כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

סיכום

אקטין חוטי (F-actin) ממלא תפקיד חשוב בספינוגנזה, פלסטיות סינפטית ויציבות סינפטית. כימות של F-actin puncta הוא אפוא כלי שימושי לחקר שלמותם של מבנים סינפטיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים של כימות פונקטה F-actin המסומנת עם Phalloidin בתרביות עצביות קליפת המוח הראשוניות בצפיפות נמוכה.

תקציר

חלבון אקטין פילמנטיות (F- אקטין) ממלא תפקיד מרכזי spinogenesis, הפלסטיות הסינפטית, ויציבות הסינפטי. שינויים במבנים להציע שינויים עשירים F- יקטינו הדנדריטים ביושרה הסינפטי וקישוריות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש העיקרי, מכתים Phalloidin עבור puncta F- אקטין, וטכניקות כימות שלאחר מכן. ראשית, קליפת המוח הקדמית של עוברי חולדה E18 הם ניתק לתוך תרבית תאים בצפיפות נמוכה, אז הנוירונים לגדל במבחנה עבור 12-14 ימים לפחות. בעקבות הטיפול הניסיוני, הנוירונים בקליפת המוח מגואלות AlexaFluor 488 Phalloidin (לתייג את puncta F- אקטין הדנדריטים) ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2; כדי לאמת את תאים עצביים ויושרה הדנדריטים). לבסוף, תוכנה מיוחדת משמשת כדי לנתח ולכמת שנבחרו באקראי דנדריטים עצביים. F- תקטין מבנים עשירים מזוהים על ענפי הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 &# 181; מ ') עם immunofluorescence MAP2 הרציף. הפרוטוקול המובא כאן יהיה שיטה שימושית חוקר שינויים במבני סינפסה הדנדריטים לאחר טיפולים ניסיוניים.

מבוא

המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה אמינה של מדידה (אמידה) של שלמות הסינפטי של רשת הדנדריטים העצבית. כאן אנו מתארים כימות של puncta F- אקטין ב נוירונים בתרבית עכברוש ראשוני באמצעות שילוב של מכתים Phalloidin ו immunocytochemical (ICC) זיהוי של דנדריטים עם לניתוח שלאחר מכן באמצעות מיוחדים (ש"ח- Elements) תוכנה.

יש תווית phallotoxins זיקה דומה חוטים גדולים וקטנים כאחד (F- אקטין) אבל לא להיקשר אקטין כדוריים monomeric (G אקטין), בניגוד לכמה נוגדנים אקטין ^1. ספציפי המחייב של Phalloidin זניח, ובכך לספק רקע מינימלי במהלך הדמיה הסלולר. Phalloidin הוא קטן בהרבה נוגדנים יאפיין לתייג חלבונים תאיים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר תיוג הרבה יותר אינטנסיבי של F- אקטין ידי Phalloidin. לפיכך, תמונות מפורטות של לוקליזציה F- אקטין בנוירונים יכול להיותהמושגים תוך כדי שימוש של Phalloidin שכותרתו.

Phalloidin (F- יקטין) מכתים של דנדריטים עצביים מייצר "נקודות חמות" בדידות או בהיר "puncta", אשר מייצגות מגוון הרחב של מבנים הדנדריטים, כוללים קוצים בוגרים, סינפסות הלא קוצניות ² קוצים בשלה. הקוצים בשלה כוללים filopodia דק וכמה צורות של מורפולוגיה תיקון, עשוי לייצג את החניכה של spinogenesis ^3. קוצים בשלה וטלאים הלא קוצניים חסרי PSD95 ^4. שינויים בייצור של F- אקטין להוביל לשינויים שלאחר מכן לא הקוצים, אלא גם מבנים הדנדריטים נוספים, ובכך Phalloidin כלי חשוב לחקירת שלמות synaptodendritic ^5-7. באופן כללי, מספר Phalloidin החיובי (F- יקטין) puncta לשקף איזון בין הסינפסות פעילה (מעורר ו מעכבות), דינמיקה תקטין סינפסה יציבות ^8.

למרות שחשוב ללמוד t הספציפיypes של סינפסות (כלומר, קוצים מעוררים), כאשר היעד של הטיפול אינו ידוע יש צורך להעריך את היושרה הכללית הראשונה של מגוון מבנים הדנדריטים. מאז F- אקטין מהווה מרכיב מרכזי של הקוצים הדנדריטים ומבנים אחרים, כולל סינפסות מעכבות, מספר שינו של F- אקטין puncta עשוי להצביע על synaptopathy. synaptopathy לאחר מכן יהיה אפשר מתחקיר לשינויים ספציפיים יותר. שיטת כימות שלנו לאיתור סוגים הסינפטי מרובים / מבנים מניבים הערכה כללית של שינויי סינפטיים הדנדריטים (עליות וירידות) בעקבות טיפולים ניסיוניים שונים.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים החיה היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר אבטחת: A3049-01).

1. צפיפות נמוכה עוברית תרבות העצבית

1. הכנה תרבות נוירון קורטיקלי ראשוני
   1. פתרונות:
      1. הכן פתרון המניות פולי- L- ליזין על ידי המסת 5 מ"ג של פולי- L- ליזין ב 10 מ"ל חיץ Borate.
      2. הכן פתרון עובד על ידי דילול 1 מ"ל פולי- L- ליזין לניירות ערך 49 מ"ל Borate הצפת.
      3. הכן חיץ borate, pH 8.4 ידי מתחיל עם 395 מ"ל _DH 2 O ולאחר מכן להוסיף את כל החומרים (1.24 חומצה בורית g + 1.9 גרם של בורקס). התאם ל- pH 8.4 ידי 1 M NaOH. התאם ל -400 מ"ל ולסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      4. הכן פתרון HBSS, pH 7.2 ידי מתחיל עם 445 מ"ל _DH 2 O ולהוסיף את כל שאר החומרים (50 מ"ל 10X HBSS במלאי + 1.2 גרם HEPES). התאם ל- pH 7.2 ידי 1 N HCl, BRIng 500 מ"ל ולסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      5. כן בינוני ציפוי: DMEM / F12 עם 10% בסרום שור עובר. מסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      6. הכן בינוני צמיחה מלא: 50 מ"ל בינוני Neurobasal, להוסיף תוספי (500 μl Glutamax (100X) + 500 גלוקוז μl + 1 מ"ל B-27 (50X) + 500 μl של לאנטיביוטיקה Antimycotic פתרון (100X) + 100 μl 7.5% סודיום ביקרבונט. סינון עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
   2. יומיים לפני התרבות:
      1. מעיל עשר 35 מ"מ צלחות זכוכית התחתונה עם 2 מ"ל של תמיסת פולי- L- ליזין עובד, ולשמור תחת O ברדס / N.
   3. יום אחד לפני התרבות:
      1. סוכן ציפוי רוקן את הכלים ולשטוף עם DDH _{2 O.} אפשר מנות להתייבש במשך שעה מתחת למכסה המנוע.
      2. הכן בינוני ציפוי (DMEM / F12 עם 10% בסרום שור העובר (10% של פתרון כולל). פיפטה 2 מ"ל בינוני לתוךכל מנה, דגירה O / N ב 37 ^{מעלות צלסיוס,} 5% _{CO 2.}
         הערה: חשוב להימנע מנות תרבות הפלסטיק כאשר culturing. שימוש בצלחות זכוכית תחתונה (עבור מיקרוסקופים הפוכים) או זכוכית coverslips (עבור מיקרוסקופים זקופים) מניבים תמונות חדות וברורות. לעומת צלחת פלסטיק תחתונה, מנת הזכוכית התחתונה נמנעה גוונים לא רצויים או בוהק במהלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. תא פרוטוקול תרבות:
   1. לשים בקירור מאגר HBSS (100-150 מ"ל), 100 מ"מ פטרי מנות, מלקחיים, מספריים, 50 מ"ל צינורות, ו -15 מ"ל צינורות תחת אור UV במנדף.
   2. להרדים חולדה בהריון עם שאיפה קטלני של sevoflurane 5% מתחת למכסה המנוע מחוץ לחדר התרבות.
   3. לעקר עם 70% EtOH, אוהל העור של הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים תוך צמצום מזנב עד באמצע הבטן cavity.Open הרחם באמצעות מספריים לחשוף את השליה.
   4. הסר 8-10 עוברים E18. PlaCe 8-10 עוברים בצלחות פטרי המכילה פתרון HBSS.
   5. החזק את האחורי של הראש של העובר עם מלקחיים, ולאחר מכן להשתמש במספריים לנתק את הראש מהגוף. מניח אותו עוד צלחת פטרי מלאה 5-7 מיליליטר של HBSS. עבר צלחת מכסה מנוע.
   6. מלאו שתי בצלחת פטרי נוספת 100 מ"מ עם HBSS קר.
   7. גולגולת פיל הצידה, סקופ המוח לתוך צלחת פטרי חדש מלא HBSS.
   8. שימוש במלקחיים מעוקל חדה, המוח הקטן וגזע המוח נפרד מהמוח, ולאחר מכן להעביר המוח כדי בצלחת פטרי חדשה עם HBSS קר בו.
   9. להשתמש בפינצטה כדי לאבטח, להפריד בין ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים. סר קרום מוח; לבודד קליפת המוח הקדמית וחתיכות העברת לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל מסומן.
   10. מלאו את צינור 15 מ"ל עם 2 טריים מ"ל HBSS ולהוסיף 20 μl טריפסין EDTA (10x תערובת מרוכזת עם 0.5% טריפסין ו -5.3 מ"מ EDTA.) על צינור אחד 15 מ"ל.
   11. דגירה 10-15 דקות ב RT. מערבולת בעדינות צינור כל כמה דקות, לא לאפשר ליישוב.
   12. באפter 10-15 דקות, פיפטה זכוכית לשימוש, שנועד להסיר הישן HBSS ולשטוף פעמיים עם חדש HBSS.
   13. לטבול מעכב טריפסין (1 מ"ג / מ"ל, 2 מ"ג מעכב טריפסין ב 2 מ"ל HBSS), ומערבבים היטב ולתת לו לשבת 5 דקות. שטוף פעמים עם HBSS הטרי.
   14. באמצעות פיפטה זכוכית עם נורת גומי, חתיכות המוח triturate 10-15 פעמים מאוד לאט כדי להימנע bubbles.Triturate שוב בעזרת פיפטה מכויל טיפ סטרילי בקוטר טיפ מופחת מאוד לאט עד הומוגניות.
   15. העברת תאים ניתקה בצפיפות רצויה מראש הכינו מנות תרבות מצופות (50 תאים / מ"מ 2). O / N לדגור על 37 ^{מעלות צלסיוס,} 5% CO2.
   16. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני DMEM / F12 עם מדיום Neurobasal סרום ללא צמיחה להשלים טרי.
   17. לשמור על התאים בכל עת בתוך חממה humidified אוויר 5% CO _2/95% מקום 12-14 ימים לפחות לפני ניסויים. להשלים את התאים כל 5-6 ימים עם בינוני טרי Neurobasal החליף כ -50% של המדיום הישן.

2. פלורסנט סימון Immunocytochemistry

הערה: תיוג immunofluorescent של תרביות תאים בקליפת המוח העיקרי בוצע במנות תרבית תאים תחתית זכוכית 35 מ"מ עם נפח העבודה של 1 מ"ל.

1. שטפו את צלחת זכוכית התחתונה פעמיים עם pH מלוחים שנאגרו פוספט 7.4 (PBS).
2. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות ב RT.
3. פעמיים שטפו תאים עם PBS permeabilize עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 5 דקות.
4. פנקו את התאים במשך 20 דקות ב RT עם כתם ספציפי F- אקטין, AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40, 25 μl של Phalloidin ב 1 מ"ל PBS).
5. יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולחסום עם 10% עז בסרום נורמלי ב RT במשך 1-2 שעות.
6. לדלל את נוגדן אנטי MAP2 polyclonal עוף (1: 2,500) ב- PBS עם 2% נסיוב עז נורמלי דגירה O / N ב 4 ^{מעלות צלסיוס}
7. לאחר דגירה, לשטוף ב PBS פעמיים.
8. לדלל את הנוגדנים משני (Alexa Red 594 מצומדות עז IgG אנטי-עוף (1: 500) עם 2% נסיוב עז נורמלי דגירה במשך שעה 2 ב RT.
9. לשטוף עם PBS ולהוסיף 10 μl / תבשיל של צבע Hoescht.
10. דגירה 3 דקות ב RT ולשטוף עם PBS פעמיים.
    הערה: תאים שכותרתו עכשיו מוכן לעבור לשלב 3 (F- אקטין ספירת puncta).
11. שמור על מדגם התא עם 100 μl של antifade מגיב כסוכן coverslipping ולשמור על 4 ^o C בחושך עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: Phalloidin יציב יחסית PBS ב +4 ° C בחושך עד 1 בשבוע הקרינה יכול להישמר עם antifade ריאגנטים coverslipping. עם זאת, תמונות אופטימליות מתקבלות 1-3 ימים לאחר צביעה מאז Phalloidin יכול להתחיל לפזר את עם אחסון ממושך.

ספירת 3. F- אקטין puncta

1. הפעל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולעבור 20 × אובייקטיבי. תוכנת מיקרוסקופ להרחיב, ולהקים תוכנית בגודל תמונה 1280 × 960 פיקסלים, ו -0.17 מיקרומטר / פיקסל רזולוציית תמונה 1 × זום.
2. לרכוש תמונות של שכותרתו שיתוף F- אקטין / נוירונים MAP2 תחת ירוק (495 ננומטר) / אדום (613 ננומטר) ערוצי ניאון.
3. בחר 5 גרין (F- אקטין) / אדום (MAP2) immunolabeled / כחול (Hoescht) תמונות ניאון של נוירון יחיד עם סוכות דנדריטים מוגדרים בבירור.
4. זהה את המבנים העשירים F- יקטין במגזר הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 מיקרומטר) עם immunofluorescence MAP2 הרציף.
5. סובב את האזור של תמונות נבחרות לרמה אופקית. העתק והדבק כתמונה חדשה.
6. תפחית את הרקע של תמונות, באמצעות התאמות עקביות לכל צלחת.
7. ספירת puncta F- יקטין ירוק הבהיר ואת עקבות אורך קטע הדנדריטים שנבחר באופן ידני על ידי משקיפים עצמאיים מאומנים. לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני.
8. חשב את צפיפות על ידי חלוקת puncta שכותרתו F- אקטין הכולל (N) לפי אורך (L) של MAP2 שכותרתו דנדריטים. נתונים אקספרס כמספר של F-acpuncta פח לכל 10 מיקרומטר של דנדריט
   הערה: puncta (גודל ≤1.5 מיקרומטר) של הקרינה F- אקטין עם עוצמת שיא של 50% לפחות מעל העוצמה הממוצעת של מכתים בפיר הדנדריטים נכללו בכל מגזר הדנדריטים שנבחרו.

תוצאות

בשיטות הנוכחיות, אנו עכברוש התרבות הראשונה נוירונים בקליפת מוח בצפיפות נמוך ב -35 מ"מ צלחות זכוכית תחתונים, אשר מאפשרת לנו לזהות את דנדריטים של נוירונים בודדים. באיור 1, ניגוד התערבות ההפרש (DIC) התמונות להראות את השינויים המורפולוגיים בפיתוח נוירונים בקליפת מוח עכברוש העובר על ימי 4, 6, 10, 14, 21 ו -27 במבחנה. ראוי לציין, כי האורך ומספרם של הדנדריטים להגדיל ככל שמתבגרים של נוירונים עיקרי עכברוש תרבותי. נוירונים משמש...

דיון

בפרוטוקול זה, אנו מתארים culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש בצפיפות נמוכה במנות 35 מ"מ זכוכית התחתונה אשר מאפשר לנו לזהות דנדריטים של נוירונים בודדים. לאחר מכן, אנו משתמשים Phalloidin ו MAP2 מכתים כדי לזהות שינויים הדנדריטים. לאחר מכן, השתמשנו בתוכנה מיוחדת כדי לכמת שינויים puncta F- אקטין.

כדי להבחין בשינויי F- יקטין puncta הרשת העצבית כולה של נוירון יחיד חייבת להיות ברורה לעין, זה מאפשר מבחר קטעי הדנדרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35 מ"מ תחתית זכוכית כלים מס' 1.5 כיסוי זכוכית	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 Medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
פולי-L-ליזין	סיגמא	P9155
חומצה בורית	סיגמא	B0252
בורקס	סיגמא	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
גלוקוז	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal	בינוני Life Life Technologies	21103-049
B-27 תוסף	חיים	17504-044	50X
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית פתרון	Cellgro	30004CI	100X
נתרן ביקרבונט	טכנולוגיות חיים	25080
מספריים ואנאס	מכשירים מדויקים עולמיים	500086
איריס מספריים	מכשירים מדויקים עולמיים	500216
איריס מלקחיים	מכשירים מדויקים עולמיים	15914
Dumont #7 מלקחיים	עולמיים Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
כיסוי זכוכית	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
סרום סוס רגיל	Life Technologies	26050-070
עוף פוליקלונלי אנטי-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-מצומד עז אנטי-עוף IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements חבילת תוכנה	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מבוקר מחשב	ניקון אינסטרומנטס
0.2 μ m מסנן קרום ניילון Nalgene	Fishersci	151-4020