מאמר שיטה

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

במאמר זה

סיכום

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מדווחים על שיטה מעשית של פרוטוקול תרבות astrocyte בהיפוקמפוס חרמנית על מנת ללמוד את המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד astrocyte גורים הילוד זכר ונקבה לאחר חוץ גופית איסכמיה.

תקציר

Astrogliosis הבא היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה מוחית -related ממלא תפקיד בתחלואה ותמותה מוגברות בילודים. מחקרים קליניים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית להיראות מין תלותי, וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של פגיעה מוחית הקשורה HI, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נשים עם ניזק מוחי דומה. פיתוח שיטות אמינות לבודד ולשמור אוכלוסיות מועשרות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ליצירת תרבויות astrocyte מסוימת בהיפוקמפוס מין כי הם נתון מודל של איסכמיה חוץ גופית, מניעת גלוקוז חמצן, ואחריו reoxygenation. astrogliosis תגובתי לאחר נבדק על ידי immunostaiנינג עבור חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) ו S100B. שיטה זו מספקת כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של זכר האסטרוציטים בהיפוקמפוס הנקבה הבא HI בילוד, בנפרד.

מבוא

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). הגוף של ראיות הולכות ומצטברות עולה כי התפקידים של האסטרוציטים הם יותר מאשר לספק תמיכה העצבית. למעשה, את התפקידים של האסטרוציטים בתנאים פיסיולוגיים יכול להיות מאוד מורכב, כמו הדרכת הגירה של אקסונים פיתוח 1, ויסות זרימת הדם CNS 2, שמירה על הומאוסטזיס pH של נוזל ביניים הסינפטי 3, והשתתפות מחסום דם מוח 4 ו -5 בשידור סינפטי. בתנאים פתולוגיים, האסטרוציטים להגיב על פשע עם תהליך הנקרא astrogliosis תגובתי שבו מורפולוגיה, מספר, מיקום, טופוגרפיה (ביחס המרחק בין עלבון) ותפקוד של האסטרוציטים עשויה להשתנות בצורה הטרוגנית 6,7. Astrogliosis לראות הבאים אנצפלופתיה איסכמית בילוד היפוקסי אולי תורם תחלואה ותמותה של ילודים 8.

מחקרים קליניים וניסויים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית שנראית מין תלוי וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה המוחית -related, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נקבות עם נזק מוחי דומה 9-11. למרות הלוקליזציה של הפגיעה תלוי גיל ההריון ואת המשך וחומרת העלבון, ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים שיבוצעו הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית לאחר תקופת הכהונה בילוד HI, וגדילת astrogliosis בהיפוקמפוס אושר על ידי עד-רגולציה של חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) 3 ד לאחר HI בילוד 7,10,12,13. הבדלים בין מינים בתפקוד astrocyte הוצגו בשני בילודים ומכרסמים מבוגרים לאחר איסכמיה מוחית 14,15. בנוסף, הרגישות astrocytic זכר לאיסכמיה חוץ גופית הוצגה על ידי cel גדלl למוות בהשוואה האסטרוציטים קליפת המוח הנשי בתרבות 16.

ההבדלים בין המינים להתחיל ב-ברחם ולהמשיך עד מוות 17. בעשור האחרון, את החשיבות של כולל המינים בתנאי ניסוי בתרבות התא ב- vivo מחקרים כבר הדגש של המכון לרפואה NIH לחפש ידע בסיסי ב ההבדלים בין המינים לראות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 17,18 . פיתוח שיטות אמינות לבודדים ולשמור אוכלוסיות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. המחקר הנוכחי נועד לספק את הטכניקות להכין תרבויות astrocyte מועשר מין ספציפי בהיפוקמפוס מעכברים היילוד על מנת להעריך את התפקידים של האסטרוציטים GFAP-immunoreactive הבאים חמצן / מניעת גלוקוז (OGD) ו reoxygenation (REOX), גרימתHI בסביבת תרבית תאים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון כל שערה נוגע האסטרוציטים בהיפוקמפוס אצל זכרים ונקבות בילוד בתנאי normoxic ו איסכמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: המחקר נערך בהתאם להמלצת המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש. פרוטוקול תרבות astrocyte ראשי המוצג כאן היא אמץ הפרוטוקולים שהוצגו על ידי ג'אנג Y 19 et al. ו ג'נגיס P 20 et al. עם כמה שינויים.

1. בהיפוקמפוס Dissection ו astrocyte תרבות

  1. יש להכין את כל ריאגנטים החומרים הדרושים כולל מספריים כירורגיות, מלקחיים בסדר חלקה, מלקחיים קצה שטוח, מגבות נייר, שקית פסולת, אתנול 70% ו -2 מנות לנתח (קוטר 3.5 ס"מ) על קרח מלא עם 2 תמיסת מלח מאוזן של מ"ל האנק (HBSS) כל . ודא של ציוד הכירורגים הם סטריליים (חיטוי) לפני ההליך ולהשתמש בכל חומר אחר (astrocyte ציפוי בינוני: DMEM + 5% סוס סרום +1% פניצילין, סטרפטומיצין, סוס בסרום, HBSS, 0.25% טריפסין, coverslips זכוכית, צלחות פטרי, 15/50 צינורות מ"ל, צלוחיות T25, וכו ') כמו מראש סטרילית.
  2. צמד בעדינות ולרסס את הראש והצוואר של גור עכבר עם אתנול 70% ו לערוף באמצעות מספרי סטרילי חד [איור 1 (1)].
  3. בצע חתך קו אמצע מן אחורי אל קדמי גולגולת עם מספריים קטנים לאורך הקרקפת כדי לחשוף את המוח [איור 1 (2-3)].
  4. חותכים את הגולגולת בקפידה מהצוואר אל האף עם מספריים קטנים. ואז לחתוך קדמי גולגולת כדי נורה חוש הריח ונחות המוחון לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת.
  5. לעשות חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך לאורך קו האמצע. שימוש במלקחיים שטוח טיפ סטרילי לקלף את הגולגולת. סור גזע המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים. סר המוח של הגולגולת ומקום לתוך צלחת לנתח הראשונה [איור 1 (4-9)] 21.
  6. בעזרת מלקחיים מעוקל, להעיף את המוח כך את פני השטח הגחון של המוח הוא פונה כלפי מעלה ולאחר מכן נפרד בשתי ההמיספרות עם להב כירורגי סטרילי חד [איור 1 (10,11)]
  7. לקלף בחזרה את אונות מוח ובזהירות להסיר את רקמת המוח תיכונה ו התלמוס הבולטת עם מלקחיים שטוחים מעוקלים סטרילי לחשוף את ההיפוקמפוס, מבנה קטן, סוסון ים בצורה באונת הרקתית המדיאלי [איור 1 (12-14)].
  8. הסר את שתי האונות בהיפוקמפוס [איור 1 (15,16)] ובזהירות לנתח את קרומי המוח מן האונות ידי משיכת עם מלקחיים בסדר. צעד זה ימנע זיהום של התרבות astrocyte הסופית על ידי תאי קרום המוח ו פיברובלסטים.
  9. מעביר את האונות בהיפוקמפוס המוכנות לתוך התבשיל השני מלא HBSS ולהחזיר אותו על קרח [איור 1 (17,18)]. ברכה בשתי אונות בהיפוקמפוס מתוך עכבר אחת (P0 - P2) להכנת היפופוטםתרבויות astrocyte campal. זה נותן את הצפיפות הנכונה astrocyte. לרכך אונות בהיפוקמפוס באמצעות סכין כירורגית סטרילית חד (כ 4 פעמים).
  10. לשאוב HBSS מצלחת באמצעות קצה סטרילי מחוברת פיפטה 1 מ"ל ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.25%, לערבב, להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עם רעד עדין.
  11. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית מצורפת קו ריק. הוסף 10 מ"ל astrocyte ציפוי בינוני ו triturate (20 - 30 פעמים) באמצעות פיפטה מזכוכית אש מלוטש עד פיסות הרקמה homogenize.
  12. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי astrocyte prewarmed הטריה. Pass תאים דרך מסנן רשת 70 מיקרומטר (מסננת תא) לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטים חדש.
  13. פלייט ההשעיה התא כולו על בקבוקון Poly-D- ליזין / Laminin מצופה תרבות T25 סטרילי המכיל 3 מ"ל שלastrocyte ציפוי התקשורת, ואז דגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5%.
  14. לשאוב התקשורת כולה דיי אני n-גופית (DIV) 1, DIV 3 ו DIV 7, ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת ציפוי astrocyte טריים. שים את התקדמות מפגש astrocytic תחת מיקרוסקופ אור בכל פעם תוך החלפת מדיה ציפוי astrocyte.
    הערה: בשלב DIV 1, כל האסטרוציטים קיימא מחוברים אל פני השטח של הבקבוק התרבות תאים מתים או גוססים הכוללים נוירונים מרחפים supernatant. בשעה DIV 3, תאים המצורפת להתחיל לחלק ליצירת שכבת התאים astrocytic. בהעדר התנאים התומכים, התרבות היא כמעט נטולה כל צמיחה עצבית. בשעת DIV 7, שכבת astrocyte הם כ -80 - 90% ומחוברים וכמה microglia וכן תאי מבשר oligodendrocyte נמצאת על גבי שכבת astrocytic.
  15. לשאוב את המדיום ציפוי מהבקבוק, להוסיף 2 מ"ל של מדיום ציפוי astrocyte prewarmed טריים, ולשטוףnd להסיר שוב ב -11 DIV, כאשר האסטרוציטים הם ומחובר ומוכנים תת culturing.
  16. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25%, בעדינות לסובב את הבקבוק כמה פעמים טריפסין לשאוב באמצעות pipet זכוכית סטרילית.
  17. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% ולתת את הבקבוק לשבת למכסה המנוע בתרבית רקמה עבור 4 - 5 דקות ב RT.
  18. הסר את טריפסין ולשמור את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2 למשך 10 דקות. הוסף 5 מ"ל prewarmed astrocyte ציפוי בינוני ולנתק את שכבת astrocytic ידי הקשה על הבקבוק על כף היד שלך (3 - 4 פעמים) ואחריו טחינה דקה ועדינה להשיג ניתוק מוחלט לאסוף את האסטרוציטים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  19. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ולהוסיף 1 בינוני astrocyte ציפוי טרי מ"ל.
  20. הוסף 10 μL של השעית תא hemocytometer ולספור את התאים באזור gridded המרכזי הגדול (1 מ"מ 2) באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך (אובייקטיבי 10X). מולtiply ידי 10 4 להעריך את מספר התאים לכל מ"ל. בקבוק T25 אחת יניב ~ 1 x 10 תאים 6 סך ניתק. זרע ~ 1 x 10 5 תאים 2 astrocyte מ"ל בינוני ציפוי על coverslip זכוכית 12 מ"מ קוטר Poly-D- ליזין precoated בבאר של תרבות צלחת 24 גם.
  21. לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. בצע OGD / REOX ב DIV 12 - 14 (סעיף 2).
  22. פנק את תרבויות astrocyte ב DIV 3 עם 5 המ"מ L- לאוצין מהתיל אסתר (LME) hydrochloride עד DIV 11 אם תרבויות בהיפוקמפוס נטולות microglia הן רצויות. לאחר דגירת LME, תרבויות בכפופות רועד (300 סל"ד עבור 1 ח) כדי להסיר זיהום microglia.
    הערה: LME הוא סוכן ציטוטוקסי microglial כי כבר נעשה שימוש נרחב כשיטה לחסל מתרבים microglia 22.

2. OGD / REOX טיפול

  1. תקשורת לשאוב coverslip המכילה תרבות astrocyte חסידה (DIV 12 - 14) ולשטוף 3 פעמיםעל ידי בעדינות לסובב את המנה תרבות 24 גם מחזיק את coverslip כמה פעמים עם 1 מ"ל איזוטוני OGD פתרון (pH 7.4) המכיל (מ"מ): 0 גלוקוז, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0.33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, ו- 0.81 MgSO 4.
  2. להוסיף 0.2 מ"ל פתרון OGD כדי גם כדי לכסות את coverslip ו דגירה עבור 2 שעות באינקובטור היפוקסי המכיל 94% N 2, 1% O 2, ו 5% CO 2. לערבב בעדינות עם שייקר מסלולית (50 סל"ד) עבור היפוקסיה 30 דקות של הראשון כדי להקל חילוף הגזים.
  3. דגירה לתאי קבוצת normoxic עבור 2 שעות ב 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי חיץ זהה הפתרון OGD למעט תוספת של גלוקוז 5.5 מ"מ.
  4. לקבלת REOX, פתרון OGD לשאוב ולהוסיף 2 מ"ל של astrocyte ציפוי בינוני. מדגירים 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.

3. Immunocytochemical מכתים

  1. לשאוב התקשורת והתרבות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית המצורפת קו ואקום ובמהירות לשטוף coverslip פעם על ידי הוספת 1mL של 0.1 M טריס בופר (TBS) (154 mM NaCl, 16 Base מ"מ Trizma, 84 mM Tris-HCl, pH 7.4) אל הבאר. לשאוב ולהוסיף 2 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1x בופר פוספט (PBS). דגירה במשך 15 דקות ב RT.
  2. לשאוב ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1 M TBS, ואז למקם על שייקר נדנדה למשך 2 דקות. חזור 3 פעמים. הוסף 1 מ"ל פתרון לחסימת (סרום עיזים 10%, 10 מ"ג / מ"ל ​​BSA, 0.025% Triton X-100 ב 0.1 M TBS) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.
  3. לשאוב פתרון חסימת ולהוסיף נוגדנים נגד GFAP חד שבטיים העכבר העיקרי (0.2 מ"ל של דילול 1: 500 בחסימת פתרון) ארנב polyclonal אנטי-S100B (1: 500) או ארנבת polyclonal אנטי HIF1α (1: 200) למשך 60 דקות ב 37 ° C על שייקר נדנדה.
  4. לחילופין, האסטרוציטים כמה מודגרת עם אנטי IBA1 polyclonal ארנב (1: 200) ועכבר monאנטי MAP2 oclonal לגשת טוהר התרבות.
  5. לשאוב העיקרי נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M TBS והצבת על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים.
  6. להוסיף 0.2 מ"ל של דילול 1: 200 של נוגדנים משני עז נגד ארנב 488 מצומדות ואנטי עכבר 568 מצומדות בחסימת פתרון עבור 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.
  7. לשאוב משני נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M TBS ומניחים על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים.
  8. הסר coverslip מבאר ויבש ידי הצבת בשקופית ניצב על יבש שקופיות. coverslip הר בשקופית חדשה על ידי היפוך על טיפה אחת של Vectashield hardset הרכבה בינונית עם DAPI (1.5 ng / μL).
  9. coverslips תמונה על מיקרוסקופ confocal או באמצעות 20X אובייקטיבי שמן יבש או 60X. לרכוש תמונות (512 x 512) עבור DAPI (לשעבר ננומטר 405/450 ננומטר em) ו fluorochrome 488 מתויג נוגדן GFAP (לשעבר ננומטר 488/515 ננומטרem). שמור פרמטרי רכישה קבועים בתוך 20X ו 60X קבוצות.

4. קביעת מין באמצעות PCR

  1. הבוהן הגור חום או קטעי האצבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ב 50 מ"מ NaOH ולנטרל עם נפח שווה של 1 M טריס, pH 6.8.
  2. הוסף 1 μL של פתרון ה- DNA חילוץ 19 μL של התערובת הבאה: 5 pmoles של פריימרים עבור הגנים Myog ו Sry, מאגר התגובה 1x, 0.2 מ"מ כל deoxynucleotide ו -8 פולימראז תקי U.
  3. השתמש רצפים פריימרים; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' ו Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. בצע את פרוטוקול ה- PCR הבא: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולאחר מכן 30 מחזורים של denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב 58 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואת ההתארכות ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. בעקבות 30 זה מחזורי, התגובה מסכמת עם התארכות C סופית 72 מעלות במשך 1 דקות.
  5. PC הנפרדמוצרי R electrophoretically על ג'ל agarose ethidium ברומיד-המכיל 2% ולדמיין תחת תאורת UV. (איור 2 א). זהירות! Ethidium ברומיד הוא קרצינוגן פוטנציאליים חייב להיות מטופל בזהירות מסולק כראוי על פי התקנות של המוסד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבנת התפקידים של פונקציות astrocyte חרמנית בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological כבר הובהר מאוד על ידי culturing תאים אלה בתנאים במבחנה. ההיבט החשוב של ביצוע culturing חרמנית הוא לקבוע את מינו של גור העכבר לפני השימוש בו. אנחנו נקבע את מינו של העכבר גנטי על ידי PCR ועל ידי הערכה חזותית (איור 2) 16. המתודולוגיה של קביעת מין באמצעות PCR אומצה עם שינויים מן McClive ו סינקלייר, הוא מהיר, פשוט, מאוד לשחזור שיטה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על מנת ללמוד את ההבדלים בין המינים במאפייני ותפקוד של האסטרוציטים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, הכנת האסטרוציטים העיקרי חרמנית תרבית תאים הוא כלי חשוב לנצל. במחקר הנוכחי אנו מדווחים יעילים שיטה לשחזור לתרבות אוכלוסיה הומוגנית מועשר של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית מן היילוד (P0-P2) C57Bl / 6 (סוג בר) או K19F (null GFAP) גורים העכבר חוץ גופית. הקמת מתודולוגיה זו מסייעת לחוקרים להבין את פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית לאחר איסכמיה חוץ ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אף אחד מהמחברים יש מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

תודות

תוכנית פרס המדע הקליני והתרגומי של NCATS UL1 TR0000427 ו-KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 ל-UW ICTR מ-NIH/NCATS וכספים ממרכז Waisman (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 מ-NINDS (Cengiz P) ו-NIH P30 HD03352 (מרכז Waisman), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). ברצוננו להודות לאלבי מסינג, דוקטורט, על שסיפק לנו את עכברי הנוקאאוט של GFAP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Astrocyte Culture media
DMEM, High glucosecellgro10-013-CV
HorseSerum Gibco26050-070ריכוז סופי: 10%
פניצילין-סטרפטומיציןCellgro 30-002-CIריכוז סופי: 1%
L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלורידAldrichL1002-25Gריכוז סופי: 5 מ"מ
<חזק>תמיסה לעיכול רקמת מוח
HBSSLife Technologies14170-088
טריפסיןסלגרו25-050-CIריכוז סופי: 0.25%
אחר
70% (נפח/נפח) אתנולRoth9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) כיסוי עגול 12 מ"מ Corning354087
WaterSigmaW3500PBS
cellgro21-040-CVדרגת תרבית תאים
0.05% טריפסין-EDTA Life Technologies25300-062
70 μ m מסננת תאים סטריליים פישר22363548
3.5 ס"מ צלחת פטריBD פלקון353001
15 מ"ל שפופרת בז BDפלקון
50 מ"ל שפופרת בזBD פלקון352070
מלקחיים, עדין Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
מלקחיים, קצה שטוחKLS Martin12-120-11
מספריים כירורגיים 13 ס"מAesculapBC-140-R
מיקרוסקופ קונפוקליNikonA1RSi 
צנטריפוגהEppendorf5805000.0175804R
שייקר אורביטליThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741ארנב חד שבטי
אנטי-MAP2SigmaM2320עכבר חד שבטי
אנטי-HIF1alphaabcamab179483ארנב חד שבטי
אנטי-S100BסיגמאHPA015768ארנב פוליקלונלי
אנטי-GFAP (קוקטייל)Biolegend837602
ערכת VECTASTAIN עלית ABC (ארנב IgG)Vector LabsPK-6101מכיל 4 ריאגנטים 
עז אנטי ארנב Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
עיזים נגד עכבר Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004
מדעי 352096

מקורות

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFAPS100B

מאמרים קשורים