אקטין חוטי (F-actin) ממלא תפקיד חשוב בספינוגנזה, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. כימות של F-actin puncta הוא אפוא כלי שימושי לחקר שלמותם של מבנים סינפטיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים של כימות פונקטה F-actin המסומנת עם Phalloidin בתרביות עצביות קליפת המוח הראשוניות בצפיפות נמוכה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבון אקטין פילמנטיות (F- אקטין) ממלא תפקיד מרכזי spinogenesis, הפלסטיות הסינפטית, ויציבות הסינפטי. שינויים במבנים להציע שינויים עשירים F- יקטינו הדנדריטים ביושרה הסינפטי וקישוריות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש העיקרי, מכתים Phalloidin עבור puncta F- אקטין, וטכניקות כימות שלאחר מכן. ראשית, קליפת המוח הקדמית של עוברי חולדה E18 הם ניתק לתוך תרבית תאים בצפיפות נמוכה, אז הנוירונים לגדל במבחנה עבור 12-14 ימים לפחות. בעקבות הטיפול הניסיוני, הנוירונים בקליפת המוח מגואלות AlexaFluor 488 Phalloidin (לתייג את puncta F- אקטין הדנדריטים) ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2; כדי לאמת את תאים עצביים ויושרה הדנדריטים). לבסוף, תוכנה מיוחדת משמשת כדי לנתח ולכמת שנבחרו באקראי דנדריטים עצביים. F- תקטין מבנים עשירים מזוהים על ענפי הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 &# 181; מ ') עם immunofluorescence MAP2 הרציף. הפרוטוקול המובא כאן יהיה שיטה שימושית חוקר שינויים במבני סינפסה הדנדריטים לאחר טיפולים ניסיוניים.
מבוא
המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה אמינה של מדידה (אמידה) של שלמות הסינפטי של רשת הדנדריטים העצבית. כאן אנו מתארים כימות של puncta F- אקטין ב נוירונים בתרבית עכברוש ראשוני באמצעות שילוב של מכתים Phalloidin ו immunocytochemical (ICC) זיהוי של דנדריטים עם לניתוח שלאחר מכן באמצעות מיוחדים (ש"ח- Elements) תוכנה.
יש תווית phallotoxins זיקה דומה חוטים גדולים וקטנים כאחד (F- אקטין) אבל לא להיקשר אקטין כדוריים monomeric (G אקטין), בניגוד לכמה נוגדנים אקטין 1. ספציפי המחייב של Phalloidin זניח, ובכך לספק רקע מינימלי במהלך הדמיה הסלולר. Phalloidin הוא קטן בה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הפרוטוקולים החיה היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר אבטחת: A3049-01).
1. צפיפות נמוכה עוברית תרבות העצבית
- הכנה תרבות נוירון קורטיקלי ראשוני
- פתרונות:
- הכן פתרון המניות פולי- L- ליזין על ידי המסת 5 מ"ג של פולי- L- ליזין ב 10 מ"ל ח....
- פתרונות:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בשיטות הנוכחיות, אנו עכברוש התרבות הראשונה נוירונים בקליפת מוח בצפיפות נמוך ב -35 מ"מ צלחות זכוכית תחתונים, אשר מאפשרת לנו לזהות את דנדריטים של נוירונים בודדים. באיור 1, ניגוד התערבות ההפרש (DIC) התמונות להראות את השינויים המורפולוגיים בפיתוח נוירונים בקליפת מוח עכברוש העובר על ימי 4, 6, 10, 14, 21 ו -27 במבחנה. ראוי לציין, כי האורך ומספרם של הדנדריטים להגדיל ככל שמתבגרים של נוירונים עיקרי עכברוש תרבותי. נוירונים משמש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מתארים culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש בצפיפות נמוכה במנות 35 מ"מ זכוכית התחתונה אשר מאפשר לנו לזהות דנדריטים של נוירונים בודדים. לאחר מכן, אנו משתמשים Phalloidin ו MAP2 מכתים כדי לזהות שינויים הדנדריטים. לאחר מכן, השתמשנו בתוכנה מיוחדת כדי לכמת שינויים puncta F- אקטין.
כדי להבחין בשינויי F- יקטין puncta הרשת העצבית כולה של נוירון יחיד חייבת להיות ברורה לעין, זה מאפשר מבחר קטעי הדנדרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH DA013137, DA031604 ו-HD043680. תמיכה חלקית ניתנה על ידי מענק הכשרה של NIH T32 במדעי ההתנהגות הביו-רפואיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 35 מ"מ תחתית זכוכית כלים מס' 1.5 כיסוי זכוכית | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| פולי-L-ליזין | סיגמא | P9155 | |
| חומצה בורית | סיגמא | B0252 | |
| בורקס | סיגמא | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| גלוקוז | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal | בינוני Life Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 תוסף | חיים | 17504-044 | 50X |
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית פתרון | Cellgro | 30004CI | 100X |
| נתרן ביקרבונט | טכנולוגיות חיים | 25080 | |
| מספריים ואנאס | מכשירים מדויקים עולמיים | 500086 | |
| איריס מספריים | מכשירים מדויקים עולמיים | 500216 | |
| איריס מלקחיים | מכשירים מדויקים עולמיים | 15914 | |
| Dumont #7 מלקחיים | עולמיים Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| כיסוי זכוכית | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| סרום סוס רגיל | Life Technologies | 26050-070 | |
| עוף פוליקלונלי אנטי-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-מצומד עז אנטי-עוף IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements חבילת תוכנה | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מבוקר מחשב | ניקון אינסטרומנטס | ||
| 0.2 μ m מסנן קרום ניילון Nalgene | Fishersci | 151-4020 |
מקורות
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
