הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

6.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53657

⸱

4 במאי 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים בפירוט גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse למדידת הגיוס הזמני של EYFP-Parkin במהלך הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה. תהליך דינמי זה של הסרה תלויה ב-EYFP-Parkin של מיטוכונדריה פגומה יכול לשמש כאינדיקטור לבריאות התא בתנאי ניסוי שונים.

תקציר

ניתן להגדיר מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת של תאים חיים. טכניקה זו מסתמכת על איסוף תמונות בנקודות זמן שונות. ניתן להגדיר מרווחי זמן באמצעות ממשק מחשב השולט במצלמה המשולבת במיקרוסקופ. סוג זה של מיקרוסקופיה דורש הן את היכולת לרכוש אירועים מהירים מאוד והן את האות שנוצר על ידי המבנה התאי הנצפה במהלך אירועים אלה. לאחר איסוף התמונות, מורכב סרט של הניסוי כולו כדי להראות את הדינמיקה של האירועים המולקולריים המעניינים. למיקרוסקופ וידאו Time-lapse יש מגוון רחב של יישומים בתחום המחקר הביו-רפואי ומהווה כלי רב עוצמה וייחודי למעקב אחר הדינמיקה של האירועים התאיים בזמן אמת. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים להעריך אירועים תאיים כגון נדידה, חלוקה, העברת אותות, גדילה ומוות. יתר על כן, באמצעות בדיקות מולקולריות פלואורסצנטיות אנו מסוגלים לסמן מולקולות ספציפיות, כגון DNA, RNA או חלבונים ולעקוב אחריהן במסלולים ובתפקודים המולקולריים שלהן. למיקרוסקופ וידאו Time-lapse יתרונות מרובים, העיקרי שבהם הוא היכולת לאסוף נתונים ברמת התא הבודד, מה שהופך אותו לטכנולוגיה ייחודית לחקירה בתחום הביולוגיה של התא. עם זאת, למיקרוסקופ וידאו זמן-lapse יש מגבלות שעלולות להפריע לרכישת תמונות באיכות גבוהה. תמונות יכולות להיפגע על ידי שני גורמים חיצוניים; תנודות טמפרטורה, רעידות, לחות וגורמים פנימיים; pH, תנועתיות תאים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לרכישה דינמית של חלבון ספציפי, פרקין, המשולב עם החלבון הפלואורסצנטי הצהוב המשופר (EYFP) על מנת לעקוב אחר הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה, באמצעות גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse.

מבוא

אוטופגיה מאקרו היא תהליך תוך-תאי הכרוך בפירוק קטבולי של רכיבים תאיים פגומים ולא מתפקדים, כגון אברונים וחלבונים לצורך מיחזור או ייצור אנרגיה. כדי ליזום תהליך מטבולי זה, התא בולע את מרכיבי התא הפגועים למבנה ממברנה כפולה, המכונה אוטופאגוזום, המתמזג עם ליזוזום ותכולתו מתפרקת וממוחזרת 1,2. ישנם שני סוגים עיקריים של אוטופגיה, לא סלקטיבי וסלקטיבי. תהליך האוטופגיה הלא סלקטיבי מתרחש כאשר התא נמצא בתנאי מחסור בחומרים מזינים וצריך לחפש חומרים מזינים חיוניים ואנרגיה. עם זאת, אוטופגיה סלקטיבית מתרחשת כדי לתווך את ההסרה של אברונים לא מתפקדים/פגומים וחלבונים שאחרת עלולים להיות רעילים. אחד מתהליכי האוטופגיה הסלקטיביים הנחקרים ביותר הוא הסרת מיטוכונדריה, המכונה מיטופגיה 1,3-5.

מיטוכונדריה הם האברונים המרכזיים לחילוף החומרים של התאים והמקור העיקרי לאדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני דרך שרשרת הובלת האלקטרונים, חמצון חומצות שומן ומחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA). יתר על כן, המיטוכונדריה מווסתת את ייצור מיני החמצן התגובתי (ROS) ומשחררת חלבונים המשתתפים במסלולי מוות תאי 6-8.

PTEN המושרה על ידי קינאז 1 (PINK1) ופרקין RBR E3 יוביקוויטין ליגאז (פרקין) הם חלבוני המפתח המעורבים בתהליך המיטופגיה. פרקין יכול להגן מפני מוות תאים על ידי שמירה על בריאות התאים באמצעות בקרת איכות מיטוכונדריאלית9. עם אובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, פרקין ציטוזולי מגויס למיטוכונדריה על ידי PINK1. גיוס זה מעורר את האירועים הרציפים של מיטופגיה 10. יש מגוון רחב של ראיות לכך שמיטופאגיה היא תהליך בקרת איכות מיטוכונדריה בסיסי וחריגות בתהליך זה מניעות את המחלה 7. לדוגמה, מחלת פרקינסון אוטוזומלית רצסיבית נקשרה למוטציות בגנים המקודדים לפרקין ו-PINK1 (PARK2 ו-PINK1, בהתאמה) 11. בקרת האיכות של בריאות המיטוכונדריה חיונית להסרת מיטוכונדריה התורמים להצטברות ROS12. נוכחות מוגזמת של ROS תוך-תאי עלולה להוביל לנזק הן ל-DNA הגרעיני והן ל-DNA המיטוכונדריאלי (DNA ו-mt DNA, בהתאמה).

כאן, אנו מראים גישת מיקרוסקופ וידאו בהילוך מהיר כדי לעקוב אחר הצטברות פרקין לאחר השראת מיטופגיה בתיווך פרקין בפיברובלסטים עובריים של עכברים אימורטליים באמצעות מתן מבחנה של קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)-פנילהידרזון (FCCP), חומר ניתוק. FCCP משבש את סינתזת ה-ATP על ידי קצר חשמלי של פרוטונים על פני קרום המיטוכונדריה החיצוני ומכאן ניתוק זרחון חמצוני משרשרת הובלת האלקטרונים 13. הפעלת הדפולריזציה של הממברנה המיטוכונדריאלית מובילה לשיבוש המיטוכונדריה ולהסרה סלקטיבית התלויה בפרקין. לכן, טרנספיקציה של התאים המעניינים עם וקטור ביטוי המקודד פרקין התמזג עם סמן פלואורסצנטי (חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר, EYFP) יכולה לשמש כתג פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר גיוס פרקין במהלך התהליך המיטופגי. על מנת לדמיין את המיטוכונדריה, ביצענו במשותף pDsRed2-Mito, המקודד חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed2) המכיל רצף מיקוד מיטוכונדריאלי של תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז (Mito). pDsRed2-Mito מיועד לתיוג פלורסנט של מיטוכונדריה14. ניתן למדוד את הזמן הנדרש לטרנסלוקציה של פרקין לקרום המיטוכונדריה, והוא נותן מדד עקיף לבריאות התאים. לדוגמה, אנו יכולים לומר שאם קו תאים שנפגע עבור גן מסוים מעניין מראה גיוס מהיר או איטי יותר של פרקין לאחר השראת מיטופגיה על ידי FCCP, תוצר הגן הזה יהיה שחקן מפתח על מנת לשמור על קצב חילוף החומרים של התא במצב הפיזיולוגי ולמנוע התפתחות של מחלות. לכן, מיקרוסקופ הווידיאו Time-lapse מספק כלי רב עוצמה ליישומי מחקר בסיסיים וקליניים כאחד במעקב אחר הדינמיקה של חלבונים מסומנים במהלך התהליכים המולקולריים שלהם והבנת האופן שבו תהליכים אלה מושפעים במהלך מצב פתולוגי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Electroporation של פיברובלסטים עם שניהם הביטוי וקטורים EYFP-פרקין ו pDsRed2-מיטו

  1. לגדל את תאי פיברובלסטים עובריים בעכבר הונצח על 10 סנטימטר צלחת רקמות תרבות באמצעות DMEM (המדיום של הנשר השונה של Dulbecco) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין באווירה humidified המכיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
    1. ב 80% התא confluency, להשליך את המדיום DMEM מלאה על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת פוספט חיץ 1x סטרילי (PBS) (80 גרם של NaCl, 2.0 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na 2 4 HPO, 2.4 גרם של KH 2 PO 4 ו -1 L מזוקקים H 2 O, PH: 7.4).
    2. בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ"ל של מדיום DMEM מלאה, resuspend התאים ולהוציא 10 _6; l של ההשעיה תא עבור ספירת hemocytometer.
      הערה: hemocytometer מתוכנן כך שמספר התאים סט אחד של 16 ריבועים בפינה הוא שווה למספר של תאים x 10 4 / מ"ל.
  2. זרע 1 x 10 6 תאים על 10 ס"מ רקמות תרבות מנות 24 שעות לפני תהליך electroporation.
  3. מחק את מדיום DMEM המלא על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילית. בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ"ל של מדיום DMEM מלאה ו resuspend התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל.
  4. ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות-בקירור (4 מעלות צלזיוס). בטל supernatant ידי יניקה סטרילית resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS סטרילית. ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. בטל supernatant ידי יניקה סטרילי, ולהוסיף 100 μl of שילוב פתרון electroporation (82 μl של electroporation פתרון V + 18 μl של פתרון משלים 1) אל תא גלולה בעדינות resuspend גלולה ידי pipetting (לפרטים נוספים עיין במדריך למשתמש). הוסף 2 מיקרוגרם של EYFP-פרקין (עירור / פליטה 514/527) ו 1 מיקרוגרם pDsRed2-מיטו (עירור / פליטה 565/620) בבית ההשעיה תא.
  6. מעביר את הפתרון כדי קובט סטרילי באמצעות פסטר הפנויה (שני הכלים הם מצורפים לערכה) ו electroporate באמצעות התכנית שנקבע מראש NIH / 3T3 U-030 (דופק יחיד, מתח 200 V, קיבול 960 μF, דופק זמן 20 אלפיות שני דופק, מספר: 1).
  7. מיד לאחר electroporation, להוסיף 500 μl של מדיום DMEM מלאה טרום חימם טרי וזרעי התא על צלחת 6 ס"מ רקמות תרבות חיה הדמיה בדרגה דגירה אותם באווירה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

2. מיקרוסקופית זמן לשגות וידאו

  1. הגדר את הטמפרטורה של תא מיקרוסקופ ב 37 ° C לפני השימוש.
  2. בשלב זה, להכין מדיום הדמיה חיה ספציפית כדי להמשיך עם פרוטוקול הניסוי. הכן את המדיום הדמיה לחיות כדלקמן; לערבב בתוספת פנול ללא DMEM עם 10% בסרום שור עוברית, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל, ו -100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין. טרום לחמם את המדיום הדמיה לחיות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. מחק את המדיום של תאים electroporated ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הדמיה מחומם מראש חי, באמצעות pipet P1000 דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. במהלך תקופת דגירת צלחת, זרם 5% CO 2 בתא של מיקרוסקופ כבר בטמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. מניח את הצלחת עם תאי electroporated ההחדרה של מיקרוסקופ הימנעות תנודות משמעותיות או תנודות.
  6. באמצעות ממשק התוכנה, להגדיר את המיקרוסקופ כדי לזהות הן fluoreScence אותות מן החלבונים היתוך המקודדים על ידי וקטורים-טרנספקציה שיתוף, EYFP-פרקין (טווח עירור 495 כדי 510 ננומטר ופליטה טווח 520 כדי 550 ננומטר, ירוק) ואת ננומטר pDsRed2-מיטו (558 ננומטר מקסימום עירור ופליטה 583 מקסימום, אָדוֹם).
    1. פתח את תוכנת מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. בתפריט העליון בחר FITC עבור EYFP-פרקין ו Rhodamine עבור pDsRed2-מיטו. בתפריט העליון בחר את ההגדלה (20X).
  7. באמצעות ממשק התוכנה, חפש את התא הבודד שמבטא וקטורי שיתוף transfected ולרשום את המיקום. חזור על פעולה זו עד למינימום של 10 תאים נאסף עבור כל תנאי הניסוי (קבוצת הניסוי).
    1. בחר בתפריט "Apps" ולחץ על רכישה רבה ממדים. בחלונות רכישת Multi Dimensional לבחור את הפרמטרים הדרושים, כגון מספר רכישות, מרווח הזמן בין כל רכישה ואת המיקום של התא מוקלט. לחץ על "לרכוש"כדי להתחיל את תהליך הרכישה.
  8. הפעל את רכישת הבסיס של שניהם EYFP-פרקין ו אות ניאון DsRed2-מיטו איסוף תמונות כל 5 דקות למשך פרק כולל של 15 דקות.
  9. הכן מראש חמם בינוני הדמיה לחיות עם ריכוז של FCCP פעמים גבוה יותר ריכוז העבודה הסופי (0.1 - 10 מיקרומטר, סוג תלוי תא).
  10. להפריע לתהליך הרכישה ולהוסיף בעדינות 1 מ"ל של מדיום הדמיה לחיות מחומם מראש עם FCCP לתוך צלחת בתוך החדר מיקרוסקופ של באמצעות pipet P1000.
  11. הפעל מחדש את תהליך הרכישה כפי שתואר לעיל, לתקופה כוללת של 3 שעות, באמצעות העמדה המוקלטת. שמור את כל התמונות רכשו על מנת לנתח אותם וליצור וידאו של תהליך mitophagic כאשר הרכישה היא מעל.

.3 ניתוח

  1. לאסוף את כל התמונות שנרכשו בפורמט ".tiff" במחשב אישי
  2. פתח את התמונות עם גרפיקה רכהכלי ולהגדיר את המרווח הזמני להתרחש החל-שלילת קוטביות מושרה המיטוכונדריה עם FCCP אל התמונה הראשונה מראה את הגיוס של פרקין לתוך קרום המיטוכונדריה (תמונות נרכשות כל 5 דקות). חזור על ניתוח זה עבור כל תא בקבוצת הניסוי.
  3. לייבל התא הראשון של הטור על גיליון אלקטרוני עם שם קבוצת הניסוי. עבור כל קבוצת ניסוי, למדוד את המרווחים הזמניים לגיוס פרקין של מינימום של 10 תאים. תן הממוצע של מרווחי הזמני מחושב לגיוס פרקין ולהגדיר את סטיית התקן עבור כל קבוצת הניסוי (ממוצע ± סטיית תקן, N = 10).
    1. ארגן לעמודות מרווחי הזמני המחושבת היחידה. כל עמודה מכילה את n = 10 מדידות של קבוצת הניסוי.
    2. בחר את פונקציית "הממוצע" מהתפריט פורמולה בונה. בחר את הנתונים בעמודה. בחר את פונקציית "סטיית תקן" מהתפריט פורמולה בונה. Sele גודלct הנתונים בעמודה.
  4. באמצעות גישה סטטיסטית, להשוות את קבוצות ניסוי היישום הנתון המתאימים על מנת להגדיר הבדל משמעותי בדינמיקה של mitophagy בין קבוצות ניסוי. (למשל, שתי קבוצות = של סטודנטים מבחן t, שלוש או יותר קבוצות = ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בזאת, אנו מראים כיצד מיקרוסקופיה וידאו זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחרי האירועים המולקולריים של חלבונים fluorescently-tagged בתא בודד. תוצאות הנציג גם להראות כיצד טכניקה זו מאפשרת לרכישת תמונות באיכות גבוהה. כאשר תמונות של תהליך מולקולארי, מתקבלים, יש לנו הזדמנות לנתח אותם בדרכים שונות. כאן, אנו מנתחים את מרווח הזמן בין תחילת תהליך mitophagy המושרה, המהווה את תהליך מולקולארי חיוני לשמור על הומאוסטזיס הסלולר סלקט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זמן לשגות מיקרוסקופי יכול להיות מוגדר כ הטכניקה המשתרע הדמית תא חי מתוך התבוננות יחידה בזמן כדי התצפית של דינמיקה הסלולר על פני תקופות זמן ארוכות. מתודולוגיה זו להבדיל confocal פשוטה או במיקרוסקופ תא החי משום שהוא מאפשר לצופה לזהות בזמן אמת חלבון יחיד ניאון מתויג אחרי הדינמי שלה בתוך תא חי בודד. למעשה, מיקרוסקופיה confocal יכולה בקלות מזהה חלבונים שכותרתו חיסוניים באמצעות נוגדן פלורסנט, אך היא אינה מאפשרת התבוננות התא והאירוע המולקולרי החייה בסביבה שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 ל-R.G.P.), מענק הליבה של מרכז הסרטן של מרכז הסרטן של קימל NIH P30CA056036 (R.G.P.), מענק מהקרן לחקר סרטן השד, מענקים נדיבים מקרן המחקר הרפואי של ד"ר ראלף ומריאן סי פאלק (R.G.P.) ומענק ממשרד הבריאות של פנסילבניה (R.G.P). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של הקרן האמריקאית האיטלקית לסרטן (G.D.) ומשאב משותף להדמיה ביולוגית של מרכז הסרטן סידני קימל (NCI 5, P30, CA-56036). המחלקה מתנערת באופן ספציפי מאחריות לניתוח, פרשנויות או מסקנות. אין ניגודי אינטרסים הקשורים לכתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMCorning Life Science10-013-CVטרום חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש
DMEM ללא פנולCorning Life Science17-205-CVטרם חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש
סרום בקר עובריSigma-AldrichF2442טרם חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש
L-גלוטמיןGibco25030יש לחמם מראש ב-37 ° C לפני השימוש
פניצילין/סטרפטומיציןCorning Life Science30-002-CIטרום חימום ב-37 ° C לפני השימוש
וקטור ביטוי EYFP-PARKINAddgene23955
pDsRed2-Mito וקטור ביטויClontech632421
Nucleofector 2B מכשירLONZAAAD-1001S
נוקלאופקטור לערכה R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M מיקרוסקופ הפוךCARL ZEISS
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)-פנילהידרזון (FCCP)סיגמא-אולדריץ'C2920
MetaMorphמכשירים מולקולרייםבונה
ImageJבונהשל המכון הלאומי לבריאות
ניסויים ניסויים

מקורות

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FCCP
זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.