לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה במבחנה

סיכום

הדוח הנוכחי מסכם פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לדגמן את ההשפעה של נישת המיקרו-סביבה של מח העצם על תאים לוקמיים עם דגש על העשרת תת-האוכלוסייה העמידה ביותר לכימותרפיה.

תקציר

הוכח היטב כי המיקרו-סביבה של מח העצם מספקת אתר מקלט ייחודי למחלות המטופויאטיות המתחילות ומתקדמות באתר זה. המודל המוצג בדוח הנוכחי משתמש בתאי סטרומה ראשוניים של מח עצם אנושי ואוסטאובלסטים כשני סוגי תאים מייצגים מנישת מח העצם המשפיעים על פנוטיפ תאי הגידול. תנאי התרבות המשותפת במבחנה המתוארים עבור תאים לוקמיים אנושיים עם רכיבי נישה ראשוניים אלה תומכים ביצירת תת-אוכלוסייה עמידה לכימותרפיה של תאי גידול שניתן לשחזר ביעילות מתרבית לניתוח בטכניקות מגוונות. לוח הזנה קפדני למניעת שטפי תזונה ואחריו התאוששות חלקיקי דקסטרן צולבים (G10) מסוג ג'ל מסוג 10 של אוכלוסיית תאי הגידול שנדדו מתחת לתאי סטרומה של מח העצם (BMSC) או אוסטאובלסטים (OB) המייצרים אוכלוסיית "עמום פאזה" (PD) של תאי גידול, מספק מקור עקבי לתאי לוקמיה עמידים לטיפול מטוהרים. ניתן להעריך אוכלוסייה רלוונטית קלינית זו של תאי גידול בשיטות סטנדרטיות כדי לחקור מסלולים מווסתים אפופטוטיים, מטבוליים ומחזור התא, כמו גם לספק יעד קפדני יותר לבדיקת אסטרטגיות טיפוליות חדשות לפני חקירות פרה-קליניות המכוונות למחלה שיורית מינימלית.

מבוא

המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא לספק גישה יעילה וחסכונית במבחנה התומכת בחקירת המנגנונים העומדים בבסיס מח העצם התומך בהישרדות של תאים לוקמיים במהלך חשיפה לכימותרפיה. מתועד היטב כי תאי גידול ששרדו שנמשכים לאחר הטיפול תורמים להישנות המחלה שלעתים קרובות היא אגרסיבית יותר מזו שבאבחנה ולעתים קרובות מטופלת פחות יעיל^1-8. מודלים הכוללים תאים לוקמיים בבידוד, כגון אלה המוגבלים לתרבית תאים במדיה בלבד, לבדיקת גישות טיפוליות אינם לוקחים בחשבון את האותות הקריטיים הללו, או את ההטרוגניות של המחלה המתרחשת בתגובה לזמינות של רמזים שמקורם בנישה שבהם תת-אוכלוסיות של תאי גידול עם אינטראקציות ספציפיות מאוד עם תאי נישה שואבות הגנה משופרת. מודלים סטנדרטיים של תרבית משותפת דו-ממדית המשלבים תרבית משותפת של תאי סטרומה ותאים לוקמיים שמקורם במח עצם התייחסו במידה מסוימת לתרומה של נישת מח העצם והראו כי אינטראקציה עם תאי מיקרו-סביבה של מח עצם מגבירה את עמידותם לכימותרפיה ומשנה את מאפייני הצמיחה שלהם^9-14. עם זאת, מודלים אלה לרוב אינם מצליחים לשחזר את ההישרדות לטווח ארוך של תאי הגידול ואינם מודיעים במדויק על התוצאות הקשורות לאוכלוסיות התאים הלוקמיים העמידים ביותר התורמים ל-MRD. מודלים in vivo נותרו קריטיים ומגדירים את "תקן הזהב" לחקר טיפולים חדשניים לפני ניסויים קליניים, אך לעתים קרובות הם מאותגרים על ידי הזמן והעלות הנדרשים לבדיקת השערות הקשורות לגידולים עמידים והישנות המחלה. ככזה, פיתוח מודלים דו-ממדיים אינפורמטיביים יותר יועיל למחקרי פיילוט כדי ליידע טוב יותר את התכנון של תכנון פרה-קליני מבוסס עכברים לאחר מכן.

המודל הדו-ממדי במבחנה המוצג בדוח זה חסר את המורכבות של המיקרו-סביבה האמיתית in vivo, אך מספק אמצעי חסכוני וניתן לשחזור לחקירת אינטראקציות גידול עם המיקרו-סביבה המתאימה במיוחד להעשרת תת-האוכלוסייה העמידה לכימותרפיה של תאי גידול. הבחנה זו היא בעלת ערך שכן הערכה של כל אוכלוסיית תאי הגידול עשויה להסוות את הפנוטיפ של קבוצה קטנה של תאי גידול עמידים לטיפול המהווים את המטרה החשובה ביותר. יתרון נוסף הוא יכולת ההרחבה של המודל כך שיתאים לניתוח המעניין. ניתן להקים תרביות בתפזורת עבור אותם ניתוחים הדורשים התאוששות משמעותית של תאי גידול, בעוד שניתן להשתמש בתרביות בקנה מידה קטן בצלחות מרובות בארות לניתוח מבוסס PCR או הערכות מבוססות מיקרוסקופיה.

בהתבסס על צורך זה פיתחנו מודל in vitro כדי לטפל בהטרוגניות של מחלה האופיינית ללוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) של שושלת B. אנו מדגימים כי כל התאים, החולקים מאפיינים רבים במשותף עם עמיתיהם הבריאים, מתמקמים בתאים נפרדים של תרבית משותפת BMSC או OB. נוצרות שלוש אוכלוסיות של תאי גידול בעלי פנוטיפים מובהקים בעלי ערך לחקירת התגובה הטיפולית. באופן ספציפי, אנו מדגימים כי תאים (ALL) ששוחזרו מאוכלוסיית "פאזה עמומה" (PD) של תרבית משותפת עמידים באופן עקבי לטיפול עם הישרדות המתקרבת לתאי גידול שלא נחשפו לחומרים ציטוטוקסיים. תאי ALL אלה, מקווי תאים מבוססים או מדגימות מטופלים ראשוניות, נודדים מתחת לתאי סטרומה דבקים או שכבות אוסטאובלסטים, אך ניתן ללכוד אותם לאחר טריפסיניזציה של תרביות והפרדת סוגי תאים על ידי שימוש בעמודות חלקיקים צולבות מסוג ג'ל 10 (G10)¹⁵.

כאן אנו מציגים מערך של תרבית משותפת דו-ממדית שניתן להשתמש בה כדי לדגמן אינטראקציות בין תאי סטרומה מיקרו-סביבתיים של מח עצם (BMSC/OB) ותאים לוקמיים. חשיבות מיוחדת היא התצפית כי תאים לוקמיים יוצרים שלוש תת-אוכלוסיות מרחביות ביחס לחד-שכבת תאי הסטרומה וכי אוכלוסיית PD מייצגת אוכלוסיית גידולים עמידים לכימותרפיה בשל האינטראקציה שלה עם BMSC או OB. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד לבודד ביעילות את אוכלוסיות התאים הלוקמיים על ידי עמודות G10. יש לציין כי מצאנו כי בידוד של תת-אוכלוסיות אלה מאפשר ניתוח במורד הזרם של אוכלוסיית PD העמידה ביותר כדי לקבוע אופני עמידות פוטנציאליים המוענקים לתאים אלה עקב האינטראקציה שלהם עם תאי סטרומה או אוסטאובלסטים של מח העצם. הטכניקות בהן השתמשנו במורד הזרם של מודל קו-תרבית ובידוד זה כוללות הערכה ציטומטרית של זרימה, ניתוח פרוטאומי והערכת ביטוי חלבון ממוקדת, כמו גם יינון אלקטרו-ספריי אבלציה בלייזר (LAESI) וניתוח סוסון ים להערכת פרופילים מטבוליים. באמצעות שימוש במודל זה בשילוב עם הטכניקות לעיל מצאנו כי לאוכלוסיית התאים הלוקמיים של פרקינסון יש פנוטיפ עמיד לכימותרפיה שהוא ייחודי בהשוואה לתאים לוקמיים שגודלו במדיה בלבד או אלה ששוחזרו מתת-אוכלוסיות אחרות באותה תרבית משותפת. ככזה, מודל זה מתאים להערכה קפדנית יותר לבדיקת אסטרטגיות המכוונות לתאים הלוקמיים העמידים ביותר לכימותרפיה השואבים את הפנוטיפ העמיד שלהם באמצעות אינטראקציה עם מיקרו-סביבת מח העצם.

פרוטוקול

1. הכנה מתקדמת

1. הכנת חלקיקי G10 dextran.
   1. הכן סלארי G10 על ידי הוספת 50 מ"ל 1x PBS על 10 חלקיקים G10 גרם. מערבבים על ידי היפוך ולאפשר G10 להגיע להסדר מחוץ בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° CO / N.
   2. היום של ההפרדה עמודה G10, לשאוב PBS מחלקיקים G10 התיישבו ולהוסיף 50 מ"ל PBS טרי. מערבבים על ידי היפוך. חזור פעמיים, הוספת 50 מ"ל PBS טרי לחלקיקים G10 התיישבו ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
2. Culturing BMSC ו OB.
   1. לשמור הן BMSC או OB ב 37 ° C ב 6% CO _{2 ו} גדל על צלחות בתרבית רקמה 10 ס"מ עד 90% confluency הוא הגיע.
   2. Trypsinize BMSC או תאי OB ולפצל 1: 2 על 10 צלחות סנטימטר חדשות. התאים גדלים סטנדרטים אלה עד הדרושים leukemic שיתוף culturing.

2. לקביעתם ולקיומם Co-תרבות

1. להוסיף 5-20 x 10 ^{6 תאים} leukemic in 10 מ"ל של התקשורת בתרבות גידולים ספציפיים על גבי ומחוברות 80% -90% BMSC או צלחת OB.
   הערה: המעבדה שלנו שומרת שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% O ₂ לשחזר במיקרו-סביבה של מח עצם טובה יותר אשר הוכח נע בין 1% ל -7% ^16-18. עם זאת, שמירה על שיתוף תרבויות על מתח החמצן זו אינה קריטית להקמת שלוש תת-אוכלוסיות leukemic והוא על פי שיקול דעתו של המעבדה.
2. כל יום 4 ^th להסיר את כל אבל 1 מיליליטר של תקשורת (כולל תאי leukemic השעיה) ולהחליפו 9 מיליליטר תקשורת ותרבות leukemic טריה. כשמוציאים 9 מ"ל של התקשורת מהצלחת, להיזהר לא להפריע את השכבה חסיד BMSC או OB.
   1. סר מדיה ידי הטיית הצליחה אל תקשורת הלוואי לשאוב בפינת הצלחת. בנוסף, בעת הוספת תקשורת טריה, הקפד להוסיף טיפה חכמה בפינת הצלחת נגד הדפנות כדי להבטיח הפרעה מזערית של שכבת חסיד BMSC או OB.
3. לאחר 12 יום ^ה של תרבות משותפת, לשטוף תאי leukemic מ BMSC או שכבת OB ידי pipetting תקשורת ותרבות ממרחק של עד מנה ולמטה בעדינות על הצלחת כ 5 עד 10 פעמים ולאחר מכן לאסוף ב 15 מיליליטר צינור חרוטים. Reseed על BMSC ומחוברות 80% -90% חדשות או צלחת OB כמתואר בשלב 2.1.
   הערה: שטיפה עדינה של שיתוף תרבות כמתואר בשלב 2.3 תסיר S ו- PB תאים leukemic מבלי לשבש את monolayer BMSC או OB. זה מאפשר לתאים סרטניים בלבד שיועבר הצלחה שיתוף התרבות הבא. ניתן לחזור מחזור 12 ביום זה פעמים רבות ככל הצורך בהתבסס על צרכי המשתמש.

3. עמודות הכנת חרוז G10

הערה: אם ניתוח במורד זרם סטרילי או culturing נדרש בעקבות פירוד עמודת G10 את השלבים הבאים צריך להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית ועמודות G10 צריכות להיות התקנה במנדף הביולוגי סטרילי.

1. טרום ווהתרבית תאים rm התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים (~ 30 מ"ל לכל טור). באמצעות מזרק חד פעמי 10 מ"ל, להסיר ולסלק הבוכנה. להוסיף צמר זכוכית כדי מזרק.
2. בעזרת פינצטה, לפרק צמר זכוכית לחוטים רופפים דקים. להוסיף מספר שכבות של צמר זכוכית ארוז קלות על המזרק עד 2/3 מזרק מלא צמר זכוכית.
   הערה: צמר הזכוכית היא חיונית כדי למנוע חלקיקי G10 רופפים מ מזהמים את אוסף תאי leukemic. הפוך צמר זכוכית בטוחה הוא ארוז מספיק כדי לתמוך חלקיקי G10, אבל לא צפופה מדי בצפיפות לחסום זרימת מדיה דרך עמודה.
3. צרף ברזלי 1-דרך אל קצה המזרק במצב סגור.
4. טור מזרק קלאמפ לצלצל לעמוד גבוה מספיק כדי צינור חרוטי 50 מ"ל (צינור איסוף) ניתן למקם מתחת ברזלים. מניח צינור איסוף תחת עמודת מזרק.
5. בעזרת פיפטה 10 מ"ל להוסיף, טיפה חכם, חלקיקים G10 resuspended ב PBS לעמודה על גביצמר הזכוכית. ממשיכים להוסיף חלקיקים G10 עד גלולה מ"ל ~ 2 (כפי שנמדד על ידי סיום לימודים על המזרק) של צורות חלקיקים G10 על גבי צמר זכוכית.
6. לאזן את עמודת G10 עם תקשורת מחוממת מראש.
   1. הוסף 2 מ"ל של התקשורת מחומם מראש לעמודה. שסתומים ברזלים להרחיב לאט כך בתקשורת זורמת מתוך הטור נפתח חכם.
   2. חזור על שלב 3.6.1 עד סך של 10 מ"ל של התקשורת מחומם מראש כבר חצה את הטור.
      הערה: אם חלקיקי G10 נראה את הזרימה דרך בצינור האוסף, או 1) להוסיף עוד חלקיקי G10 לשמור ~ 2 גלולת מיליליטר מוודא שאף חלקיקי G10 נוספים לברוח מהעמודה או 2) להחליף עמודה עם אחד בשימוש וחזרו צעדים 3.4-3.6.1.
   3. לאחר מנקז התקשורת מחומם מראש מהעמודה, לסגור את שסתום וזורקים צינור איסוף עם הזרימה דרך. להוסיף צינור אוסף חדש תחת העמודה. הטור הוא מוכן להיות טעון עם תערובת תאי מדיה +.
      הערה: עמודותיש להשתמש מיד ולא להתייבש.

4. הפרדה 3 תת-אוכלוסיות בתוך משותף תרבות

1. אוסף של השעיה (S) תת-אוכלוסיית גידול.
   1. לשאוב התקשורת מהצלחת שיתוף תרבות עם פיפטה בעדינות מחדש להחיל את אותה התקשורת לשטוף את הצלחת לאסוף מדיה המכילה תאים leukemic צינור חרוטי 15 מ"ל. תאי leukemic שנאספו הם תת-אוכלוסיית S.
2. אוסף של השלב ברייט-אוכלוסיית גידול (PB).
   1. הוסף 10 מ"ל התקשורת טרי חזרה לצלחת שיתוף תרבות. לשטוף נמרצות על ידי pipetting תקשורת הוסיפה למעלה ולמטה כ 5 פעמים כדי להסיר תאי leukemic חסידים אבל לא מספיק חזק כדי לסלק רכיב חסיד BMSC / OB.
   2. לשאוב עם פיפטה ולאסוף התקשורת צינור חרוטי 15 מ"ל. התאים שנאספו הם תת-אוכלוסיית PB.
3. אוסף של שלב דים (PD) תת-אוכלוסיית גידול.
   1. צלחת לשטוף עם 1 מ"ל PBS כדי remתקשורת נותרת אובה. Trypsinize צלחת שיתוף תרבות עם 3 מ"ל טריפסין ומקום לתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות.
   2. הסר את צלחת מתוך החממה לטפוח בעדינות צידי הצלחת לנשל BMSC / OB חסיד.
   3. הוסף 1 מ"ל בסרום שור העובר (FBS) ו פיפטה מעלה ומטה 3-5 פעמים להתפרק אגרגטים תא גדול.
   4. אסוף התקשורת עם תאים צינור חרוטי 15 מ"ל. תאים אלה הם תת-אוכלוסייה PD unpurified עם BMSC / OB גם כן.
4. צנטריפוגה 3 מבודדת תת-אוכלוסיות ב 400 XG במשך 7 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant אז בנפרד resuspend כדורים ב 1 מיליליטר תקשורת מחוממת מראש. תאים מוכנים להיות הועמס על עמודת G10.

5. טוען משותף התרבות תאים על גבי טור G10

הערה: הפוך ברזלים בטוחים סגורה לחלוטין לפני הוספת תאים המכילים תקשורת לעמודת G10. כמו כן, כל תת-אוכלוסייה חייבת להיות דרסה טור G10 נפרד כך שלא introducדואר הטיות בין אוכלוסיות בניתוח במורד הזרם.

1. בעזרת פיפטה 1,000 μl, להוסיף 1 מ"ל של כל תת-אוכלוסייה תא התקשורת מחומם מראש ל טור G10 נפרד טיפה חכם. ודא שהמדיה המכיל את התאים נשאר על גבי או בתוך גלולה G10. אפשר תאים כדי לדגור על גלולת G10 במשך 20 דקות ב RT.
   הערה: ברזלים נותר סגור משך הדגירה.

6. איסוף תאי leukemic מעמודת G10

1. להוסיף 1-3 מ"ל מראש לחמם התקשורת כל עמודה G10. שסתום ברזלים להרחיב ולאפשר תקשורת כדי לצאת לאט בעמודת טיפה חכמה.
   הערה: זה חיוני כדי לשמור על קצב זרימה איטית מהעמודה או גלולת G10 המכילה BMSC / OB יכול לשטוף את הטור ולזהם את תאי leukemic המבודדים.
2. המשך להוסיף מדיה מחוממת מראש במרווחים קטנים (1-2 מיליליטר) לעמודת G10 עד סך של 15 עד 20 מיליליטר יש להפעיל באמצעות עמודה נאסף. va שסתום הקרובצינור איסוף lve וכובע.
   הערה: אם גלולת חלקיקי G10 נתפסת בתחתית צינור איסוף, להסיר בעדינות תקשורת מהצינור עוזב G10 חלקיקים הגלולים באין מפריע ולהעביר צינור חדש.
3. צנטריפוגה שנאספו מדיה ב 400 XG במשך 7 דקות ב RT. הסר supernatant ו resuspend תא גלול במאגר מתאים לשימוש עבור במורד זרם.
4. תאים הם עכשיו אוכלוסייה טהורה של תאים leukemic ללא BMSC או זיהום OB והם מוכנים להיות מיושם על יישומים במורד הזרם לפי שיקול למשתמש.
   הערה: כדאיויות תא leukemic צריכות להישאר ללא שינוי כאשר עוברים תאים דרך עמודות G10.

תוצאות

ההתקנה ותרבות מוצלח של מודל שיתוף תרבות זו תגרום להקמת 3 תת-אוכלוסיות של תאים leukemic ביחס בשכבה BMSC או OB חסיד. איור 1 מראה כיצד כל התאים זורעים לתוך בשכבה BMSC בתחילה מופיעים רק מאוכלוסיה אחת של מושעה תאי leukemic. במהלך 4 ימים תאים leukemic אינטראקציה עם BMSC להיווצר 3 תת-אוכלוסיות המרחבי של תאים leukemic (מושעה (S), שלב בהיר (PB), ואפלולי שלב (PD)). בעוד ש -3 תת-האוכלוסיות של תאים סרטניים ניתן לראות בדרך כלל לאחר 24 שעות של ת...

דיון

מחלה שארית מינימלית (MRD) התורמת הישנות של המחלה ממשיכה להיות אתגר קליני מהותי בטיפול עקשן אגרסיבי ALL, כמו גם, שורה של ממאירויות המטולוגיות אחרות. במיקרו-סביבה של מח העצם הוא האתר הנפוץ ביותר של ההתקפים ALL ^3,8. ככזה, מודלים שהמודל במיקרו-סביבה של מח העצם הם כלים חיוניים כדי לבחון את ההשערות הקשורות להישרדות ותחזוקה תאים סרטניים leukemic של MRD במהלך החשיפה כימותרפיה. בעוד מודלי עכבר להגדיר את תקן הזהב עבור שאלות בדיקות הקשורות יעילה תרופה, שיתוף תרבות 2D ממשיך להיות מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חרוזי ספדקס G10	סיגמא	G10120	המכונה בכתב היד סוג ג'ל 10 חלקיקי דקסטרן צולבים
10 מ"ל מזרק סטרילי	BD	309604
צמר זכוכית	פיירקס	3950
פקקים חד כיווניים	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	41021039 מוצרים רפואיים ברחבי העולם		משמשים כצינורות איסוף
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	41021037	רפואיים ברחבי העולם	משמש לאיסוף תאים
סרום בקר עוברי	Sigma	F6178
0.05% טריפסין	מדיה-טק בע"מ	25-053-CI
100 x 20 מ"מ צלחות תרבית תאים	Greiner Bio-One	664160
<חזק>מדיית תרבית חזקה
אוסטאובלסט מדיה	PromoCell	C-27001	לאוסטיאובלסטים אנושיים
RPMI 1640 מדיה	מדיה-טק, בע"מ	15-040	להכנת מדיה גידולית
<קווי תאים חזקים>
<תאים חזקים>תאים נצמדים:
אוסטאובלסטים אנושיים	PromoCell	C-12720	אוסטאובלסטים אנושיים תורבבו על פי הספק' המלצות.
תאי סטרומה של מחר עצם אנושיים	WVU Biospecimen Core		לוקמיה אנושית ראשונית ותאי סטרומה של מח עצם (BMSC) לא מזוהים סופקו על ידי מרכז הסרטן מרי באב רנדולף (MBRCC) Biospecimen Processing Core ובנק הרקמות של המחלקה לפתולוגיה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה. תרביות BMSC הוקמו כפי שתואר קודם לכן (*)
<תאים חזקים>לוקמיים:
תאי REH		ATCC ATCC-CRL-8286	REH תורבבו על פי הספק' המלצות ומדיה מומלצת.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 תורבתו על פי הספק המלצות ומדיה מומלצת.
(*) גיבסון LF, פורטני ג'יי, לנדרת' KS, פיקטל די, אריקסון SG, לינץ' ג'יי.פי. הפרעה בתפקוד תאי הסטרומה של מח העצם על ידי אטופוסיד. השתלת מח דם ביול השתלת מח דם J am Soc. אוגוסט 1997; 3(3):122–32.