הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53696

⸱

6 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nanobiomedical Sciences and BK21 PLUS NBM Global Research Center for Regenerative Medicine, Dankook University, 2Insititute of Tissue Regeneration Engineering, Dankook University, 3Department of Biological Sciences, Ajou University, 4Department of Pharmacy, Sahmyook University, 5Department of Animal Biotechnology, Sahmyook University

במאמר זה

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

תקציר

טכניקות השתקת גנים וביטוי יתר הן חיוניות לזיהוי גנים המעורבים בהתפתחות העוברית. שינוי גן מטרה ישיר בעוברים טרום השרשה מספק אמצעי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של גנים המעורבים, למשל, בהתמיינות תאית לטרופקטודרם (TE) ולמסת התא הפנימית (ICM). כאן, אנו מתארים פרוטוקול הבוחן את תפקידו של ניאוגנין כקולטן אותנטי לקביעת גורל התא הראשוני בעוברי עכברים טרום השרשה. ראשית, אנו דנים במניפולציות הניסיוניות ששימשו לייצור רווח והפסד של תפקוד ניאוגנין על ידי הזרקת מיקרו-ניאוגנין cDNA ו-shRNA; היעילות של גישה זו אושרה על ידי מתאם חזק בין רמות הביטוי הזוגיות של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לבין הכימות האימונוציטוכימי של ביטוי ניאוגנין. שנית, ביטוי יתר של ניאוגנין בעוברי עכברים לפני השרשה מוביל להתפתחות תקינה של ICM בעוד שהפלת ניאוגנין גורמת ל-ICM להתפתח בצורה לא תקינה, מה שמרמז על כך שניאוגנין יכול להיות קולטן המעביר רמזים חוץ-תאיים כדי להניע בלסטומרים לגורל תאים מוקדם. בהתחשב בהצלחתו של פרוטוקול מפורט זה בחקירת תפקודו של קולטן ספציפי לשלב התפתחותי עוברי חדש, אנו מציעים שיש לו פוטנציאל לסייע בחקירה וזיהוי של גנים ספציפיים לשלב אחר במהלך האמבריוגנזה.

מבוא

ההתפתחות העוברית preimplantation ניתן לחלק מספר שלבים ברורים, החל משלב-תא אחד מורולה ואת הבלסטוציסט. עדויות רבות עולה כי הקוטביות רמזים מיקומית לשחק תפקיד בקביעת גורל התא מוקדם לתוך trophectoderm (TE) ואת מסת התאים הפנימית (ICM). עם זאת, האופי של הרמזים, איך הם transduced לאותות הסלולר, וההקשרים הפיסיולוגיים שבו אותות כאלה מסוגלים ליזום בידול שושלת תא אינם ידועות. תאים מובחנים אלה אז עוברים התמחות, החל לקחת על מבנים אופייניים ופונקציות הדרושים להיווצרות נכונה העובר וצמיחה של השליה 1-3.

עוברי אדם במיוחד למניפולציה על ידי הזרקה ישירה של חומרים גנטיים שונים כמו siRNA או cDNA היעד ולכן יכולים להיות מנוצל כדי ללמוד מולקולות מטרה ספציפיות. יש הבנה גוברת כי גנטיניתוח של עוברי החולייתנים הוא קריטי לקידום הבנתנו התפתחות העוברית 4. מבוא מדויק של גן wild-type או צורת מוטציה לעובר בהקשר בזמן להשיג gain- או פסד של פונקציה של הגן מאוד קל בחקר גנים מוסדרים מבחינה התפתחותית. Loss- ולהשיג של פונקציה באמצעות microinjection של חומרים גנטיים לעוברי פרט מוקדמים שאינם יונקים יונקים הוא יחסית פשוט בגלל הגודל שלהם גדול פתיחות רבה 5. Microinjection טיפוסית מבוצעת וקטורים שאינם ויראלי. יתרון מסוים נלקח של קלות השימוש וקטורים שאינם נגיפי מעל וקטורים transgenes ויראלי. Loss- מהירה או רווח של פונקציה במערכת הביטוי עובר עכברים פותחה המאפשרת לנו לנתח ולהבין פונקציות גני אמבריולוגיה חוליות 6,7.

תיוג פלורסנט של עוברי היה מאוד להקל על הבחירה של microinjected או מניפולציות גנטיות עוברים ובאותו זמן להעניק אמצעי לכמת את רמת הביטוי בעקיפין של microinjected siRNA או cDNA מבוסס על עוצמת פלורסנט 8. כדי להשיג תיוג זה, cDNA חלבון פלואורסצנטי, GFP או RFP, הם כמו שיתוף מוזרק או בונה היתוך או בנפרד. עוצמת הקרינה של ה- GFP או RFP החושף את מידת הביטוי של siRNA או דנ"א זר על מנת להבטיח כי loss- או לזכות של פונקציה הושג.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיקרומניפולציה עבור טכניקה פונקציה loss- ורווח-של- שאפשרה לנו לזהות neogenin כמו קולטן המעביר אותות תאיים חשובים התמיינות תאים מוקדם עוברי עכברים preimplantation.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו בהתאם לתקנות IACUC של Sahmyook אוניברסיטת סיאול, דרום קוריאה.

1. superovulation, גידול ובידוד oviduct

  1. לשמור על מולדת C57BL / 6 עכברים בתנאים הבאים: 22 ± 3 מעלות צלזיוס, ~ 60% לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, ו כרצונך מים ומזון.
  2. להשרות superovulation של עכברות בן שבוע 3-5 על ידי זריקה intraperitoneal של גונדוטרופין בסרום סוסה הרה 5 IU (PMSG) ב 0.1 מ"ל / ראש וכעבור 48 שעות על ידי זריקה intraperitoneal של 5 גונדוטרופין כוריוני אנושי IU (hCG) ב 0.1 מ"ל /רֹאשׁ.
  3. מייד לאחר הזרקת hCG, להזדווג נקבות נגרם superovulation עם זכרים בוגרים מינית מאותו הזן ידי שמירה על אותם באותו הכלוב הלילה.
  4. למחרת בבוקר, לאשר הזדווגות מוצלחת על ידי הנוכחות של תקע הזדווגות או תוסף נרתיק על בדרכי המין הנשית.
  5. להקריב עכברות בהריוןשיכרון 2 על ידי ה- CO ואחריו hr 18-20 נקע בצוואר הרחם לאחר ההזרקה hCG.
  6. פתח את חלל הבטן על ידי חיתוך העור ולאחר מכן שכבת הצפק עם מספריים בסדר.
  7. תרימי את קרני הרחם עם מלקחיים בסדר למשוך את הרחם, השחלה, השחלה, ואת כרית שומן בעדינות מחלל הגוף.
  8. חותכים את השטח שבין oviduct ואת השחלה עם מספריים בסדר. מיקום מחדש של מלקחיים ולחתוך הרחם ליד השחלה, משאיר לפחות 1 ס"מ של החלק העליון של הרחם המצורפת.
  9. מעבירים את ampulla oviductal לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל בינוני M16 בטמפרטורת החדר. לרכז את oviducts מכמה עכברים באותה צלחת.
  10. מניחים את הצלחות מתחת סטראו לשליפה של עוברים.

2. אחזור והתרבות של 2-Pronuclear (2-PN) עוברים

  1. חותכים את הקצה של מחט המזרק G 30 או 32, לטחון אותו לתוך קצה קהה, ולהשתמש בו בתור מחט שטיפה.
  2. להשתמשמלקחיים בסדר להחליק סוף oviduct על מחט שטיפה. לחץ בעדינות את קצה מחט השטיפה נגד התחתון של המנה כדי להחזיקו במקום. שטוף את oviduct עם ~ 0.1 מ"ל של מדיום M16 לשחרר את העוברים 2-PN לתוך צלחת פטרי.
  3. לשחזר את עוברי 2-PN יחד עם סובבי המונים קומולוס ממדיום M16 הסמוק תחת סטראו בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי חדשה.
  4. לנתק תאי קומולוס מן העוברים 2-PN ידי עיכול אנזימטי עם 1.0 מיליליטר של hyaluronidase 0.1-0.5% ב פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  5. לערטל העוברים על ידי pipetting בעדינות עם טפטפת זכוכית והסרה פיזית של תאי קומולוס.
  6. לשטוף עוברי ערומים שלוש פעמים עם 30-50 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגר פוספט טרי (PBS) לכל עובר.
  7. דגירה עוברים בצלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי במדיה M16 בתוספת 10 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA, Fractיון V) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור humidified עד microinjection הוא עשה, שהיא בדרך כלל פחות מ 4 שעות מאוחר יותר.

3. העובר שעתוק לאחור (RT) ואת תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

  1. אסוף לפחות 10 עוברי של כל שלב עד שלב הבלסטוציסט ובריכת אותם 4.0 μl של 5x הפוכה פתרון transcriptase מראש תערובת המכילה transcriptase הפוכה, מעכב RNase, פריימר dT אוליגו, 6mers אקראי, תערובת dNTP, ואת חיץ התגובה בתוך צינור PCR.
  2. להוסיף מזוקקים RNase ללא H 2 O ל בהיקף כולל של 20 μl ו sonicate את העוברים ונקווה למשך 30 שניות ב 200 W. ליזום את התגובה RT מיד על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ואחריו הדגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
  3. עבור כל 5.0 μl של פתרון cDNA שנוצר, לנהל הגברה PCR רגילה עם צבעי יסוד neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, או β-אקטין (רצפים פריימר מתפרסמים בלוח 1. PCR מורכב מ -40 מחזורי דגירה 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות בטמפרטורת חישול (שניתן לראות בטבלה 1), ו -30 שניות על 72 מעלות צלזיוס.
  4. מוצרי ה- PCR נפרד על ידי אלקטרופורזה על ג'ל 2% agarose ולדמיין את הג'ל תחת אור UV לאחר מכתים עם ברומיד ethidium.
  5. לנרמל ביטוי גן המטרה נגד רמות β-אקטין.

4. Immunocytochemistry של עוברים

  1. תקן עובר כל שלב עם paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחריו כביסה קצרה 3 פעמים עם PBS המכיל 0.01% BSA.
  2. קרום התא Permeabilize ידי דוגרים 10 עוברים 1.0 מ"ל של PBS המכיל 0.1% Tween 20 ו -0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  3. כדי לחסום ספציפי מחייב דגירה עוברים permeabilized ב 1.0 מ"ל של PBS השלימו עם 10% נסיוב עז נורמלי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. דגירת שנינות עוברת החסומותh ארנב נוגדנים נגד neogenin ב 1: 100 דילול ב PBS המכיל BSA 0.1% לילה בשעה 4 ° C.
  5. אחרי שלושה שוטף במשך 30 שניות כל בטיפות של PBS, דגירה עוברים גם עם Alexa 488 מצומדות עז IgG נגד ארנב או אלקסה 568 מצומדות IgG נגד ארנב עז ב 1: 500 דילול בתמיסה PBS / BSA לילה ב 4 ° C .
  6. כדי להמחיש סיבי אקטין, דגירה עוברים 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​phalloidin ב PBS עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  7. הכתם גרעינים ידי הוספת 5 מ"ל PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף עובר שלוש פעמים בקצרה עם PBS.
  9. העבר עובר לשקופית זכוכית ומכסה אותם עם טיפה של שמן מינרלים.
  10. קח תמונות בהגדלה 1,000X עם מיקרוסקופ confocal עם עירור של אורך הגל המתאים.

5. הכנת Neogenin-RFP ו Neogenin-siRNA GFP פלסמידים

  1. תַתלשבט cDNA קידוד העכבר neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) המכילים וקטור, וכתוצאה מכך-RFP neogenin-דגל.
  2. Subclone RNA סיכת הראש הקטן מיקוד neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק ברקת (EmGFP) המכיל וקטור, וכתוצאה מכך pcDNA-EmGFP מיר-neogenin (שמוצג באיור 1).
  3. להגביר הן פלסמידים neogenin-דגל-RFP ו pcDNA-EmGFP מיר-neogenin ולטהר אותם עם שיטות קונבנציונליות.
  4. התאם את ריכוזי הסופי של פלסמידים ~ 1.0 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב חיץ סטרילי טריס-EDTA (TE).

6. Microinjection של פלסמידים לתוך 2-PN עוברים

  1. לשטוף את עוברי 2-PN הערום פעם בחטף, עם תקשורת M16 טריה.
  2. צנטריפוגה עוברים 2-PN במשך 10 דקות XG ב 1000 בצנטריפוגה בטבלה העליונה כדי לאפשר תצפית של pronuclei.
  3. דגירה עוברת בטיפת מייקרו של 20-30 μl של תקשורת M16 לכל עובר תחת שמן מינרלים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור additihr 1-2 onal.
  4. ייצור טפטפות הזרקת טפטפות מחזיק ידי משיכת צינור נימי בורוסיליקט זכוכית (OD = 1.2 מ"מ; ID = 0.94 מ"מ) עם חולץ מכני.
  5. לפברק טפטפות הזריק לקבל טיפים בוטים ופתחים מלוטשים באורך טיפ <500 מיקרומטר ו 1-2 קוטר פנימי טיפ מיקרומטר באמצעות microgrinder וכן microforger.
  6. לפברק מחזיק טפטפות כאלה שיש להם טיפים בוטים ופתחים מלוטשים בקוטר פנימי של 20 מיקרומטר קוטר חיצוני של 100 מיקרומטר.
  7. טפטפות הזרקה טען עם כמות מספקת (> 200 nl) של פתרון פלסמיד ב 1.0 מיקרוגרם / μl.
  8. Microinject ~ 10 pl של פתרון פלסמיד עבור כל העובר 2-PN לאחת pronuclei באמצעות microinjector המצורפת micromanipulator ממונע; במהלך תהליך זה, לשמור עובר במצב על ידי הפעלת לחץ שלילי עם פיפטה מחזיק.
  9. לאחר microinjection, לשטוף את העוברים 2-PN 3 פעמים עם התקשורת M16 טרי lESS מ -1 דקות בכל פעם.
  10. תרבות עובר 2-PN בטיפת תקשורת M16 הטרי על צלחת פלסטיק תרבות המכוסית על ידי ירידת שמן מינרלים כדי למנוע אידוי תקשורת.
  11. שים את העוברים על 24 מרווחי hr תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 200X.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גילינו כי neogenin מתבטא זמני במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים של עוברי עכברים preimplantation, המופיע מוקדם ככל בשלב 2 תאים ומתמשך עד מורולה מוקדם אבל הופך לקוי בבית מורולה מאוחר ושלבי הבלסטוציסט (איור 2 א). בנוסף, הפריסה המרחבית של neogenin הוגבלה בעיקר לתאים בחוץ. תוצאות ניתוח RT-PCR היו תואמים את האופי המוקדם וחולפת ביטוי neogenin, לשיא בשלב 4 תאים אבל חסר לחלוטין בשלב 16 התאים או במאוחר (תרשים 2B). לעומת זאת, ה- F...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטות חדשניות של microinjection של חומרים גנטיים, או cDNA או shRNA, לתוך עוברי עכברים 2-PN כדי לחקור את תפקיד neogenin ב התמיינות תאים מוקדם במהלך העובר העכבר. הנדסה גנטית של עבר preimplantation היא טכניקה רבה עצמה בחשיפת מידע חשוב על מנגנונים מולקולריים שבבסיס עבור, למשל, קביעת שושלת התא הראשונה. הנדסה גנטית היא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור בירור תפקוד גן. עם receptibility גדול יחסית של עוברים 2-PN לחומרים גנטיים זרים ועל כדאיות של microinjection של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין המחברים אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

תודות

המחברים גם רוצים להכיר החוקרים שיונג ורג 'יה למדעי הבריאות באוניברסיטת לייצור ושיתוף בונה עבור neogenin וקטורים cDNA ו shRNA. מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר במדע בסיסי (2013R1A1A4A01012572) במימון קרן מחקר קוריאה על ידי מענק מחקר מן Sahmyook האוניברסיטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
M16 בינוני,Gibco BRL (גרנד איילנד, ניו יורק)M7292 LOT # 11A832
סרום עיזים,  Dako (גלוסטרופ, דנמרק)X0907
PMSGFolligon, Intervet, הולנדG4877-1000IU LOT#SLBD0719V
שמן מינרליסיגמא אולדריץ'CG5-1VL LOT# SLBC6783V
גונדוטרופין כוריוני אנושי וגונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (Intervet, הולנד)(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptaselifetechnologies18080-044
PCR pre mix ( ביוניר, דאג'ון, דרום קוריאה)GenDEPOT , A0224-050
אגרוז (דרגה מולקולרית)BioRad161-3101
תמיסת פרפורמלדהיד, 4% ב-PBSAffymetrix ארה"19943
נוגדן אנטי-ניאוגנין ארנב פוליקלונליסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"SC-15337
Alexa fluor 488 תויג נוגדן נגד ארנבבדיקות מולקולריות (Invitrogen, ארה"ב)A-11094
Alexa fluor 555 עם תווית נוגדן נגד ארנבבדיקות מולקולריות (Invitrogen, ארה"ב)A-21428
Alexa Fluor® 555 בדיקות מולקולריות של פלואידין(Invitrogen, ארה"ב)A34055
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)Invitrogen, ארה"בD1306
רקומביננטי אנושי RGM-C/HemojuvelinR&;D מערכות3720-RG
כל מבני הפלסמיד פרופ' וון צ'נג שיונג מאוניברסיטת ג'ורג'יה למדעי הבריאות (אגוסטה, ג'ורג'יה).למחקרים הנוכחיים סופקו באדיבות על ידי 
ניאון&רג;   מערכת טרנספקציהlifetechMPK10096
סטריאו מיקרוסקרופניקוןSMZ1000
מערכת מיקרו-mainpulation עם ניקוןניקוןNarishige ONM-1
מיקרו מזרקניקון NarishigeGASTIGHT #1750
מחזיקניקון Narishige NarishigeIM 16
מיקרופוגהניקון NarishigeNarishige MF-900
NarishigeEG400
חולץSutter Instrumnet חברהP-97
CO2 חממהThermo Scientific FormaEW-39320-16
Veriti® מחזור תרמי 384 בארות LifeTechnologies4388444
ב ב מטחנת

מקורות

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
  2. Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
  3. Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
  4. Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
  5. Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).
  6. Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
  7. Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
  8. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).
  9. Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989(2014).
  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NeogeninRT PCR
Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.