Method Article

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

DOI:

10.3791/53654

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו ').

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים - אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט - ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) 1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ co....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: כל העבודה מן החי, כולל בעלים, רבייה וקרבה אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של מרכז סרטן קטרינג סלואן זיכרון ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 03-12-017.

אוסף עובר 1.

הערה: כל עבודת החיה חייבת אושרה על ידי הרשויות מוסדיות המקומיות להתאים חוקים מקומיים ומוסדיים.

  1. Mate עכברת בתולה עם זכר הרבעה פורה של גנוטיפים הרצוי.
    הערה: אם הגדרת הזדווגויות טבעיות, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקל על נתונים לפרשנות מצגת, יש להיזהר שלא לפגוע בעוברים במהלך האיסוף והמניפולציה, כך שכל התאי ואת המיקום היחסי שלהם ניתן לנתח איור 2 א -. D מציגה דוגמאות של blastocysts השלם בשלבים שונים עם חלל מורחב. צריך לפגוע להתרחש, טיפול נוסף יש לנקוט בעת ניתוח ופירוש התוצאות.

איכות ואמינות של הנתונים המופקים באמצעות פרוטוקול זה תלוי באיכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק 22 ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת 4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריטית, אנו מוצאים את אחד המוצג כאן 22 להיות מהיר, אמין ולספק אות יציבה עבור רבים של הנוגדנים בדקנו. פרוטוקולים אחרים עשויים להיות מלווה, ובלבד בקשתם עקבית לאורך .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לסטפנו די טליה, אלברטו פוליאפיטו, ונקטרמן סשאן ופנאגיוטיס קסנופולוס, על המשוב על הטיפול בנתונים, ניתוח וייצוג, לברניקה פלוסה על הסיוע בתכנון פרוטוקול האימונופלואורסצנטי ובדיקת הנוגדנים ולחברי מעבדת Hadjantonakis על ההערות על כתב היד ועל פיתוח פרוטוקול זה. העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01-HD052115 ו-R01-DK084391, ועל ידי NYSTEM N13G-236.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>אוסף עוברים
בדיקה קהה לבדיקת תקעRobozRS-9580
מלקחייםRobozRS-4978
מספריים לניתוחRobozRS-5910
פיפטות פסטר זכוכיתפישר13-678-20C
צינור שואב מורכב מראש & שופרSigmaA5177
צינורות גומי ארוכים יותרפישר14-178-2AA     
M2MilliporeMR-015-D
FHMMilliporeMR-024-D
תמיסה של חומצה טירודMilliporeMR-004-D
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140
סרום בקר אלבומין SigmaA9647
צלחות 4 בארותNunc/Thermo-Fisher12-566-300     
<חזק>אימונופלואורסצנטי
96 בארות U-bottom צלחותפישר14-245-73
טריטון X-100סיגמאT8787
גליציןסיגמאG7403
סרום סוסיםסיגמאH0146
<חזק>נוגדנים ראשוניים<חזק>ריכוז
CDX2BiogenexAM392-5M1:200
GATA6R& DAF17001:100
GATA4סנטה קרוזsc-90531:100, קיבוע 10 דקות
GATA4סנטה קרוזsc-12371:100, קיבוע O/N
SOX17R& DAF19241:100
NanogReproCELLRCAB0002P-F1:500
OCT4סנטה קרוזsc-52791:100, 10 דקות לקיבוע O/N
DAB2BDBD-6104641:200
נוגדנים משנייםטכנולוגיות חייםשונות1:500
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
<חזק>הדמיה
35 מ"מ כלי זכוכית עם תחתית זכוכיתMatTekP35G-1.5-14-C
Segmentation
מחשב עם מערכת הפעלהn/aודא דרישות מערכת מינימליות ב-http://katlab-tools.org וב-Lou et al., (2014) דוחות תאי גזע
MATLAB (תוכנה)Mathworksn/a
MINS (תוכנה)חינםn/ahttp://katlab-tools.org
Windows 64 סיביות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Expression AnalysisMouse Preimplantation EmbryosConfocal Microscopy ImagingImage Segmentation AnalysisMINS Software ToolNuclear Marker QuantificationImmunofluorescence ProtocolEmbryo Collection ProcedureBlastocyst Isolation MethodSingle Cell Resolution

Related Articles