הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53647

⸱

14 בינואר 2016

1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה חדשה של BrdU-ChIP-Slot-Western לבחינת חלבונים ושינויים בהיסטונים הקשורים ל-DNA חדש או מתהווה.

תקציר

deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ"א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה.

פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.

מבוא

תיקון דנ"א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ"א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ"א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ"א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות.

במהלך שכפול הדנ"א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ"א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ"א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ"א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים.

כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה ​​הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ"א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת ​​שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הבאים תיוג BrdU

  1. תאי NIH3T3 תרבות בנוכחות או DMSO או מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי כפי שתואר לעיל 6.
  2. בעקבות טיפול במעכבים סלקטיביים DMSO או HDAC1,2, להוסיף BrdU לתאים בתרבית רקמת מכסה המנוע סטרילי. דגירה 2 x 10 6 NIH3T3 תאים מצופים ב 10 מיליליטר תקשורת NIH3T3 עם 20 מיקרומטר ריכוז סופי של bromodeoxyuridine (BrdU) במשך 60 דקות בתרבית רקמת חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס.
  3. חלבוני Crosslink תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות לתקשורת והתרבות בריכוז סופי של 1%. דגירה 2 x 10 6 תאי NIH3T3 עם פורמלדהיד ב RT במשך 10 דקות על שייקר.
  4. להרוות את הקישור הצולב על ידי התוספת של גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ. לדגור על RT במשך 5 דקות על שייקר.
  5. הסר את המדיה ולאסוף תאים בPBS בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. cel ספיןLS 956 בXG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS קר כקרח. הסר PBS מהצינור. אחסן את התא גלולה צולבים ללא PBS (supernatant) ב -80 ° C עד שימוש.
  6. הכן את lysate מהתא גלולה crosslinked על ידי הוספת חיץ FA140 500 μl (50 מ"מ של HEPES KOH 7.5 pH, 140 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז.
  7. הגזירה הכרומטין ידי sonicating דוגמאות חמש פעמים ב -35% כוח ועם דופק 15 שניות, 0.9 שניות ובהגדרה 0.1 שניות מ. שמור את הצינורות על קרח לאחר כל סיבוב של sonication כדי למנוע חימום של הדגימות.
    1. בדוק את הגז על ג'ל DNA כיעילות הגז תנוע בין sonicators שונה. כדי לבדוק sonication, הפוך crosslink ידי הוספת NaCl בריכוז של 0.16 M ולבצע צעדים 1.17.1. - 1.22. הפעלת eluted 10 DNA μl על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק אם הגז הואבין 300-700 נקודות בסיס בעוצמה ממוצעת על 500 נקודות בסיס.
  8. בעקבות sonication, דגימות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 17949 XG ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש.
    1. לבצע הערכת חלבון באמצעות ערכת assay החלבון המסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש בכמות שווה של lysate לשבב של שליטה ודגימות ניסוי. בדרך כלל, להשתמש 1 מ"ג של lysate הכולל לכל תגובת שבב.
  9. הכן תרחיף 50% מ- agarose חלבון באמצעות חיץ FA140 המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל. להוסיף 1/10 נפח של מעכבי פרוטאז הקוקטייל. חשב את הנפח של חרוזים צורך מבוסס על מספר הדגימות בסך הכל.
    1. חרוזים-agarose חלבון לשטוף עם חיץ FA140 פעמיים כדי להסיר את חיץ האחסון ולהוסיף נפח שווה לחיץ FA140 לחרוזים לעשות slurry 50%.
    2. כדי להסיר חלבונים שאינם במיוחד לאגד את חרוזים, להוסיף 50 μl של תרחיף 50% מ- agarose חלבון ובcubate הדגימות ב 4 ° C עם רוטציה הסוף-על-קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה למשך 30 דקות.
  10. ספין הדגימות ב956 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך דקה. לאסוף את supernatant ולבצע immunoprecipitation על ידי הוספה או נוגדן H4K16ac 8 μl או 5 μl (5 מיקרוגרם) של 1 מ"ג / מיליליטר נוגדן SMARCA5 לsupernatant. דגירה על 4 מעלות CO / N עם סיבוב קצה על קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה.
  11. חוסכים 1/10 בתמצית לשליטה 'קלט' ולהגדיר אותו כצד ב -20 ° C. הקלט צריך להיות הפוך צולבים יחד עם דגימות ה- IP.
  12. השתמש בכמות שווה של IgG ארנב (5 μl של 1 מ"ג / מיליליטר) כמדגם immunoprecipitation ביקורת השלילי.
  13. למחרת, להוסיף 50 μl של 50% תרחיף-agarose חלבון לתמצית דגירה עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה.
  14. גלולה חרוזים agarose ידי צנטריפוגה ב956 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant וwa זהירותsh חרוזים עם המאגרים ברצף הבאים. בהכנות חיץ, להוסיף מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש.
    1. לשטוף עם מלח נמוך מורכבת הצפת לשטוף חיסונית (FA140; ריכוז סופי של 50 מ"מ של HEPES KOH pH 7.5, 140 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה.
    2. לשטוף עם מלח גבוה קומפלקס הצפת לשטוף חיסונית (FA500; ריכוז סופי של 50 מ"מ של HEPES KOH pH 7.5, 500 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה.
    3. לשטוף עם LiCl מורכב הצפת לשטוף חיסונית (ריכוז סופי של 10 מ"מ של טריס-Cl pH 8.0, 250 מ"מ של LiCl, 0.5% ו -0.5% NP40 deoxycholate נתרן) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה הסוף-על-קצה.
  15. בעקבות שטיפות כפי שתואר לעיל, להוסיף 200 פתרון elution μl (ריכוז סופי של SDS 1% ויקרבונט 100 מ"מ נתרן) וincubatדואר ב RT במשך 15 דקות עם סיבוב קצה על קצה על RT.
  16. ספין הדגימות ב956 XG ב RT ולהעביר את eluate לצינור 1.5 מיליליטר חדש. חזור על שלב 1.15 עם פתרון elution 200 μl נוסף.
  17. 400 μl של eluate, להוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M ומערבבים היטב.
    1. בנוסף, להוסיף פתרון elution 400 μl 10 קלט μl שלהפריש (שלב 1.11) ולהוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M להפוך דגימות קלט crosslink גם כן. הפוך crosslink הדגימות ידי דוגרים באמבט המים C ° 65 במשך 5 שעות.
  18. הוסף 1 מיליליטר של 100% EtOH לeluate ההפוך-crosslinked. מערבבים היטב דגירה ב -80 ° C 2 - 3 שעות או ב -20 CO ° / N. ספין הדגימות ב17949 XG במשך 15 דקות וזורקי אתנול.
  19. להוסיף 800 אתנול 70% μl ללשטוף את הכדור. ספין ב17949 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקי אתנול. ספין בקצרה כדי להסיר כל אתנול שיורית. האוויר יבש הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר אתנול שייר.
  20. ממיסים DNA ב -90 RNase μl ומים חופשיים DNase ולהוסיף 2 μl 10 מ"ג / מיליליטר RNase ב0.2 מ"ג / מיליליטר ריכוז סופי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות.
  21. הוסף 10 μl 10x proteinase K הצפת (100 מ"מ טריס pH-Cl 8.0, 50 מ"מ EDTA pH 8.0, 5% SDS). מערבבים היטב ומוסיף μl 1 proteinase ק לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  22. לטהר DNA קלט והשבב באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR על פי הפרוטוקול של היצרן וelute DNA במי 50 μl. DNA החנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.

2. חריץ ניתוח כתם של השבב ה- DNA

  1. מדוד את התשואה של קלט ושבב ה- DNA eluted במי 50 μl כמתואר בשלב 1.22 באמצעות ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר פי הפרוטוקול של היצרן.
  2. קח כמויות שווה (50 μl) של קלט או DNA immunoprecipitated שנמצאים בטווח ליניארי של זיהוי.
    1. לדוגמא, אם קלטתשואת DNA היא 1.5 ng / μl, ואז לקחת 30 μl (או 45 ng DNA סך הכל) ולהפוך את נפח 50 μl עם מים. לשבב גורם, לקחת את כל eluate 50 μl משלב 2.1 והמשיכו לשלב 2.3.
  3. לפגל 50 קלט μl או DNA immunoprecipitated ידי הוספת 2.5 כרכים של 0.4 N NaOH, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות לXG 956 במשך 10 שניות, ולדגור על RT למשך 30 דקות.
  4. לנטרל את ה- DNA מפוגל ידי הוספת 175 μl של 1 M טריס- HCl, pH 6.8, מערבולת, צנטריפוגות במשך 956 XG במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח.
  5. הכן דילול סדרתי של קלט וDNA immunoprecipitated עבור assay כתם חריץ כמפורט להלן.
    1. בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8).
      הערה: הדוגמא האמורה לעיל, 45 ng של DNA הקלט יהיה בסופו .129 ng / μl.
    2. לDNA קלט, תווית שלושה צינורשל 100, 50 ו -25 ולהוסיף 100 μl, 50 μl ו -25 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך את הנפח הסופי 100 μl עם מים nuclease חינם. לשבב ה- DNA, תווית שלושה צינורות 200, 100 ו -50 ולהוסיף 200 μl, 100 μl ו -50 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך נפח סופי 200 μl עם מים nuclease חינם.
  6. חותך את הקרום לגודל של מנגנון כתם חריץ. טרום להרטיב את הקרום וניירות סופג ב20x SSC לפני ולפני הוספת ה- DNA. להרכיב אותם למנגנון כתם חריץ על פי הפרוטוקול של היצרן.
  7. DNA Pipet מצעד 2.5.2 לחריצים מתאימים. החל ואקום לאט למשוך את ה- DNA על הממברנה זטה-בדיקה. תפסיק ואקום לאחר כל הדגימות שעברו במנגנון.
    1. לפרק את המנגנון ולשתק באופן מיידי את ה- DNA על הממברנה באמצעות crosslinker UV. יש צד DNA בcrosslinker UV ולהשתמש autocrosslink ההגדרה בcrosslinker. עקוב הפרוטוקול של היצרן.
  8. זיהוי BrdU על כתם החריץ על ידי ביצוע מערבי סופג.
    1. חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש ללא שומן PBS המכילים 0.1% Tween-20 (PBST) במשך שעה 1 ב RT כדי למנוע שאינו ספציפי המחייב של נוגדנים לממברנה.
    2. להוסיף נוגדן ראשוני נגד BrdU (1: 500 דילול) בדילול מלא בחלב 1% יבשים ללא שומן בPBST דגירה הכתם עם הנוגדן הראשוני עבור 3 שעות ב RT על שייקר. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה הנוגדן הראשונית.
    3. הוסף נוגדן המשני אנטי עכבר HRP-מצומדות לכתם (1: דילול 5000) ולדגור על RT עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה נוגדנים משני.
      הערה: השתמש בנפח מספיק של הנוגדנים כדי לכסות את הקרום במהלך incubations נוגדן הראשוני והמשני לחלוטין.
  9. מכין את תערובת ECL ולהוסיף אותו לAC הכתםcording לפרוטוקול של היצרן. דגירה הממברנה עם תערובת ECL במשך 5 דקות על RT.
    1. מניחים את הקרום בקלטת רנטגן, לחשוף את הקרום לסרט X-ray ולפתח את הכתם באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
    2. לכמת את האות המתקבל עבור קלט וDNA ChIPed לאחר סריקת הכתמים באמצעות תוכנת J תמונה על פי הפרוטוקול של היצרן. לכימות, להשתמש באות שנמצאת בטווח ליניארי של זיהוי על מנת להבטיח דיוק של מדידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לקבוע את הספציפיות של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי, תאי fibrosarcoma Hdac1,2 פלורידה / פלורידה וHdac3 פלורידה / פלורידה היו בשימוש. recombinase Cre (Ad-Cre) המכיל אדנווירוס שימש למחוק Hdac1,2 וHdac3 בתאים אלה. זיהום Ad-Cre הבא של Hdac1,2 פלורידה / פלורידה תאים, עלייה חזקה בH4K5ac נצפו. טיפול בתאי נוקאאוט Hdac1,2 עם 233 או 898 לא לגרום לעלייה נו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולוגית iPOND האלגנטית 13. בטכנולוגית iPOND, DNA מסונתז חדש שכותרתו עם deoxyuridine אתיל (edu). המצומד ביוטין הוא הוסיף לאחר מכן על edu באמצעות הכימיה לחץ. ה- DNA המתהווה מתויג ביוטין אז immunoprecip...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לי אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג'ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד"ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-BrdU (מערבונים)BD BiosciencesB555627
אנטי-SMARCA5Abcamab3749
אנטי-H4K16acמוטיב פעיל39167
Zeta-Probe GT ממברנהBio-Rad162-0197
פורמלדהידפישרBP531-500
חלבון A אגרוזMillipore16-156
Rnase AQiagen19101
Proteinase KSigmaP4850
PCR ערכת טיהורQiagen28106
GlycineSigmaG7403
קוקטייל מעכב פרוטאזRoche11836170001
BrdUSigmaB9285
Rabbit IgG& נ.ב.פ;Millipore12-370
HEPESSigmaH3375
NaClSigmaS-3014
Triton-X-100Sigma93443
NP40USB Corporation19628
נתרן דאוקסיכולאטסיגמאD6750
נתרן ביקרבונטסיגמאS-4019
אתנולדקון מעבדות04-355-222
מים מטופלים DEPCסיגמא95284
טריספישרBP-152-5
EDTAInvitrogen15575-020
SDSאמביוןAM9820
נתרן הידרוקסידמלינקרודט GenAR MAL7772-06
20x SSCLife Technologies15557-036
מעבדת חלב יבש ללא שומןScientific IncM0841
ECLThermo Fisher80196
סרט רנטגןGenesee Sci30-101
מפתחKonica MinoltaSRX-101A
UV CrosslinkerStratageneXLE-1000
סוניקטורברנסון סוניפייר  משבש תאים אולטרסאונד דיגיטלידגם: 450
צנטריפוגהאפנדורףדגם: אמבט מים 5810R
פישר סיינטיפיק איזוטמפדגם: 2322
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטרThermoScientificדגם: 1000
Slot Blot Trainer Schleicher and Schuell Minifold II44-27570
חממת תרבית רקמותThermo ScientificSeries II 3110 חממות
CO2 עם מעטפת מים

מקורות

  1. Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
  2. Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
  3. Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
  4. Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
  5. Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
  6. Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).
  7. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  8. Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
  9. Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
  10. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
  11. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
  12. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח DNA נבטןשיקוע חיסוני של כרומטיןטכניקת Slot Blotניתוח Western Blotסימני אצטילציה של היסטוניםמשחזר כרומטיןרפליקציית DNAקישור חלבון-DNA
בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.