הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

4 בינואר 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקר דינמיקת חומצות המרה בתאים חיים באמצעות חיישן BAS FRET מקודד גנטית. חיישן חומצת מרה זה מייצג כלי ייחודי לחקר (ויסות של) הובלת חומצת מרה והפעלת FXR במגוון רחב של סוגי תאים.

תקציר

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) הפך לכלי רב עוצמה לניטור קיפול חלבונים, אינטראקציה ולוקליזציה בתאים בודדים. חיישנים ביולוגיים המסתמכים על עקרון ה-FRET אפשרו הדמיה בזמן אמת של אירועי איתות תת-תאיים בתאים חיים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה. כאן, אנו מתארים את היישום של חיישן חומצת מרה מקודד גנטית (BAS) המורכב משני פלואורופורים המאוחים לתחום הקישור של ליגנד קולטן X פרנזואיד (FXR-LBD), ובכך יוצרים חיישן חומצת מרה שניתן להפעיל על ידי מספר רב של מיני חומצות מרה וליגנדים FXR (סינתטיים) אחרים. חיישן זה יכול להיות ממוקד לתאים תאיים שונים כולל הגרעין (NucleoBAS) והציטוזול (CytoBAS) כדי למדוד ריכוזי חומצות מרה באופן מקומי. הוא מאפשר כימות מהיר ופשוט של זרם חומצות מרה תאי, פליטה והפצה תת-תאית של חומצות מרה אנדוגניות ללא צורך בתיוג עם תגים פלואורסצנטיים או גרעיני רדיו. יתר על כן, חיישני BAS FRET יכולים להיות שימושיים עבור ניטור קשירת ליגנד FXR. לבסוף, אנו מראים שניתן לשלב את החיישן הביולוגי FRET הזה עם הדמיה של פלואורופורים אחרים מובחנים ספקטרלית. זה מאפשר ניתוח משולב של דינמיקת חומצות מרה תוך תאיות ו-i) לוקליזציה ו/או שפע של חלבונים מעניינים, או ii) איתות תוך תאי בתא בודד.

מבוא

העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא בשימוש נרחב כדי להשיג הבנה טובה יותר של תפקודים תאיים בתאים חיים עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה 1. בסריג, אנרגיה מfluorophore תורם נרגש מועברת לfluorophore acceptor. סריג יעילות הוא תלוי מאוד על המרחק בין התורם fluorophore acceptor והאוריינטציה שלהם, ולכן קריאת נתונים רגישות של שינויי קונפורמציה המשפיעים על שני fluorophores. תופעה זו מנוצלת ליצירת חיישנים מבוססי סריג להדמיה של מולקולות קטנות. שינויים בריכוזם יכולים להיות במעקב עם עלייה / ירידה בשיעור של עוצמת פליטה של acceptor לעומת fluorophore התורם 2. לדוגמא, חיישני סידן מבוססי סריג מאפשרים זיהוי מהיר ויציב של ריכוזי סידן חופשיים בתאים חיים 3. יתרונות אחרים של חיישנים מבוססי סריג הם הדמיה בתאי חיים יחידים, לאיורש אינה הפולשנות, היכולת שלהם להיות ממוקד לסוגי תאים שונים ותאים סלולריים 4.

היבטים של דינמיקה של חומצות מרה תאיים רבים עדיין הם הבינו היטב. לדוגמא, מעט מאוד ידוע על בסיס תקנת המנגנון של תחבורת חומצות מרה מצומדות וunconjugated. קיימים טכניקות כדי לפקח על תחבורה זה בעיקר לעשות שימוש בכתבים מבוסס לוציפראז, חומצות מרה רדיואקטיבי, או אנלוגים של חומצות מרה ניאון. האחרון דורש שינוי של חומצות מרה, אולי משפיע על תכונותיהם. יש עיתונאים המבוסס על לוציפראז רזולוציה זמן עני. חוץ מזה, בטכניקות אלה לגרום לאובדן של המדגם ואינם ישימים להדמיה בתאים בודדים. לכן, זה יהיה מועיל להשתמש בשיטות המאפשרות הדמיה תא בודדת חי של פעילות תחבורה באמצעות חיישני סריג, במיוחד משום שהיא כוללת את היתרון של זיהוי 5 ratiometric, 6. בעוד גרסאות של CFP / טופס YFP הנפוץ ביותר בשימוש זוגות סריג, אסטרטגיות חדשות באמצעות Morange וmCherry נושא מוטציות עמותה עצמית-התרמה הובילה להרחבת ארגז הכלים סריג עם חיישני רומן, כוללים חיישן חומצות מרה אדום העביר 7.

יצרנו חיישן גנטי מקודד סריג מרה חומצה (BAS), שמורכב מfluorophore תורם (תכלת) וfluorophore acceptor (סיטרין) שהתמזגו עם תחום קולט X farnesoid (FXR) יגנד מחייב בעבר (FXR-LBD) ופפטיד המכיל מוטיב LXXLL 8. מקורבים זה פפטיד עם FXR-LBD באופן חומצה תלויה מרה. עם הפעלת FXR, המרחק בין סיטרין והתכלת ישנה עקב שינוי קונפורמציה. בשורות תאי יונקים, תוצאות FXR הפעלה בעלייה להבחין בבירור בסיטרין / היחס תכלת, בעוד החיישן המטוהר עובד בכיוון ההפוך וגורם ליחס סריג ירד על הפעלת FXR. חיישן זה (CytoBAS)מאפשר ניטור של דינמיקה של חומצות מרה cytosolic. על ידי תוספת carboxyl הטרמינל של מוטיבים מיקוד subcellular, מבנה BAS יכול להיות ממוקד לגרעין (NucleoBAS) וperoxisomes (PeroxiBAS), המאפשר מדידות של ריכוזי חומצות מרה בתאים סלולריים שונים. למרות התוספת של מוטיב מיקוד peroxisomal אינה פוגעת היענותה לחומצות מרה, FXR-ligands החדיר תאים לא לגרום לכל סריג שינויים של PeroxiBAS בתוך peroxisomes 8. כטבעו של פער זה אינו ידוע, הפרוטוקול להלן מתמקד בCytoBAS וNucleoBAS.

השימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה הודגם לאחרונה בתאים המכילים את מובילי כבד חומצות מרה Na פוליפפטיד שיתוף הובלה / taurocholate + (NTCP) ואלפא טרנספורטר המומס אורגני / בטא (OSTαβ) 8. NTCP היא היבואנית של חומצת מרה בכבד הקרן וOSTαβ הוא מרה מעיים basolateralטרנספורטר חומצה שיכול לתפקד גם כיבואן ויצואן תלוי בשיפוע של החומצות מרה אלקטרוכימיים הריכוז 9, 10. נתונים אחרונים הראו כי על תחבורת חומצות מרה על ידי NTCP ו / או OSTαβ, ניתן לצפות תגובות חזקות ומהירה ביחס סריג כתוצאה מאינטראקצית יגנד-FXR-LBD.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשיטות למדידת סריג כגון ניתוח confocal מיקרוסקופי ותא מופעל הקרינה מיון (FACS), לסמן את השלבים קריטיים, לטפל בבעיות פוטנציאליות ולדון שיטות חלופיות. שימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה, אינטראקציה עם חומצות מרה FXR-LBD ניתן לכמת ופיקוח ישיר בתאים חיים ומספקת שיטה מהירה ופשוטה של ​​הדמיה תחבורת חומצות מרה ודינמיקה בזמן אמת. פלסמידים ביטוי יונקים קידוד CytoBAS וNucleoBAS זמינים מסחרי. לכן, biosensor זה יכול עוד לתרום להבנה של מובילי חומצות מרה או תרכובות המפעילות FXR ולספק הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של חומצות מרה ואיתות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. חלוף Transfection

הערה: CytoBAS וNucleoBAS (אנא ראה לוח חומרים) משמשים בהצלחה בכמה סוגי תאים, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ותאי HEK293T). הדרישה העיקרית לשימוש בחיישן היא שזה צריך לבוא לידי ביטוי, המחייב את ה- DNA הקידוד להיכנס לתא.

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל תאים במדיום התרבות השלם מתאימים לשורת התאים הספציפית (10% FBS, 1% L- גלוטמין, עט% 1 / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7).
  2. תאי פלייט בצפיפות הרצויה לתוך כוס סטרילית 8 לתאים גם כיסוי (0.8 סנטימטר 2). לשאוף תת-מחוברות (60-80% confluency) שכבה של תאים ביום של הניסוי, אם כי זה לא הכרחי.
  3. הוסף בינוני תרבות השלמה לנפח סופי של 400 μl בכל טוב. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  4. מכין את תערובת transfection בצינור סטרילי על ידי הוספת 0.5 מיקרוגרם של NucleoBASאו DNA CytoBAS לשל מדיום תרבות 100 μl (אנטיביוטיקה סרום / חופשי). מערבולת היטב. הוסף מגיב transfection ומערבבים על ידי vortexing. ריאגנטים transfection שנותנים יעילות אופטימלית הם סוג תא תלויים ועשויים לדרוש בדיקה קודמת.
    1. לדוגמא, השתמש 2.5 μl של polyethylenimine 1 מ"ג / מיליליטר (PEI) והדגירה DNA / PEI לערבב במשך 15 דקות ב RT.
  5. מוסיף את תערובת transfection בטיפות לתאים ומערבבים בעדינות על ידי טלטול הצלחת גם ביד. להוסיף לתערובת 100 μl לטוב של ~ 9.6 סנטימטר 2. השתמש 10 μl של תערובת transfection לתאי הדמיה פרט לתאי transfected זמני.
    הערה: לאחר 24-48 שעות, תאים יבטאו את החיישן של החומצות מרה ויכולים לשמש לניסויים.

2. Transfection יציב

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל גלולה במדיום התרבות השלם מתאים לשורת התאים הספציפית (10% שור S העובריerum, 1% L- גלוטמין, עט% 1 / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7) לריכוז של 150,000 תאים לכל מיליליטר ולהוסיף סביב 300,000 תאים לכל גם בצלחת 6-גם תרבות (2 מיליליטר סוף נפח).
  2. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  3. מכין את תערובת transfection בצינור סטרילי על ידי הוספת 0.5 מיקרוגרם של CytoBAS או NucleoBAS DNA (אנא ראה לוח חומרים) לשל מדיום תרבות 100 μl (סרום / אנטיביוטיקה ללא). מערבולת היטב. הוסף מגיב transfection ומערבבים על ידי vortexing.
    1. לדוגמא, השתמש 2.5 μl של polyethylenimine 1 מ"ג / מיליליטר (PEI) והדגירה DNA / PEI לערבב במשך 15 דקות ב RT.
  4. להוסיף לתערובת transfection בטיפות לתאים 100 μl ומערבבים בעדינות על ידי טלטול הצלחת גם ביד. תמיד כולל שליטת untransfected בעת יצירת שורת תאים יציבה.
  5. לגדל תאי O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  6. Trypsinize תאים על פי הפרוטוקול של היצרן (דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס wה- i מיליליטר 1.5 prewarmed טריפסין לכל 25 תרבית תאים 2 סנטימטר) ולסובב אותם ב 250 XG ב RT במשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב -13 מיליליטר של מדיום תרבות השלם. לחלק תאים על פני תרבות מנות קוטר 10 סנטימטרים שונות: 0.5 מיליליטר (צפיפות נמוכה), 1.5 מיליליטר (צפיפות בינונית), ו -4.5 מיליליטר (צפיפות גבוהה). לעשות את אותו הדבר עבור נותר 6.5 מיליליטר.
  7. הוסף בינוני תרבות לנפח סופי של 10 מיליליטר. לU2OS תאים, השתמש 800 מיקרוגרם G418 / מיליליטר לפלסמידים עם קלטת התנגדות neomycin כגון CytoBAS וNucleoBAS בונה כדי לבחור עבור תאים חיוביים. ריכוזים זה סוג תא תלוי ויכולים להיקבע על ידי בחירת האנטיביוטיקה הנמוכה ביותר (G418) ריכוז שבו תאי untransfected מתו בתוך 2 עד 10 ימים (G418 800 מיקרוגרם / מיליליטר לתאי U2OS).
  8. רענן מדיום התרבות עם האנטיביוטיקה המתאים (G418) כל שעה 72 עד תאי untransfected מתים.
  9. לבחון את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X למושבות חיוביות (הקרינה ניתן לנטר באמצעות רוב מערכות סינון המשמשות לירוק, ציאן או הקרינה צהובה).
  10. סמן את המושבות החיוביות שתשקרנה מבודדים ממושבות אחרות עם עט בתחתית החיצונית של צלחת התרבות.
  11. לשטוף את הצלחת פעמיים עם בופר פוספט (PBS) ולשאוב אותו. קח כ -15 צילינדרי שיבוט סטרילי ולטבול אותם לסיליקון סטרילי. ליישם אותם סביב המושבות שנבחרו על ידי לחיצה קלה על צלחת פטרי, ולוודא שמושבה יותר מאחד לא כלולה בטבעת השיבוט.
  12. Pipet 20 μl של טריפסין מראש חימם (1x, 0.25%) בגליל השיבוט ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שרוב התאים המעוגלים כלפי מעלה (להתבונן במיקרוסקופ).
  13. להוסיף 150 μl של מדיום התרבות עם סרום והאנטיביוטיקה המתאימה (10% FBS וG418 / מיליליטר 800 מיקרוגרם לתאי U2OS וHuh7) בגליל השיבוט וpipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי resuspend התאים ולהעביר ל96גם צלחת. רענן בינוני לאחר 4-24 שעות ולאפשר לתאים לגדול ומחוברות בימים הקרובים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לתאי U2OS וHuh7).
  14. רענן בינוני עם אנטיביוטיקה כל 3 או 4 ימים. כאשר התאים גדלו ומחוברות, להעביר אותם לצלחת גם גדולה יותר. חזור על פעולה זו עד לתרבות היא גדולה מספיק לניסויים. Cryopreserve כמה בקבוקונים לגיבוי. מדיום הקפאה מורכב של 20% FBS וDMSO 20% בתקשורת (DMEM) ללא תוספים.
    הערה: עכשיו, שורת התאים היא חד שבטי ונחשבים יציב לביטוי חומצות מרה החיישן. מחצית ריכוז G418 האנטיביוטי (400 מיקרוגרם / מיליליטר) הוא החברה מספיק כדי לשמור על ביטוי בשורת התאים היציב.

3. lentiviral התמרה

הערה: שורות תאים מסוימות נחשבות קשה transfect על ידי שיטות מסורתיות יותר כגון polyethylenimine שיטה (PEI). התמרה ויראלית של תאים היא F כלי חלופי יעילאו גן-אספקה ​​וביטוי transgene יציב.

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל תאים במדיום התרבות השלם המתאימים לשורת התאים הספציפית (10% FBS, 1% L- גלוטמין, עט 1% / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7) ולהוסיף סביב 200,000 תאים לכל גם בצלחת תרבות 6 היטב.
  2. הוסף בינוני תרבות לנפח סופי של 2 מיליליטר לכל טוב. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  3. בצע transductions הנגיפי על ידי תאים דוגרים במשך שעות 4-6 עם 500 CytoBAS μl lentivirus מכיל בינוני (זמין לפי בקשה) המלא עד לסכום כולל של 1 מיליליטר עם מדיום תרבות שלם המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר diethylaminoethyl (DEAE) -dextran או lentiviral אחר משפר התמרה. אל תשכח לכלול גם עם תאי שליטת untransduced.
  4. הסר בינוני ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום תרבות השלם המכיל אנטיביוטיקה הרצויה (500 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin). השתמש במבנה lentiviral עבור התמרה CytoBAS המספקותשל hygromycin התנגדות לתאים. לגדל תאים בתנאים רצויים.
  5. רענן בינוני עם (hygromycin / מיליליטר 500 מיקרוגרם) אנטיביוטיקה כל 3 ימים ולפצל את התאים כאשר 80% ומחוברות, עד שכל תאי הבקרה השליליים מתים (לוקחת בערך 1-2 שבועות עבור רוב שורות תאים). שורת התאים נחשבת כיום יציבה לביטוי חומצות מרה החיישן.
    1. לחלופין, להשתמש בתאים לניסויים 1-3 ימים לאחר התמרה ויראלית. כנגיף חי עשוי להיות נוכח, זה דורש ציוד סריג-קריאת נתונים בחדרים עם רמת הבטיחות המתאימה.
  6. לחלופין, לבידוד מהיר של שורות תאי יציבות, לבצע תא הקרינה מיון מופעל (FACS).
    1. קציר תאים וממחוברות 160 סנטימטר 2 בקבוק.
    2. לדלל תאים במדיום תרבות ליבוביץ (L-15 בינוני) עם <סרום 5% לריכוז של 5 x 10 6 תאים מרביים לכל מיליליטר
    3. לאוסף של תאים ממוינים, למלא צינורות FACS עם 1 מיליליטר של מדיום אוסף (L-15 בינוני + 1.5% עט / סטרפטוקוקוס, 1% L-שפע וסרום 20%).
    4. תאי מיין לסיטרין (520-580 ננומטר) או תכלת (450-520 ננומטר), נרגשים עם 405 לייזר.
    5. לאחר המיון כ -500,000 תאים, ספין למטה תאים (5 דקות, 250 XG) וresuspend אותם 5 מיליליטר מדיום תרבות השלמה רגיל (10% FBS, 250 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin לתאי U2OS וHuh7 CytoBAS) וצלחת אותם בתרבות T25 בַּקבּוּק. לגדל תאים בתנאים רצויים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לתאי U2OS וHuh7).

4. הדמיה של תא חי חומצות מרה החיישן

הערה: תאים המכילים מובילי חומצות מרה יכולים להיות מתורבתים במדיום עם סרום-מסונן פחם 1-10% שמסיר תרכובות lipophilic. סרום נורמלי לעתים קרובות מכיל חומצות מרה שעלולות להוביל להצטברות תאית חומצות מרה ורוויה של חומצות מרה החיישן.

  1. מדידות סריג באמצעות מיקרוסקופ confocal
    1. צלחת התאים ביציבות או transiently מבטא את החיישן בצפיפות הרצויה לתא שקופיות coverslip תחתית 8 גם סטרילי (0.8 סנטימטר 2). לגדל תאים במדיום התרבות שלם (תוך שימוש בסרום-מסונן פחם), כך שביום של הניסוי, confluency הוא סביב 60-70%.
    2. לשטוף את התאים חסיד בתא שקופית אחת עם 200 μl 1x של PBS או ליבוביץ L-15 בינוני תרבות.
    3. לשאוב ולהחליף עם 300 μl L-15 בינוני התרבות של ליבוביץ, כך שאף CO 2 שליטה היא צורך.
      הערה: DMEM ללא פנול אדום יכול לשמש גם אבל דורש CO 2 תנאים שנאגרו. מופעי חיישן חומצות מרה (חלק) pH-רגישות כל כך שואפים לשמור קבוע pH במהלך איסוף הנתונים.
    4. לדלל את התרכובות לשימוש בניסוי ההדמיה confocal גם בL-15 בינוני תרבות. קח בחשבון כי במהלך הדמיה, כמויות גדולות יחסית של נוזל בתאים שתתווספנה להבטחת ערבוב מהיר של המדגם (50-100 μl),כך להפוך את פתרונות 3-5x.
    5. הפעל את תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופ confocal עם תא דגירה 37 ° C ולהפעיל את לייזר ננומטר הסגול 405. לשים טיפה של שמן טבילה על המטרה ומקום 8-קאמרי על גבי זה. עבור הדמיה תא בודדת של סריג, השתמש במטרת שמן 63X. החיישן שמש בהצלחה ב RT, אבל התנהגות תא עשויה להשתנות.
    6. הגדר את ההגדרות של מיקרוסקופ confocal כראוי.
      1. מצב להגדיר רכישה: xyt (זמן לשגות הדמיה של מטוס מוקד יחיד).
      2. לרכוש תמונות במרווחי זמן של 20 שניות כדי לאפשר תרכובות שיתווספו בין רכישות ללא הפסקת הניסוי.
      3. מגוון להגדיר רפאים לגילוי פליטה: Cerulean: 450-520 ננומטר; סיטרין: 520-580 ננומטר.
    7. להתמקד בשכבת התא בודדת באמצעות שקוף אור. התחל הדמיה ולהתאים את Z-העמדה מדויקת יותר. התאם רווח וקוזז לכל ערוץ להבחין אות מהרקע בזמן שיישארing הרבה מתחת רוויה לכל הפיקסלים בתאים של עניין.
    8. לצייר עיגולים להגדיר את האזור של העניין (ROI). בחר תאים המראים את עוצמת הקרינה דומה. הימנע תאים שכמובן שונה מהתא הממוצע בגודל ובצורה. לחשוף את התאים לאור במשך זמן קצר ככל האפשר כדי למזער photobleaching של החיישן. מומלץ לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא. אזור זה הוא הרגיש ביותר לשינויים בעוצמת הקרינה עקב סחיפת מוקד (תאים הנעים בZ-כיוון) ולכן קשה יותר לעקוב אחר שינויים ביחס הקרינה במהלך הניסוי.
    9. התחל מדידות עם מיקרוסקופ confocal. חכה עד שהקרינה התכלת וסיטרין היא יציבה.
    10. להוסיף 50-100 חומצות μl מרה או תרכובות אחרות בנקודות זמן שנבחרו במהלך מדידה. הכמויות גבוהות היחסי של נוזל (חמישית לשליש מהנפח הסופי) נחוצות כדי לערבב את הנוזלים היטב (תוך 10 שניות) בלי ללחוץ / pipetting למעלה ולמטה. ודא שלא לגעת בקצה של חדר 8-גם עם קצה פיפטה ולהוסיף את הנוזל לאט כדי שהתאים לא מקבלים מחוץ לפוקוס. אל תוסיף תרכובות חדשות לפני שמגיע שלב הרמה. זה לוקח בערך 200 שניות.
    11. בסופו של כל ניסוי עם התוספת של 100 μl GW4064, ריכוז סוף 5-10 מיקרומטר (מינון להרוות חיישן) ולחכות עד שקרינת חיישן היא יציבה.
    12. שמור את הניסוי ולייצא את הנתונים כקובץ .AVI.
    13. פתוח בImageJ שני קבצי AVI (ערוץ 00, תכלת; ערוץ 01, סיטרין) על ידי בחירת interleaver התוספים> סטאקס> סטאק. לחלופין, קובץ confocal יבוא (למשל, .lsm או קבצי .lif) ישירות בתמונה J באמצעות תוספים מתאימים (זמינים בhttp://www.openmicroscopy.org) ולעבור לשלב 4.1.14.
      1. ל1 מחסנית: להשתמש בערוץ 01 (סיטרין).
      2. לסטאק 2: להשתמש בערוץ 00 (תכלת).
    14. לחץ על Edit> בחירה> הוסףלמנהל, כדי לפתוח את חלון מנהל החזר על השקעה. סמן את התיבה 'הצג הכל'.
    15. לצייר כמה אזורים של עניין (ROIs) מכסים תאים ספציפיים עם כלי בחירה הסגלגלים. גם לצייר מעגל אחד באזור שמחוץ לתאים או בתוך תא שאינו מבטא את החיישן כדי לקבוע את אות הרקע. מומלץ לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא בניסויים כאשר שינויים בעוצמת הקרינה עקב סחיפת מוקד (תאים הנעים בZ-כיוון) או נדידת תאים היו ברורים.
    16. בחר תא אחד. לחץ על התוספים> Profiler יחס. זה יגרום 3 מסכי: RAW, יחס וRatio_Profile. חלון RAW מציג את העלייה בעוצמת סיטרין (קו כחול) וירידה בתכלת (קו אדום) אם יש סריג. חלון היחס נותן מידע על סיטרין היחס / התכלת, שיגדל עם עלייה בסריג. חלון Ratio_Profile נותן מספרים האמיתיים של עוצמת הקרינה שנמדדה בשני הערוצים. אם מיקרולהתמודד קבצי התקנה ספציפית (למשל, .lsm או .lif במקום .אבי) קבצים נמצאים בשימוש על מנת הערוץ עשוי להיות הפוכים.
    17. להעתיק את הנתונים מחלון Ratio_Profile בגיליון האלקטרוני המצורפים כנתונים משלימים. לעשות את אותו הדבר לכל תאים אחרים (והחזר על ההשקעה ברקע).
      הערה: בגיליון האלקטרוני המקוון, כל הנתונים הוא מנורמלים למצב שבו הפעלת BAS המרבי צפויה. בהתחשב בכך שGW4064 הוא activator החזק ביותר של FXR, יחס הקרינה לאחר דגירה עם עודף של GW4064 מוגדר 1. לכן חשוב לסיים את כל הניסויים עם תוספת של GW4064. היתרון של זה הוא שהנתונים הוא כבר לא תלויים בעוצמת לייזר או רווח גלאי וניסויים בימים שונים ניתן להשוות בקלות רבה יותר. יתר על כן, בגרף התחתון של הגיליון האלקטרוני, ממוצע פועל ניתן להשתמש כדי להחליק את הקימורים לרעש ניסיוני. עם זאת, אין להשתמש בגרף הזה בעת ניתוח הנתונים הקינטית, מאז avera פועלגם GE יהיה תגובות הקינטית מהירות חלקות.
  2. מדידות סריג באמצעות Cell הקרינה המופעל מיון (FACS)
    1. לדלל את כל התרכובות לניסוי FACS חיץ FACS סטרילי ספיגה (0.3 מ"מ EDTA, BSA 0.5%, 0.01% NaN 3 ו -10 מ"מ D-גלוקוז).
    2. קציר תאים מסנטימטר 2 בקבוק תרבות תא 80% ומחוברות T-160 באמצעות 5 מ"מ EDTA ב PBS. תאי צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות. 2x תא גלולה לשטוף במאגר ספיגת 5 מיליליטר FACS ב RT.
    3. ספירת תאים באמצעות דלפק קולטר או חדר ספירה.
    4. לדלל גלולה במאגר ספיגת FACS לריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. פיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה הומוגנית של תאים בודדים. אם תאים קשים משורש, לשים את הדגימות דרך מסננת תא לפני המיון כדי למזער קבקבי זרבובית.
    5. Pipet 200 תאי μl לכל צינור FACS ולהגן עליהם מפני אור.
    6. הוסף את הריכוז הרצוי של המתחם (למשל, חומצות מרה, ligands FXR הסינתטי, מעכבי טרנספורטר). מְעַרבּוֹלֶת. דגירה של 20-30 דקות ב RT בזמן הטלטול (בחושך).
    7. בינתיים, להתחיל FACS (הלייזרים זקוקים לזמן כדי להתחמם).
    8. הגדר את הזרימה cytometry הפרמטרים gating לניסוי (ראה איור 3):
      1. לטעון סביב 100,000-200,000 NucleoBAS או CytoBAS transfected תאים כדי לקבוע את השערים.
      2. להתאים את מתחי FSC וSSC ראשון לתכנן את התאים במרכז העלילה.
      3. השימוש בליזר הסגול, להתאים את התכלת (450/40 ננומטר) ערך מתח וסיטרין (525/20 ננומטר) מתח ולהבטיח שהתאים חיוביים כל NucleoBAS או CytoBAS הם זממו בתוך עלילת הפיזור.
      4. הגדר את השערים הנכונים (שער P1 עד השער P4), ראה איור 4.
        1. השתמש P1 שער שלא לכלול תאים מתים, בדרך כלל מוצגים בפינה השמאלית התחתונה על ידי בחירת האוכלוסייה העיקרית באמצע SSC-/ FSC-העלילה.
        2. להשתמש P2 שער בFSC-H / FSC-חלון כדי להסיר duplets מניתוח. תאים בודדים מוצגים בקו אלכסוני יותר מ כפילויות.
        3. שער P3 בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון יכול לשמש כדי לבחור לNucleoBAS / CytoBAS תאים חיוביים, על ידי gating סיטרין ותאים גבוהים תכלת, אוכלוסייה מוצג באלכסון בפינה הימנית העליונה של העלילה.
        4. לצייר P4 שער בפינה השמאלית העליונה של האוכלוסייה, הקרובה ככל האפשר ולוודא שלא יותר מ 5% מהתאים ליפול בתוך השער הזה.
      5. לטעון כמה תאי untransfected (אין ביטוי לCytoBAS או NucleoBAS) כדי לקבוע אוטומטי הקרינה. אוכלוסיית untransfected לא יכולה להיות ממוקמת בP3 שער. התאם P3 שער בעת צורך להוציא תאים אוטומטיים ניאון.
    9. מערבולת הדגימות לפני הנחת הצינורות בFACS. עבור כל דגימה, למדוד לפחות 10,000 תאים בP3 שער.
      הערה: אוכלוסיית היררכית החלון נותן את המספר של אירועיםמוצג עבור כל שער ו% מהשער ההורה. בשער 4,% של ההורה קובע תאים עם סיטרין / יחס תכלת גדל כאחוז מכל NucleoBAS תאים חיוביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חיישן סריג-BAS מוצג מבוסס על יגנד המחייב תחום של FXR (LBD-FXR) מחובר לשני fluorophores סיטרין ותכלת) ומוטיב LXXLL. חיישן זה מאפשר חקירות תחבורת חומצות מרה בתאים חיים עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה (איור 1). מוטציות בתכלת וסיטרין יושמו כדי לקדם את הקמתו של מתחם intramolecular (איור 1 B). חומצות מרה וligands FXR האחר להיקשר לFXR ובכך לשנות את המרחק בין סיטרין ותכלת על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בחיישן של חומצות מרה רומן מקודדים גנטי מסוגל ניטור דינמיקת spatiotemporal תחבורת חומצות מרה בתאים חיים. biosensor זה מורכב מחלבוני ניאון תכלת וסיטרין שהם התמזגו לFXR-LBD, וכך יוצרים חיישן מבוסס סריג חומצות מרה (BAS).

חומצות מרה החיישן הוא יחסית פשוט ונוח בשימוש בעת צורך ניסיון בסיסי עם תרבות תא וFACS או במיקרוסקופ (confocal). עם זאת, כמה היבטים עשויים לדרוש קצת ירי צרות. בעת ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי התחלה של ERC (ERC-2011-StG 280255 ו-ERC-2013-StG 337479) ועל ידי הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות (Vidi 91713319).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציטובאס Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
Dulbecco Modified Eagles Media (DMEM)LonzaBE12-614Fגלוקוז גבוה ללא L-גלוטמין
פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין)Lonza17-602E
L-גלוטמין (200 מ"מ)Lonza17-605E
סרום בקר עוברי (FBS)Invitrogen102-70
טריפסין-EDTA (פי 10)LonzaCC-5012
T-25 בקבוק תרבית תאיםVWR בינלאומי392-0253למינין מצופה
T-175 בקבוק תרבית תאיםVWR בינלאומי392-0238למינין מצופה
צלחת 6 בארותVWR international734-0229פולי-L-ליזין ולמינין מצופה
10 ס"מ צלחתVWR בינלאומית392-0243למינין מצופה
דיאתילאמינואתיל (DEAE) - דקסטרןסיגמא-אולדריץ'D9885
פוליאתילנימין (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (גנטיצין) 50 מ"ג/מ"לInvitrogen10131-027
Hygromycin B, 50 מ"ג/מ"לInvitrogen10687-010
גליל שיבוט (6 x 8 מ"מ)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz תרבית בינוניתInvitrogen21083-027ללא פנול אדום
פוליסטירן צינור תחתון עגול (5 מ"ל) צינור FacsFalcon BD352008ללא מכסה, לא סטרילי
Falcon 2,063 שפופרות (5 מ"ל)Falcon BD352063מכסה הצמד, סטרילי
Nunc Lab-Tek 8 באר כיסוי זכוכיתתרמו מדעי155409
סטרילי מסוננת פחם FBSLife technologies12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCAסיגמא-אולדריץ'T6260
CDCAסיגמא-אולדריץ'C9377
כימיקלים אחריםסיגמא-אולדריץ'נ.ו.ט.

מקורות

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימוי FRETחיישן מקודד גנטיתקישור ליגנד ל-FXRמיקרוסקופיה קונפוקליתדימוי תאים חייםCerulean Citrine FRETלוקליזציה תת-תאיתהובלת חומצות מרה
ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.