ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

Abstract

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו ').

Introduction

עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים - אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט - ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) ^1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם יכולות חתך-z ו- (4) לבצע פילוח הגרעין של תמונות confocal ומנתח תמונה כמותית שלאחר מכן. צינור זה מאפשר tהוא משוחד מדידת רמות החלבון בגין המחאת זהויות תא לאפיין תת-אוכלוסיות של תאים באתרו. פרוטוקול זה יכול להתבצע בתוך זמן קצר של 3 - 4 ימים עבור המלטה אחת (בדרך כלל עד 10 עוברי עכברים), מאוסף העובר בניתוח הנתונים (איור 1B). הניתוח סימולטני של המלטות כמה יגדיל את ניתוח ההדמיה ונתונים נטלו הזמן, ובכך להאריך את אורכו הכולל של פרוטוקול.

עובר העכבר הבמה preimplantation הוא מערכת צייתנית באופן ניסיוני אשר, בהינתן גודלו הקטן וסטריאוטיפית מורפולוגיה ^3, הוא גם מתאים בתחום הדמית טוטו של תהליכים תאיים עם רזולוצית תא בודד. כדי לבצע ניתוח משוחד, מערכות ברמה של מספר סטטיסטית הרלוונטי של עוברים, אוטומטית, צינור ניתוח כמוני רצוי. עם זאת, בשל צפיפות גרעיני גבוה של מסת התאים הפנימית (ICM) של הבלסטוציסט ( האיור 1A, 2D), פלטפורמות פילוח תמונה מקובלת אינו מספק מספיק דיוק להקים זרימת עבודה אוטומטי או חצי אוטומטי. מצד שני, פילוח ידני, בעוד מדויק, אינו מאפשר העיבוד של קבוצות גדולות של תאי עוברים, וגם לא מתאים להגדרה לשחזור, משוחדת של זהויות תא - שהוא קריטי במיוחד כאשר לומד שלבי התפתחות, שהדפוסים של סמן ביטוי לא נפתר במלואה (למשל, אינה מציג חלוקה בינארית פני אוכלוסייה). פתחנו לאחרונה ומאומתים שיטת פילוח תמונה מותאמת בעוברי העכבר preimplantation ועבור תאי גזע עובריים בעכבר (ESCs) המשיג דיוק גבוה, תוך דורשי השקעת משתמש מינימאלי ^4-8.

צינור הניתוח שמובא כאן סובב סביב כלי הפילוח המבוסס תמונת MATLAB הפילוח הגרעיני האינטרקטיווי מודולרי (דקות) ^4. MINS performs פילוח גרעיני ללא פיקוח על קבוצות גדולות של ערימות-Z confocal לאחר שמשתמש קימת מספר מינימאלי של מאפייני תמונה, באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) (טבלה 1) ^4. צינור זה הוכיח עצמו יעיל עבור דור של נתוני העברת נתונים גבוהים על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא סוג שני בר, מטופלים בניסוי וגנטי עוברת משונה ESCs ^5-7. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את היישום של דקות עד פילוח תמונות העובר preimplantation הבמה. לדוגמאות של ביצועים MINS על ESCs עיין ^4,7. הצעד פילוח גרעיני אוטומטי מפחית באופן משמעותי את נטל הזמן של תהליך זיהוי התא, ואילו מדידות עוצמת מרחבית הקרינה לאפשר קביעה משוחדת של זהויות התא לבין הדור של מפות תלת-ממדיות של תחומים ביטוי גנים בעמדה תא בעובר (איור 1C ). יתר על כן, את יכולת ההרחבה של זרימת העבודה זו עושה את זה החלות על הניתוח של המלטות פרט באמצעות קבוצות גדולות של עוברי מטופלים באופן ניסיוני, או עוברי של רקע גנטי שונה ^5,6. MINS זמין באופן חופשי http://katlab-tools.org (התוכנה דורשת רישיון MATLAB).

אין גישה שפותחה עד היום מאפשר הדור של נתונים מעמיקים כזה על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא עוברי preimplantation העכבר. כל הניסיונות עד כה ב לכימות סוגים אלה של נתונים הוגבלו על נחישות quantitation ידני של מספרים סלולריים עבור אוכלוסיות שונות בעובר (או לגמרי באופן ידני, או תוכנה בסיוע) ^9-19. הגישה זו (שילוב תוכנה דקה) כבר מותאמת ונבדקה על עוברי preimplantation עכבר ESCs; זאת ביצועיו על מערכות אחרות עם צפיפות גבוהה גרעינית, למרות עדיין נבדק, צפויים להיות שווה ערך.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל העבודה מן החי, כולל בעלים, רבייה וקרבה אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של מרכז סרטן קטרינג סלואן זיכרון ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 03-12-017.

אוסף עובר 1.

הערה: כל עבודת החיה חייבת אושרה על ידי הרשויות מוסדיות המקומיות להתאים חוקים מקומיים ומוסדיים.

1. Mate עכברת בתולה עם זכר הרבעה פורה של גנוטיפים הרצוי.
   הערה: אם הגדרת הזדווגויות טבעיות, בחירה והנשים בשלב הייחום של מחזור estral מגדיל את הסיכוי של הזדווגות במועד הרצוי. אם גרימת superovulation, עיין בפרוטוקולים המתוארים ^20.
2. בדקו את הנוכחות של תוסף נרתיק בבוקר באמצעות בדיקה בוטה. באופן אידיאלי, לעשות את זה לפני הצהריים (12:00 בצהריים), כמו אטמי הזדווגות אובדים לאורך כל היום. שקול noon של זיהוי של היום עוברי תוסף הנרתיק (E) 0.5.
3. ביום הרצוי והשעה של ההתפתחות העוברית, להתחמם M2 או בינוני מחזיק שטיפה (FHM) כדי RT או, עדיף, 37 ºC. הערה: או M2 או FHM יכול לשמש שטיפה עוברת טיפול. כאשר אינו בשימוש, אחסן מדיה אלה ב 4 ºC. להעריך את השימוש ~ 2 מ"ל של מדיום לכל הרחם.
4. paraformaldehyde הקפוא 4% ההפשרה (PFA) ב בופר פוספט (PBS) או להכין איזה פתרון טרי. מעריכים 500 μl של פתרון PFA 4% לכל גם צלחת 4-היטב. תקן המלטה אחד על אחד גם צלחת 4-היטב. הערה: לחילופין, צלחת 96-גם יכול לשמש כדי לתקן עוברים חנות. אם באמצעות צלחת 96-היטב, השתמש 100 μl של פתרון PFA לכל טוב.
5. משוך פיפטה כוס פסטר באמצעות להבה פתוחה לצייר סוף נימים בקצה.
6. קורבן נקבה ידי נקע בצוואר רחם או שאיפת _{CO 2,} או כנדרש על פי תקנות מקומיות ומוסדיות. זה בדרך כלל desirablדואר כדי לאשר המתת חסד של בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
7. תרסיס הבטן של חיה עם 70% אתנול למזער שפיכת שיער לבצע חתך בבטן, ראשון דרך עור ובהמשך דרך קיר הגוף (הצפק) לחשוף את הקרביים.
   הערה: השלבים הבאים מתארים את הליך לאסוף blastocysts מן הרחם של עכברה בהריון בכל שלב בין E3.25 ו E4.5 (איור 1 א). עבור פרוטוקולים על אוסף של עוברי preimplantation מוקדם יותר E3.25, מתייחסים ^ל -20.
8. אתר את הרחם ולהסיר מן החיה. אוחזים בקצה צוואר הרחם של הרחם עם זוג מלקחיים, לחתוך דרך צוואר הרחם ולמשוך בעדינות למתוח הן קרני הרחם.
9. Trim שומן מן הרחם, נזהר שלא לנקב את דופן הרחם. ניתן לעשות זאת בקלות בבית בעת ההרחקה, תוך שהיא עדיין מחוברת לגוף של בעלי החיים, כמו הרחם יכול להיות שרוע. לחילופין,ניתן לעשות זאת מאוחר יותר, תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ב RT PBS. עבור פרוטוקול מפורט יותר על דיסקציה של רחם, ראה פרוטוקולים 5 & 8 ²⁰
10. חותכים מעל oviducts, מתחת השחלות, כדי לשחרר את הרחם, המקום כולו על צלחת פטרי ולכסות עם PBS.
    הערה: צעד זה גם מאפשר רחיצת דם עודף או ופסולת אחרת מן הרחם, אשר הופך לפשוט קציר הבלסטוציסט שלאחר מכן.
11. נפרד הוא רחם קרני על ידי חיתוך דרך הקצה הפרוקסימלי, משני צדדים של צוואר הרחם וזורק את צוואר הרחם. הפרד בין oviduct מן הרחם על ידי חיתוך מתחת מצר שמחבר אותם (איור 1 א). העבר הן קרנות כדי ירידה של מדיום מניפולציה (או M2 או FHM) לאיסוף מניפולציה עוברים.
12. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, blastocysts סומק מתוך הרחם לתוך המדיום ידי אילוץ 0.5 - 1 מ"ל של M2 או FHM דרך כל קרן הרחם מפתיחת צוואר הרחם. השתמש 1מזרק מ"ל עם מחט hypodermal. הערה: מחט ניתן קהה באמצעות אבן הגשה כדי למנוע קריעה של uteri, אם כי זה לא קריטי. שרטוט מפורט עבור שטיפת רחם ניתן למצוא ^21.
13. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, לאתר את blastocysts, אשר יהיו פזורים ברחבי ירידה של המדיום. אפשר עד 1 - 2 דקות עבור blastocysts לשקוע בתחתית המנה לאחר שטיפה. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, שבשליטת הפה עם סוף נימים, לאסוף את כל blastocysts ולהעביר לירידה טריה של תקשורת.
14. לשטוף blastocysts ידי העביר דרך 2 - 3 טיפות של M2 הטרי או FHM. הזז עוברים בקבוצות של 5 - 10 blastocysts בכל פעם.
    הערה: העברת קבוצות גדולות בכל זמן נתון יהיה לזרז את התהליך, אבל זה יהיה גם להגדיל את הסיכוי לאבד עוברים רבים בטעות. אם לא מאומן בשימוש טפטפות שבשליטת פה, תרגול מניפולציה העובר והעברה צריך להיחשב לפני beginning הניסוי.
15. הסר את המעטפת השקופה (ZP) מ blastocysts שלא נולדה (בדרך כלל
16. תשמור על עצמך בעת טיפול blastocysts הערום, כפי שהוא לדבוק בקלות על משטחי הזכוכית ופלסטיק. מניפולציה בינוני מכיל 4 מ"ג / מ"ל ​​של אלבומין בסרום שור (BSA) כדי למנוע עיקול, אך חומצה Tyrode של או PBS לא, ולכן, כדי להפחית את הסיכון של נזק או אובדן של העוברים לא להרים יותר מ 2 - 5 blastocysts הערומים בכל פעם כאשר מניפולציה אותם BSA חינם או סרום ללא PBS או חומצה Tyrode של.
    הערה: לחילופין, מעיל פיפטה זכוכית עם 1% BSA לפני השימוש כדי להפחית הדבקות של עוברים אל משטח זכוכית.

מעיל התחתון של כל טובשל הצלחת בתרבית רקמה 4-היטב עם שכבה דקה של אגר 1%, 0.9% NaCl כדי למנוע עובר מן דבקות הפלסטיק. לחלופין, להוסיף 4 מ"ג / מ"ל ​​של BSA אל PBS (PBS-BSA).

מלאו גם אחד של המנה בתרבית רקמה 4-היטב מצופה 500 μl של PBS RT (או PBS-BSA) ועוד היטב עם 500 μl של 4% PFA ב PBS.

לשטוף blastocysts ב RT PBS ולתקן ב 4% PFA ב PBS במשך 10 דקות ב RT. מעבירים PBS (או PBS-BSA) לאחר קיבוע.

אם עובר לא הולכים להיות מעובד מייד, מכסה את PBS המכיל את העוברים עם שכבה של שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי (שמוביל התייבשות של מדגם) ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: שיטות קיבוע שונות ובזמנים ניתן להשתמש בהתאם הניסוי, אפיטופים ריבית לבין הנוגדנים לשמש. לפי שיטת הבחירה, להיות עקבית לאורך ניסויים שווים להקלת ההשוואה הבאה של התוצאות המכתימות.
הערה: השההניתן לאחסן עוברים ב 4 ºC ב PBS עד כמה שבועות לפני שתמשיך לשלב הבא: נקודה. ודא PBS הוא סטרילי ו / או להוסיף 100 U / ml של פניצילין + 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס) על מנת למנוע זיהום חיידקי (במיוחד כאשר באמצעות PBS-BSA) אם מראש אחסון ממושך.

2. Immunofluorescence

1. בצע immunofluorescence באמצעות כל פרוטוקול כי נבדק בעבר והוכח חזקים immunofluorescence כל הר. הערה: אנו ממליצים אלה המתוארים ^{22 ו} -11. במאמר הנוכחי לשעבר יתוארו. לפי שיטת הבחירה, להיות עקבית לאורך ניסויים שווים להקל על ההשוואה של התוצאות המכתימות.
2. השתמש, פוליוויניל גמישה, ברור, U-בתחתית הצלחת 96-היטב לבצע את הצעדים סדרתי של פרוטוקול immunofluorescence. ממלא כל טוב עם 50 - 100 μl של פתרון ולעבור עובר מפתרון אחדלמשנהו באמצעות פיפטה בפה בצורת L. הערה גישה זו מפחיתה את צריכת חומרים כימיים ומקל צעדים מעקב כמו גם מכתים מקביל של קבוצות הניסוי מספר.
   1. אופציונלי: מעיל התחתון של בארות עם שכבה דקה של אגר 1%, 0.9% NaCl כדי למנוע הידבקות של עוברים אל פלסטיק. אל תוסיף BSA לפתרונות immunofluorescence.
3. כן PBX (0.1% Triton X-100 ב PBS). אם מראש את ביצוע ניסויים immunofluorescence כמה, להכין 50 מ"ל של PBX ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בין הניסויים.
4. כן פתרון permeabilization (0.5% טריטון X-100, גליצין 100mm ב PBS). הפוך 1 מ"ל (או לפי הסכום הדרוש) של פתרון permeabilization טרי עבור כל ניסוי.
5. כן פתרון לחסימה (סרום סוס 2% (HS) או 20% בסרום שור עובר (FBS) עם העט-סטרפטוקוקוס ב PBS). הכן 10 מ"ל ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בין הניסויים.
   1. לא נמצאו הבדלים נצפו בין אםסוג של סרום, עם זאת, להיות עקבי בבחירת פתרון לחסימה המשמש בניסויים מקבילים.
6. שטפו עוברי קבוע במשך 5 דקות ב RT ב PBX (~ 100 μl).
7. Permeabilize עוברים במשך 5 דקות ב RT בתמיסה permeabilization (~ 100 μl).
8. לשטוף עוברים במשך 5 דקות ב RT ב PBX (~ 100 μl).
9. עובר בלוק למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
   הערה: עובר יכול להיות חסום עד O / תקופות N ב 4 ºC ללא שיפור ניכר או לרעה כשמשווות 30 צעדי חסימת דקות.
10. דגירה עוברת O / N ב 4 ºC ב נוגדן ראשוני / נוגדנים מדוללים חסימת פתרון (~ 100 μl). מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
    1. לקבוע דילול אופטימלי עבור כל נוגדן ראשוני לפני כן. ראה דסעיף iscussion וחומרי דילולים נבדקים של מספר הנוגדנים.
11. לאחר דגירה O / N, לשטוף עוברים 3x עבור 5 דקות כל אחד ב RT PBX (~ 100 μl).
12. עובר בלוק למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
13. דגירה עוברת 1 עד 2 שעות ב 4 ºC נוגדן / נוגדנים משני מדולל ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר ב ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
14. עוברים לשטוף 2x עבור 5 דקות כל אחד ב RT PBX.
15. זז העוברים כתם DNA עדיף. אם באמצעות Hoechst 33342, לדלל עד 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב PBS. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
    הערה: נקודת השהה: אם עוברים אינם צילמו מיד, הם יכולים להישמר במשך up לכמה שבועות בתמיסה מכתימה גרעינית. במקרה זה, להבטיח PBS הוא סטרילי ו / או להוסיף פן-סטרפטוקוקוס או נתרן אזיד כדי למנוע התפתחות חיידקים וזיהום.

3. הדמיה Confocal

הערה: תצורות מיקרוסקופ confocal פרט תדרושנה פרמטרי רכישה ספציפיים להיות מותאם עבור מערכה והתוכנה במקום. עם זאת, בסעיף הבא מספק סט של חוקים כלליים לעקוב שאמורה לחול על כל התקנה נתונה.

1. בעזרת פיפטה בפה בסדר, לעשות microdrops של PBS או פתרון גרעיני כתם על משטח הזכוכית של צלחת זכוכית תחתונה 35mm ומכסי שמן מינרלים. כחלופה, להשתמש coverslip רגיל עם מפרידי סיליקון כדי למנוע נזק עוברי ומכסים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. הערה: בעת שימוש coverslip קבוע, עובר לא יכול לאחר מכן לשנות את מיקומו או התאושש עבור גנוטיפ, ולכן אנו ממליצים בחום על שימוש של זכוכית תחתונהכלי אוכל.
2. עוברים מקום ב microdrops ולסדר באופן העולה בקנה אחד, רצוי עם מקביל לציר ICM-חלל אל משטח זכוכית. הגדרת צלחת על בעל מיקרוסקופ. הערה: תמונות מתקבל על מיקרוסקופים confocal סריקת לייזר סובלים הפסד הקשורים ציר Z של עוצמת הקרינה. לכן, העקביות בהסדר חשובה להשוואת עוצמות בין אזורים השווים על עוברים שונים.
3. הגדרת פרמטרים להתייחסות באמצעות עוברים סוג בר שלא הייתם כפופים לכל סוג של טיפול שעשוי לשנות ביטוי גנים.
   1. לרכוש תמונות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה (כלומר, 40X ומעלה) על מנת לקבל נתונים שיאפשרו פילוח מדויק באמצעות כלי ^{-4 דקות נוספות.}
      הערה: שימוש בזום דיגיטלי על מטרת 20X לא יניב תמונות ברזולוציה של הולם הפילוח באמצעות דקות. כדאי גם לציין את מרחק העבודה (WD) של המטרה, כפי שהוא אמור להיותמספיק כדי לאפשר רכישה של מחסנית Z כי משתרע על פני הבלסטוציסט כולו, ובכך ארוכה WD (~ 130 - 150 מיקרומטר) המטרה היא בדרך כלל יש צורך. התמונות מוצגים איורים 2 - 4 נרכשו באמצעות טבילה אובייקטיבי 40X / NA 1.30 שמן עם מרחק עבודה של 210 מיקרומטר.
   2. השתמש בפלט לייזר הנמוך ביותר המספק יחס אות לרעש חזק בלי הלבנת fluorophores.
   3. התאם את הרווח לקזז להשיג את הטווח הדינמי הרחבה ללא overexposing המדגם. חשיפת תמונות כדי לכסות את רוב, או להקיף את מגוון התמונה במלואה, אפור יקל על זיהוי ההבדלים קטנים בעוצמה בין התמונות.
   4. השתמש צעד Z קטן (1 מיקרומטר), מאז החלטת ציר Z היא קריטית עבור פילוח מדויק עם דקות.
      הערה: ממדי XY אינם משפיעים על תהליך הפילוח הגרעיני, רק את קובץ תמונה. באופן כללי, 512 x 512 פיקסלים היא החלטה XY מספיק תמונות פרסום באיכות ללא compromiלשיר מקום בכונן הקשיח.
   5. צעד קריטי: שמור הדמית פרמטרים עקביים בתוך ועל פני הפעלות הדמיה של אותו הניסוי כדי להיות מסוגל להשוות בין דגימות.
4. הדמיה אצוות של עוברים:
   1. קבוצות תמונה קוהרנטית (המלטות, ניסויים) בפגישה אחת בכל הזדמנות אפשרית.
   2. שמור פרמטרים עקביים בתוך ועל פני הפעלות הדמיה עבור משכפל של אותו הניסוי.
   3. עוברים תמונה לאורך (כל ציר Z) כדי ללכוד כל תא.
      הערה: אם תרצה, גנוטיפ העובר עלול להיעשות לאחר הדמיה כמתואר ^23. הצורך PCR מקוננות צריך להיקבע באופן אמפירי ויהיה תלוי את הלוקוס להיות מנותח ואת פריימרים בשימוש.
5. הקפד תוכל להתאים עובר לתמונות למפרע.

תמונה 4. ניתוח נתונים טרום עיבוד

1. הורד והתקן MINS ⁴ מ- http: // Katlab-tools.org (רישיון MATLAB חובה).
2. בצעו פילוח תמונה:
   1. בצע את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של דקות עד לטעינת תמונה confocal או מחסנית מהכונן הקשיח, לזהות את הגרעינים ואת לפלח את התמונה. טען את מחסנית Z כולו של נתונים גולמיים שהופקו על ידי מיקרוסקופ (.lsm, .lif, .oif, וכו '). ראה טבלה 2 לפרטים על כל צעד והוראות למצוא http://katlab-tools.org ^ו -4. לאחר השלמת, להציג את התוצאה של כל שלב על ידי לחיצה על כפתור 'הצג' המתאים. תג צהוב מעל הכפתור מציין פעולה בתהליך, תג ירוק מציין מסיים את המבצע.
      הערה: MINS אינו תומך בשלב זה קבצי .czi, .tiff רצפים או קבצים מרובים מיקום - כל מחסנית Z צריכה להיות קובץ עצמאי.
   2. לאחר פילוח משביע רצון, להציל את צינור נוצר כדי שניתן יהיה להשתמש בהם ישירות על עוברי או המלטות אחרות.
3. פילוח תצווה-Mode:
   הערה: Siניתן לפלח קבצים ngle בנפרד. עם זאת, בהתחשב בכך עובר בתוך המלטה או ניסוי הם בדרך כלל שלב השוואה, MINS יכול להחיל את צינור הפילוח נוצר עבור תמונה אחת לקבוצה של אותם ללא השגחה.
   1. מתוך אצווה-Mode בתפריט Run, לחץ על 'הוסף קבצים' ולטעון את כל הקבצים להיות מעובד בו זמנית. הערה: קבצים ממקורות שונים ניתן להוסיף לתור פילוח.
   2. לחץ על 'התחל תצווה מצב הפעלה "ולאפשר פעמי עבור תוכנה לעבד את הקבצים. הערה: פלט פילוח יישמר באותה ספרייה שבה נמצא קבצים המקוריים שבו ממוקמת.
4. הערכת פילוח ו תיקון ידני
   הערה: MINS מגזרי תמונות ברמת דיוק גבוה מאוד (> 85%), לעומת זאת, איכות מכתים ההדמיה, כמו גם את השלב של עובר, עשויה להשפיע על ביצועי דקות. באופן כללי, את הצפיפות הגרעינית הגבוהה בתוך העובר, את שגיאות הפילוח הסביר יותר יהיה לקחת Placדואר (2D הדמוי, 3). לפיכך, דיוק פילוח יש להעריך עבור כל דגימה ותקן באופן ידני במידת הצורך. שני סוגים של טעויות מתרחשים בדרך כלל: יתר פילוח ותחת-סגמנטציה.
   1. פתרון על-פילוח:
      1. לזהות תוצאות חיוביות שגויות - שלפוחית ​​אפופטוטיים (א איור 3 א, ב, ד, כוכביות) או גורמים אחרים שאינם גרעינים שלמים, אך יכולים להיות מזוהים ככאלה על ידי דקות.
         הערה: תוצאות חיוביות שגויות באופן כללי כזה יש גודל קטן יותר מאשר גרעינים אמיתיים יכולות, ברוב המכריע של מקרים, להיות מזוהה בקלות מסודרת על הגיליון. עם זאת, בחינה חזותית מומלצת מאוד, כפי שהרבה פעמי גרעינים ניתנים מפולחים באופן חלקי בלבד, וכתוצאה מכך קטן יותר, אבל נפח מפולח תקף (איור 3 א ב, ראש חץ).
      2. מחק את הרשומות המתאימות עבור תוצאות חיוביות שגויים מהקובץ * statistics.csv. לשמור על הסטטיסטיקה * המקורית.csv להגיש לעיון בעתיד ולערוך רק עותק ממנו.
      3. אם גרעין כבר מעל מפולח ומוצג 2 או יותר גרעינים (איור 3 א ג, חץ וראש חצים), למזג את הרשומות על ידי חישוב ממוצע רמת האינטנסיביות שלהם או, אם דומה, לשמור אחד תקליטים עבור תא זה וזורק לָנוּחַ.
   2. פתרון תת פילוח:
      1. זיהוי אירועים בהם MINS נכשל לזהות את הגבול בין שניים או יותר גרעינים וכתוצאה מכך מפולח בהם גרעין יחיד (איור 3 א ד, חץ 3B). הערה: זה מהווה בעיה עבור ספירת תאי מדויקת, אבל יותר חשובה, לכימות רמות חלבון, כמו רמות הנמדדות יהיה ממוצעת של התאים שמוזגו בטעות, ואשר עשוי להשתייך שושלות שונות.
      2. זיהוי אירועים בהם MINS נכשל לזהות גרעין לגמרי.
      3. במקרים אלה (4.4.2.1 ו 4.4.2.2), למדוד את הרמות האפורות הממוצעות fאו כל ערוץ בתא מתחת או בלתי מפולח (הים) באמצעות כלי חלופי, כגון ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), ולהחליף את השיא שגוי עם הרמות נכונות. שמור את קובץ statistics.csv * המקורית לשימוש עתידי ולערוך רק עותק ממנו. כדי לעשות זאת באמצעות ImageJ, בצע את הפעולות הבאות:
         1. פתח את מחסנית רב ערוצית הרלוונטית על ImageJ ולייבא את קובץ overlaid.tiff * המקביל שנוצרו על ידי MINS כערימה וירטואלית ( 'קובץ'> 'יבוא'> 'מחסנית וירטואלית TIFF ... ").
         2. מצא קטע המדיאלי של גרעין מתחת או בלתי מפולח.
         3. שימוש בכלי בחירה ביד החופשי המתאר את ההיקף של הגרעין מתחת או בלתי מפולחת בערוץ כתם DNA.
         4. לחץ CRL + M (Cmd + M על מקינטוש) או ללכת לתפריט לנתח ובחר "מדוד". פעולה זו תתעד את הערך האפור הממוצע עבור האזור שמסומן ותציג אותו על חלון חדש. עבור אל 'ניתוח'>9; מדידות הגדר ... "ולוודא 'Mean ערך אפור', מסומן. בחרו פרמטרים אחרים כדי להימדד.
         5. השימוש באותו האזור המוגדר בשלב 4.4.2.3.3, לחזור על המדידה עבור כל אחד מערוצי הקרינה של העניין. התוצאות תצורפנה קודם על החלון 'התוצאות' המדידות.
         6. השתמש המדידות שהושגו להחליף את הרישומים שגויים בקובץ * statistics.csv. אם הגרעין לא היה מפולח, להכניס שורה חדשה, להקצות לו מספר סלולרי חדש ולהציג את הערכים שהתקבלו ב ImageJ תחת העמודה המתאימה לכל ערוץ. התא זה לא יהיה קואורדינטות מרחביות (X, Y ו- Z ערכים). אם הגרעין היה undersegmented, לשכפל ברציפות שלה, להקצות מזהים תאים שונים לכל תא חדש ולהציג את הערכים שהתקבלו ב ImageJ תחת העמודה המתאימה. במקרה זה, שני תאים יחלקו קואורדינטות מרחביות.
            הערה: אם הפריסה המרחבית היא להיות מנותח, אנחנו Recommend למעט XYZ קואורדינטות של תאים אלה, כפי שהם יהיו חופפים. לשם כך, בעת יצירת רשומות חדשות, להקצות מזהים סלולריים להם כי יש להבחין בקלות מן המקוריים (למשל, מספרים לא שלם).
   3. ציון חלוקת תאים. הערה: MINS מזהה mitotic וכן גרעיני שלבי ביניים, אבל לא יכול להבחין ביניהם.
      1. אם הגרעינים mitotic נחשבים בנפרד בניתוח, ידני להבקיע אלה ולהוסיף מידע זה לקובץ נתונים. כדי להקליט תאים mitotic, להוסיף משתנה חדש (טור) לקובץ נתונים * statistics.csv ו להקצות ערכים שונים mitotic ו שלבי גרעינים.
5. נתוני עיבוד מראש.
   הערה: לאחר הגיליונות האלקטרוניים תוקנו ב- יתר ותחת-פילוח הם מוכנים להיות מנותחים. תהליך הניתוח והצגת נתונים יהיה תלוי בניסוי הספציפי. עם זאת, להלן כמה טרנספורמציות נתונים כללייםאנו ממליצים לבצע לפני ניתוח:
   1. להפוך את ערכי עוצמת הקרינה לתוך לוגריתם שלהם או שורש ריבועי להפחית את מידת הפיזור של הנתונים. זה גם עוזר להדמיה, כמו את הנתונים הגולמיים נוטים להתרכז ליד צירי העלילה (ראה איור 4 ב ', ג').
   2. תקן את ההנחתה קשורה-Z של קרינה:
      הערה: עוצמת הקרינה תמונות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר מקטין את עמוק על Z ציר פרוסה ממוקמת (איור 4E, F).
      1. אם אחד אפיטופים זוהו בדגימות הוא סמן גרעיני ניקיון בכל מקום ועל הומוגנית הביע, לנרמל את עוצמות הקרינה של אפיטופים האחרים על ידי חלוקת ערכיהם בכל תא לפי הערך המקביל של סמן המשק.
      2. בהעדר אובדן הקרינה כגון סמן התייחסות, לפצות הקשורים-Z באופן הבא:
         1. מגרש את הערכים של כל סמן (Yציר של הגרף) על פני עמדתו Z (ציר X של הגרף) כדי להמחיש את הירידה באינטנסיביות Z - העלילה יחד את הערכים עבור כל שליטה, עוברים סוג בר (איור 4F).
         2. התאם מודל ליניארי (עקומת רגרסיה) לעלילה שהושגו בשלב הקודם (עוצמת ערכים מעל Z) עבור כל סמן (איור 4F).
         3. לתקן את כל הערכים עבור כל סמן באמצעות הנוסחה הבאה:
            יומן (הערך המקורי) + Z * שיפוע מודל (איור 4D, G).
            הערה: צעדים ספציפיים לבצע תיקון זה יהיה תלוי תוכנת ניתוח בשימוש (R, MATLAB, וכו '). אם באמצעות R, להפעיל את הנוסחה הבאה כדי להתאים מודל ליניארי לנתונים:
            > Lm (log (ערוץ) ~ Z, נתונים = dataframe)
            שם, הערוץ הוא דורש תיקונים ערוץ הקרינה, Z הוא Z לתאם dataframe היא טבלה המכילה את כל הערכים עבור העובר הרצוי (ים) (על מכת מדינה *istics.csv הקובץ שנוצר על ידי MINS או לשינויו).
            הערה: תפוקת הנוסחה דלעיל תהיה במתכונת הבאה:
            Z (יירוט)
            4.76373 -0.01947
            שם, תיאר Z ערך הוא השיפוע של קו הרגרסיה עבור מערך נתונים, אשר ערך מוחלט צריך להשתמש בהם כדי לשנות את הערך המקורי עם הנוסחה הנתונה ב 4.5.2.2.3 (ראה איור 4G עבור דוגמה).

Results

כדי להקל על נתונים לפרשנות מצגת, יש להיזהר שלא לפגוע בעוברים במהלך האיסוף והמניפולציה, כך שכל התאי ואת המיקום היחסי שלהם ניתן לנתח איור 2 א -. D מציגה דוגמאות של blastocysts השלם בשלבים שונים עם חלל מורחב. צריך לפגוע להתרחש, טיפול נוסף יש לנקוט בעת ניתוח ופירוש התוצאות.

איכות ואמינות של הנתונים המופקים באמצעות פרוטוקול זה תלוי באיכ...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק ²² ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת ^4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריטית, אנו מוצאים את אחד המוצג כאן ²² להיות מהיר, אמין ולספק אות יציבה עבור רבים של הנוגדנים בדקנו. פרוטוקולים אחרים עשויים להיות מלווה, ובלבד בקשתם עקבית לאורך ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>אוסף עוברים
בדיקה קהה לבדיקת תקע	Roboz	RS-9580
מלקחיים	Roboz	RS-4978
מספריים לניתוח	Roboz	RS-5910
פיפטות פסטר זכוכית	פישר	13-678-20C
צינור שואב מורכב מראש & שופר	Sigma	A5177
צינורות גומי ארוכים יותר	פישר	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
תמיסה של חומצה טירוד	Millipore	MR-004-D
פניצילין/סטרפטומיצין	Gibco	15140
סרום בקר אלבומין	Sigma	A9647
צלחות 4 בארות	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<חזק>אימונופלואורסצנטי
96 בארות U-bottom צלחות	פישר	14-245-73
טריטון X-100	סיגמא	T8787
גליצין	סיגמא	G7403
סרום סוסים	סיגמא	H0146
<חזק>נוגדנים ראשוניים			<חזק>ריכוז
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	סנטה קרוז	sc-9053	1:100, קיבוע 10 דקות
GATA4	סנטה קרוז	sc-1237	1:100, קיבוע O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	סנטה קרוז	sc-5279	1:100, 10 דקות לקיבוע O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
נוגדנים משניים	טכנולוגיות חיים	שונות	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
<חזק>הדמיה
35 מ"מ כלי זכוכית עם תחתית זכוכית	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
מחשב עם מערכת הפעלה		n/a	ודא דרישות מערכת מינימליות ב-http://katlab-tools.org וב-Lou et al., (2014) דוחות תאי גזע
MATLAB (תוכנה)	Mathworks	n/a
MINS (תוכנה)	חינם	n/a	http://katlab-tools.org