אנזים צמוד הקונבנציונלי (ELISA 8). טכנולוגיה זו מצאה יישומים רבים באיתור חלבונים מגליובלסטומה 9-11, תאי T 12, ומחזור התאים סרטניים 13. לחלופין, מערכי DNA ברקוד לבד כבר נוצלו במיקום המדויק של תאי עצב והאסטרוציטים ללחקותing ההרכבה vivo של רקמת מוח 14.

פרוטוקול זה מתמקד רק בשלבי הניסוי ולוקי הצטברות של microarray הנוגדן ברקוד דו-ממדי (2-D) שבה יש יישומים פוטנציאליים בזיהוי של סמנים ביולוגיים בדגימות fluidic ובתאים בודדים. הטכנולוגיה מבוססת על microarray דנ"א חד-גדילים, חד-ממדי (1-D) מיעון נבנה באמצעות oligonucleotides מאונך שהם בדוגמת מרחבית על מצעי זכוכית. דפוס 1-D נוצר כאשר זרימת ערוצים מקבילים המשמשים בשלב זרימת הדפוסים, ודפוס כזה מופיע כלהקות דיסקרטיות חזותי דומות ל1-D Universal Product Code (UPC) ברקודים. בניית מערך נוגדן 2-D (מ 'x n) - מזכירה קוד מטריקס 2-D מהיר התגובה (QR) - צריכה אסטרטגיות דפוסים מורכבות יותר, אך מאפשרת לקיבוע של נוגדנים בצפיפות גבוהה 8,15. הייצורדורש שני שלבי דפוסי DNA, עם הדפוס הראשון בניצב לשני. נקודות חיתוך של שני דפוסים אלה מהווים את המרכיבים מ 'x n של המערך. על ידי בחירה אסטרטגית הרצפים של DNA חד-גדילים (ssDNA) מנוצל בזרימת דפוסים, כל אלמנט במערך נתון מוקצה כתובת ספציפית. התייחסות מרחבית זה הכרחי בהבחנה בין אותות הקרינה בשקופית microarray. מערך ssDNA מומר מערך נוגדן דרך ההתאגדות של conjugates DNA-נוגדן המשלים, ויצר פלטפורמה שנקראת ספריית נוגדן בקידוד ה- DNA (DEAL 16).

פרוטוקול וידאו זה מתאר את השלבים העיקריים ביצירת מערכי nxm נוגדן הכוללים הכנת polydimethylsiloxane (PDMS) תבניות ברקוד, זרימת דפוסים ssDNA בשני כיוונים, הכנת conjugates DEAL הנוגדן-oligonucleotide, והמרת מערך 3 x 3 DNA ל3x 3 מערך נוגדנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהירות: כימיקלים כמה שימוש בפרוטוקול זה הם מגרים ומסוכנים במקרה של מגע עם עור. התייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) וללבוש ציוד מגן אישי מתאים לפני ביצוע פרוטוקול זה. פתרון Piranha משמש בשלב (1.1.1) הוא מאכל מאוד וצריך להיות מוכן על ידי הוספת חמצן לאט לחומצה עם תסיסה. ידית פתרון זה בזהירות רבה במנדף. השתמש בהגנה על העין מתאימה וכפפות עמידות חומצה. Trimethylchlorosilane (TMCS) הוא חומר כימי מאכל, דליק המשמש בשלב אופציונאלי אחרי (1.1.6). ידית כימית זה במנדף.

הערה: בצע את ייצור השקופיות ברקוד ונהלי זרימת דפוסים קריטיים בחדר נקי כדי למזער זיהום על ידי חומר חלקיקים. חלקיקי אבק עלולים לחסום את היציאות וmicrochannels של תבניות PDMS ולהפריע לזרימת דפוסים.

1. בנייה-dimensiona אחתשקופיות l DNA ברקוד

  1. הכנת המאסטר SU-8 לזרימה ברקוד דפוסים
    הערה: הציורים לתבניות זרימה בניצב (איור 1 א-B) נוצרים באמצעות תוכנה בעזרת מחשב עיצוב (CAD). דפוסים אלו ניתנות על photomask כרום. אזורים שקופים של המסיכה מתאימות לתכונות של המאסטר SU-8.
    1. נקה פרוסות סיליקון (100 מ"מ קוטר) ביסודיות בתערובת של 3 H 2 SO 4: 30% 2 O 2 (פתרון פיראניה) H 1 מחומם ל- 96 מעלות צלזיוס. לשטוף את הרקיק עם מים ללא יונים ואלכוהול איזופרופיל, ואחריו על ידי ייבוש עם אקדח מכת חנקן.
    2. יוצקים על 4 מיליליטר של photoresist SU-8 2,025 על פרוסות סיליקון. השתמש בcoater ספין לתכנות כדי להפיץ באופן אחיד על photoresist הרקיק במשך 10 שניות ב 500 סל"ד, אז 30 שניות בסל"ד 3000. זה יוצר שכבת photoresist בעובי של ~ 25 מיקרומטר. בהדרגה לאפשר מסתובב להאט לפני העצירה - זה למאיntain אפילו ציפוי על פני השטח של פרוסות סיליקון.
    3. אופים את פרוסות מצופים על פלטה חמה דקות 1 על 65 מעלות צלזיוס, אז במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. צעד זה מאפשר לציפוי כדי לחזק. מגניב RT במשך 5 דקות.
    4. מניחים את מסכת הכרום (איור 1 ג) על מעיל photoresist. לחשוף את תכונות המסכה ליד-אור UV (350-400 ננומטר, אנרגיית חשיפה 150-160 mJ / 2 סנטימטר) במשך 20 שניות.
      הערה: העיצוב על מסכת הכרום מכיל 20 ערוצים, כל אחד מהם הם 20 מיקרומטר רחבים עם 50 מיקרומטר המגרש. הערוצים מתפתלים מקצה אחד של התבנית לקצה השני. בסך הכל, 20 הערוצים לכסות שטח מלבני באורך של 40 מ"מ ~ ורוחב של ~ 20 מ"מ. כל ערוץ מוקף שתי תכונות מעגליות שמתאימות לכניסה ויציאה. פתחי הכניסה ושקעים ניתנים להחלפה.
    5. אופים את פרוסות נחשפו על פלטה חמה למשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. מגניב RT בהדרגה.
    6. לטבול את פרוסות במפתח SU-8 עם תסיסהבמשך 5 דקות. לשטוף את הרקיק עם חלק קטן של מפתחי SU-8 טריים, ואחריו אלכוהול איזופרופיל. ייבש את הרקיק באמצעות אקדח מכת חנקן. קשה לאפות את הרקיק על פלטה חמה C ° 200 למשך 30 דקות, ולאפשר הרקיק להתקרר בהדרגה לRT.
      הערה: פיתוח יכול להתבצע במשך זמן ארוך יותר אם סרט לבן הוא ציין לאחר השטיפה בשלב זה.
      אופציונאלי: Silanize המאסטר SU-8 על ידי חשיפתו לtrimethylchlorosilane אדים בצלחת פטרי סגורה במשך 10 דקות.
  2. הכנה של העובש ברקוד PDMS
    1. לשלב בסיס אלסטומר סיליקון 40.0 g עם סוכן ריפוי 4.0 גר '. מערבבים את תערובת prepolymer מרץ במשך 10 דקות. דגה במשך 20 דקות תחת ואקום.
      הערה: ככלל, שימוש 10: 1 (בסיס: סוכן ריפוי) יחס המוני.
    2. יוצקים את prepolymer לתוך צלחת פטרי המכילה פרוסות סיליקון עם המאסטר SU-8 של הדפוס ברקוד. הגובה של תערובת PDMS צריך להיות על 7.5 מ"מ ומעלה. דגה התערובת בפטראני צלחת בפעם שנייה כדי להסיר בועות שנותרו, ואז לאפות את התערובת למשך שעה 1 על 75 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר PDMS לרפא.
      הערה: חשוב לשמור על מספיק עובי של לוח PDMS ב ~ 7.5 מ"מ ומעלה, כדי למנוע הוספה יותר מדי מתח לאג"ח PDMS הזכוכית על החדרת סיכות / צינורות דרך חורים בעובש PDMS בצעד (1.3.3.1)
    3. באמצעות אזמל, לחתוך בזהירות מסביב לאזור של לוח PDMS המכיל את תכונות העובש ברקוד ולקלף את הלוח מהרקיק.
    4. חתוך את הקצוות של הלוח כדי להשיג את הצורה הרצויה של העובש ברקוד PDMS. אגרוף 20 חורים (בקוטר 1.0 מ"מ) דרך העובש באמצעות אגרוף ביופסיה עם בוכנה. ודא כי החורים מיושרים עם התכונות מעגליות של הדפוס ברקוד. חורים אלה ישמשו פתחי הכניסה ושקעים.
  3. דפוסים חד-ממדיים של פולי-L ליזין (PLL)
    1. הסר את כל אבק על פני השטח של שקופיות זכוכית מצופה פולי-L ליזין באמצעות אקדח מכת חנקן. ATTACh עובש PDMS לשקופית הזכוכית נקייה. ודא שהקצוות של העובש והשקופיות מיושרים.
    2. אופים במשך 1.5 שעות על 75 מעלות צלזיוס לחזק את הקשר בין עובש PDMS ואת השקופיות מצופות PLL. בינתיים, להכין 20 חתיכות של צינורות פוליאתילן גמישים (3 לחתיכות 4 אינץ ', עם קוטר פנימי של 0.5 מ"מ וקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ).
      הערה: מספר החתיכות של צינורות מתאים למספר פתחי הכניסה בעובש ברקוד PDMS. צינורות משמש לזוג הערוצים בעובש ברקוד PDMS למכל גז חנקן מצויד בוסת לחץ.
    3. בקצה אחד של כל חתיכה של צינורות, לצרף סיכה חלולה נירוסטה (קוטר 1 מ"מ). לשאוב פולי-L ליזין פתרון באמצעות הסיכה, לפחות עד 1 סנטימטר של הצינור מלא בפתרון-מסונן סטרילי.
      1. להדק את הסיכות (מחוברות לצינורות מלא פתרון) לפתחי הכניסה של העובש ברקוד PDMS (איור 1E). חבר את הקצה השני של הצינורות להגדרת טנק מוסדר לחץ חנקן. אפשר הפתרון לזרום דרך העובש באמצעות מגוון לחץ של 0.5-1 psi במשך לפחות 6 שעות.
        הערה: עיין בצעד (1.3.3) לכל נהלי זרימת הדפוסים.
  4. דפוסים חד-ממדיים של 14 ssDNA
    הערה: בופר פוספט (PBS) בשימוש בשלבים הבאים מוכן מ137 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, ו -2 מ"מ KH 2 PO 4. pH של החיץ הוא 7.4.
    1. הכן 2 פתרון מ"מ BIS (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) ב- PBS. הכן 300 מיקרומטר פתרונות של A, B, ו- C ssDNA (5'-אמין שונה, 80 נוקלאוטידים) בPBS או מים ultrapure.
      הערה: השתמש בפתרון BS3 בתוך כ -30 דקות לאחר הכנה, כי אסתר -hydroxysuccinimide N בקלות עוברת הידרוליזה.
    2. שלב 2.5 μl של 300 מיקרומטר, B, או C ssDNA עם 2.5 μl של 2 bis מ"מ (sulfosuccinimsuberate אִידִילִיָה) ב PBS לכל ערוץ. A, B, ו- C DNA מיועד לערוצי 1, 2, ו -3, בהתאמה. הסדר זה ​​חל גם על קבוצות הנותרות של 3 ערוצים (איור 2 א).
    3. צעד לבצע (1.3.3). הפעם, לשאוב את פתרונות BS3 / DNA 5-μl באמצעות סיכות נירוסטה ולתוך צינורות פוליאתילן, אז כמה העובש PDMS למקור החנקן. אפשר פתרון BS3 / DNA לזרום דרך העובש ברקוד לכ -40 דקות או עד שהערוצים מלאים.
    4. עצור את הזרימה פעם כל הערוצים מלאים, אז דגירה פתרון BS3 / DNA ברקוד ב RT עבור שעה 2. אל תאפשר הפתרון להתייבש. אופים את עובש PDMS עם שקופיות ברקוד מצורפים לשעה 1 על 75 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי להקל על יישור בצעדי זרימת דפוסים שלאחר מכן, בשולי תבנית הערוץ בשקופית ברקוד יכולים להיות מתוארים. הדבר נעשה על ידי מגרד בזהירות את משטח הזכוכית באמצעות scrib יהלומיםדואר כדי ליצור סמני יישור בתחתית שקופיות הזכוכית. יישור בשלבים מאוחר יותר של הפרוטוקול ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ.
    5. להסיר את תבנית PDMS מהשקופיות ברקוד. לשטוף את השקופית בעדינות עם 0.01% SDS פעמים פעם אחת ושלוש עם מים ultrapure.
      1. ייבש את השקופית ברקוד באמצעות טווה שקופיות מיקרוסקופ. אחסן את השקופיות ברקוד בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל נקי לשימוש הבא.

2. אימות של התבנית חד-ממדית על השקופיות ברקוד

הערה: פרוטוקול אימות זה גם יכול להיות מותאם לשימוש בהערכת האיכות של צעדי זרימת דפוסים שלאחר מכן.

  1. חסימה של השקופית
    1. הכן 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS. סנן את הפתרון הזה באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לפני השימוש. שימוש בטיפ ג'ל טעינה, תחול 50 μl של 1% פתרון BSA לקצה אחד של השקופית ברקוד.
    2. דגירה solut BSA 1%יון עבור שעה 1 ב RT.
  2. דגירה עם Cyanine 3 (Cy3) -conjugated DNA משלים
    1. הכן קוקטייל של ', ב', וoligonucleotides 'C מצומדת לCy3 בקצה אחד. הרצפים של ', ב', ו-ג 'הם משלימים לאלה של A, B, ו- C, בהתאמה. ריכוז העבודה של Cy3-DNA הוא 0.05 מיקרומטר בBSA 0.1%.
    2. הסר את פתרון BSA מהשקופיות על ידי pipetting, ולאחר מכן להחיל 30 μl של פתרון ה- DNA הקוקטייל באותו הקצה של השקופית. דגירה קוקטייל Cy3-DNA בשקופית ב RT עבור שעה 1. לבצע שלב דגירה זה בחושך כדי להגן על מחצית Cy3 מphotobleaching.
  3. ניתוח של עוצמת הקרינה
    1. פיפטה את קוקטייל Cy3-DNA ולשטוף את השקופית בBSA 1%, PBS, ולבסוף בPBS המדולל (עמ '1אמנות PBS עם מים ultrapure 50 חלקים). ייבש את השקופית באמצעות טווה.
    2. שים לב לקרינה (איור 2) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או סורק microarray. בעת שימוש בסורק microarray, להגדיר את אורך גל פליטת לייזר ל532 ננומטר, גודל פיקסל בשעת 5 מיקרון, צינור מכפיל רווח (PMT) ב450 וכוח ב 15%.

3. ייצור של מערך 2 ממדי DNA (3x3) 14

  1. הכנה של העובש ברקוד PDMS
    1. בצע נוהל (1.1) לבנות המאסטר SU-8 נוסף, אבל הפעם להשתמש מסכת כרום עם תבנית זרימה בניצב לזה של העיצוב הראשון. בצע נוהל (1.2) לבנות עובש PDMS חדש עם הדפוס בניצב.
  2. זרימת דפוסים דו-ממדיים של ssDNA
    1. למערך 3 x 3, להכין 150 מיקרומטר פתרונות מניות של A'-i, B'-II, III-C', A'-IV, B'-V, C'-VI, A'-ז, ב '"ה- DNA -viii, וC'-ט ב 3% BSA / PBS. oligonucleotides אלו משמש כ" רצפי גישור "(איור 2 א). לשלב את פתרונות oligonucleotide (פתרונות 1 עד 3) באופן שריכוז העבודה הוא 50 מיקרומטר לכל oligonucleotide. השתמש במדריך האמור בטבלה 1.
    2. לזרום BSA 3% / פתרון חסימת PBS לכל 20 ערוצים לשעה 1 ב0.5-1 psi.
    3. פתרונות זרימה 1, 2, ו -3 לערוצים 1, 2, ו -3, בהתאמה. עקוב צו זה לסטים הבאים של 3 ערוצים. הזרימה היא בדרך כלל סיימה בכ -40 דקות. דגירה פתרונות DNA ב RT עבור שעה 2 כדי לאפשר את ה- DNA ללהכליא.
    4. לזרום BSA 3% / פתרון חסימת PBS לכל 20 ערוצים לשעה 1 ב0.5-1 psi להסיר DNA unhybridized. קלפתי את לוח PDMS, ולשטוף את שקופית microarray DNA וכתוצאה מכך על ידי טבילת שקופיות הזכוכית לתוך 3 BSA% / PBS אחת וPBS פעמיים, ואחריו PBS המדולל (חלק 1 מים ultrapure PBS ו -50 חלקים). Dר"י השקופית באמצעות טווה שקופיות מיקרוסקופ.
    5. לבצע צעד שני אימות (איור 2 ג) דומה לזה בסעיף 2. oligonucleotides השתמש i 'עד IX "כי הם מצומדת-Cy3. אחסן את שקופיות מערך 3 x 3 בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל לשימוש הבא.
      הערה: microarray DNA יכול להיות מאוחסן ב RT בייבוש במשך חודשים.

4. המרה של מערך ה- DNA 3 x 3 למערך נוגדן

  1. הכנת נוגדן-oligonucleotide conjugates (עסקה)
    1. הכן את הפתרונות של 200 succinimidyl-4-formylbenzoate מ"מ (S-4FB) ו -40 מ"מ succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic) בN נטול מים, -dimethylformamide N (DMF).
    2. הכן עד 7 פתרונות נפרדים של נוגדני לכידה (1 מ"ג / מיליליטר) ב- PBS.
      הערה: אם פתרונות מניות הנוגדן מכילים bacteriostat אזיד הנתרן, לבצע חילופי חיץ עם PBS באמצעות desalting ספין גolumns עם 7 kDa חתוך משקל מולקולרי (MWCO).
    3. הכן 400 מיקרומטר פתרונות נפרדים של i ', השני', ג ', ד', נ ', vi', ו- DNA 'ז. להקצות לכל נוגדן ללכוד רצף oligonucleotide אחד. לשלב 40 μl של 400 מיקרומטר DNA עם 12.25 μl של DMF בצינורות microcentrifuge ספין למטה ולמערבב היטב.
      1. לכל פתרון ה- DNA / DMF, להוסיף 2.3 μl של 200 מ"מ S-4FB בDMF. על כל 100 מיקרוגרם של נוגדן ללכוד, להוסיף 2.25 μl של 40 מ"מ S-HyNic בDMF.
    4. דגירה הנוגדן / פתרונות S-HyNic וDNA / S-4FB במשך 4 שעות ב RT.
    5. כהכנה לתגובת צימוד הנוגדן-DNA, להכין עמודות חדשות desalting הספין (אחד לכל פתרון ה- DNA ואחד לכל נוגדן) על ידי שטיפתם עם חיץ ציטראט ב- pH 6.
    6. לאחר 4 שעות של דגירה, לבצע חילופי חיץ לכל נוגדן / S-HyNic ופתרון ה- DNA / S-4FB. מערבבים את S-4FB מצומדות- i ', השני', ג ', ד', נ ', vi' וoligonucleotides 'vii עם conjugates הנוגדן-S-HyNic. דגירה התערובות לשעה 2 ב RT.
    7. דגירה C ° O תגובה / N ב 4.
  2. טיהור של נוגדן-oligonucleotide conjugates (עסקה)
    הערה: כדי לטהר את conjugates הנוגדן-oligonucleotide, לבצע כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) במערכת FPLC סטנדרטית מצוידות בעמודת GL Superose 6 10/300.
    1. קבע את אורך הגל של גלאי UV של מערכת FPLC 280 ננומטר. השתמש בזרימת isocratic של PBS (pH 7.4) בשעת 0.3 מיליליטר / דקה להפריד conjugates הנוגדן-oligonucleotide מS-4FB-DNA העודף.
    2. בריכת השברים המכילים המצומד ולהתרכז השברים בהיקף של 150 μl באמצעות מסנני ספין עם kDa MWCO 10.
  3. דפוסים דו-ממדיים של נוגדנים
    1. הכן עובש PDMS אחר עם microchambers או מיקרו-בארותינונהלי ing ייצור בשלב (1.2). עובש PDMS עשוי להכיל microliter לבארות nanoliter לimmunoassays.
      הערה: זיהוי סמנים ביולוגיים כללי בדגימות fluidic, עובש PDMS עם בארות מרובות הזדווגו עם שקופית המערך. התכונות של עובש PDMS תלוי בנלמדות במערכת. לדוגמא, זיהוי של חלבונים מניסויי תא בודדים יכול להתבצע עם עובש PDMS המכיל microchambers עם כרכי 0.15-NL.
    2. (אופציונאלי) נושא העובש PDMS לפלזמת ניקוי (18 W) תמורת 1.5 דקות כדי להבהיר הידרופילי פני השטח בדוגמתה. לפני ניקוי פלזמה, להשתמש דבק כדי לחסום את כל משטחים האחרים שיהיה מלוכד ישירות לשקופית המערך 3 x 3.
      הערה: שלב (4.3.2) היא אופציונלית, אך בדרך כלל מבוצעת כאשר עובש PDMS מיועד לשימוש בניסויי תא בודדים.
    3. Mate עובש PDMS עם שקופית מערך 3 x 3, אז לחסום את השקופית עם BSA 1% ב- PBS. דגירה עבור שעה 1 ב RT. Meanwhile, להכין קוקטייל (200 נפח סופי μl) של conjugates נוגדן-oligonucleotide. ריכוז העבודה של כל המצומד הוא 10 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA% 1 / PBS.
    4. הוסף את קוקטייל נוגדנים oligonucleotide, אז דגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C כדי לאפשר מחצית oligonucleotide של conjugates להכליא עם כתמים ספציפיים על 3 x 3 מערכים, ובכך להמיר את מערך ה- DNA למערך נוגדנים.
    5. חזור על שלב (3.2.4) כדי לנקות ולייבש את השקופית. הרגישות הגבוהה ביותר ניתן להשיג אם מערך הנוגדן משמש באופן מיידי. אחסון ממושך עלול לגרום לאובדן של רגישות.
  4. זיהוי של חלבונים
    1. מחדש חלבונים רקומביננטיים או להכין מדגם תא מסונן.
    2. Mate microarray עם שבב אישי מעוצב, ולחסום את פני השטח עם ארגון ה- BSA 3% ב PBS עבור שעה 1. ואז להסיר את פתרון BSA, ולהחיל דגימות דגירה עבור שעה 2.
    3. פעמים לשטוף את הדגימות באמצעות BSA 3% ב PBS שלוש,d ולאחר מכן להוסיף נוגדני זיהוי בריכוז הניתן על ידי גליון הנתונים של המוצר. דגירה עבור שעה 2.
    4. לשטוף את נוגדני זיהוי על ידי ארגון ה- BSA 3% ב- PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin ב 1 מיליליטר מיקרוגרם /, ואחריו דגירה עבור שעה 1.
    5. חזור על שלב (3.2.4) כדי לנקות ולייבש את השקופיות לסריקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העיצובים לתבניות PDMS (איור 1 א-1B) נערך באמצעות תכנית CAD (AutoCAD). שני עיצובים לראות ערוצי תכונה לזרימת דפוסים, אחד אופקי ואחד אנכי. חלקי ימין ועל השמאל של כל עיצוב הם סימטריים; כל אחד מהם יכול להיות פתחי הכניסה או שקעים. כל אחד מערוצים 20 הוא מתפתל מקצה אחד כל הדרך לקצה השני. כל עיצוב מודפס על photomask כרום (איור 1 ג). המאסטר SU-8 המפוברק על רקיק מוצג באיור 1D. כדי להקל על זרימת הדפוסים של PLL...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיצוב תבנית זרימה הוא השלב הקריטי הראשון בבודת microarray 2-D. כדי ליצור שני דפוסי DNA חופפים על מצע זכוכית, תכונות הערוץ של העיצוב הראשון צריכה להיות בניצב לאלה של (1A-B איור) השני. העיצובים בחשבון גם את היישומים במורד הזרם של microarray. במקרה של ניתוח תא בודד, microarray משמש כדי לזהות חלבונים מהתאים בודדים המוקפים בmicrochambers, לכן ממדי הערוץ נעשים בקנה אחד עם microchambers שליישר עם מערכי 2-D. כל עיצוב שניתנו על photomask וטכניקות photolit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לקרן הסטארט-אפ מ-SUNY Albany ולגישה למתקנים במרכז לחקר הסרטן של אוניברסיטת אולבני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בסיס אלסטומר סיליקון Sylgard 184Dow Corning3097366-1004
Sylgard 184 חומר ריפוי אלסטומר סיליקוןDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 PhotoresistMicroChemY111069
פרוסות סיליקון פרוסות אוניברסיטאיות452
שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזיןThermo ScientificC40-5257-M20
אוליגונוקלאוטידיםDNA משולבות*הוזמן בהתאמה אישית מטכנולוגיות DNA משולבות, ראה <חזק>טבלה 2.
תמיסת מלאי דבק פולי-ליזיןNewcomer Supply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) suberate  (BS3)Thermo Scientific21585
1x מי מלח חוצץ פוספט, pH 7.4איכות ביולוגית114-058-101
Ä kta Explorer 100 מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC)GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL עמודהGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
לכידת נוגדניםשוניםשונים*בחירת הנוגדנים תלויה ביישום
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-דימתילפורממידסיגמא-אולדריץ'227056
חומצת לימון,אקרוסנטול מים 42356
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318
Amicon מסנן ספין אולטרה 10 kDa MWCOEMD Milliporeציפוי
Laurell TechnologiesWS-650-MZ
אגרוף ביופסיה עם בוכנה (קוטר 1.0 מ"מ)טד פלה, בע"מ15110-10
סופר יהלומים (סגנון 60)SPI מספק6004
טרימתילכלורוסילןסיגמא אולדריץ'92361
טכנולוגיות ספין UFC201024

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Related Articles