כאן, אנו מראים את הזרקת הלחץ של חומרים נוירו-פרמקולוגיים במהלך רישום של תא בודד בקוף מקוק ער ומתנהג. הליך זה מאפשר מניפולציה פרמקולוגית בסביבה הישירה של אתר רישום קליפת המוח.
מאמר שיטה
מערכת הזרקה בלחץ לחקירת neuropharmacology של עיבוד מידע Awake מתנהג מקוק קוף Cortex
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפנון מלמעלה למטה של עיבוד מידע בקליפת המוח חשוב מבחינה תפקודית לתהליכים קוגניטיביים רבים, כולל אפנון של עיבוד מידע חושי על ידי קשב. עם זאת, מעט ידוע על אילו מערכות נוירוטרנסמיטורים מעורבות במודולציות כאלה. דרך מעשית לענות על שאלה זו היא לשלב רישום של תא בודד עם מניפולציה נוירו-פרמקולוגית מקומית וזמנית במודל בעל חיים מתאים. כאן אנו מדגימים טכניקה המשלבת הקלטות חריפות של תא בודד עם הזרקת חומרים נוירו-פרמקולוגיים בסביבה הישירה של אלקטרודת ההקלטה. הסרטון מציג את הכנת מערכת הזרקת הלחץ/הקלטה, כולל הכנת החומר להזרקה. אנו מראים קוף רזוס מבצע משימת קשב חזותי ואת הליך ההקלטה של יחידה אחת עם מניפולציות פרמקולוגיות חכמות.
מבוא
באזורים קליפת המוח והתת-קורטיקלית, הפעילות העצבית מושפעת על ידי נוירומודולטורים שונים, למשל אצטילכולין1. השפעות מווסתות אלה על תגובות עצביות דווחו במחקרי מבחנה 2, כמו גם בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבעלי חיים מורדמים3 ומניפולציות פרמקולוגיות מערכתיות בבני אדם4. עם זאת, התפקיד המדויק של נוירומודולטורים שונים ומעורבותם של תת-סוגים שונים של קולטנים אינם ידועים במידה רבה. כדי למדוד את ההשפעות של נוירומודולטורים ספציפיים על פעילותם של נוירונים בודדים, רצוי לגרום לשינוי נוירומודולטור זמני קרוב ככל האפשר לאלקטרודה ההקלטה. יתר על כן, חשוב שהמניפולציות הללו יבוצעו בבעלי חיים ערים, מכיוון שתפקודים קוגניטיביים קיימים רק בהיעדר הרדמה. בנוסף, הרדמה מקיימת אינטראקציה עם מערכות כולינרגיות ו-GABAergic5,6 ויכולה להוביל לשינויים בפעילות העצבית3.
במהלך העשורים האחרונים פותחו ושוכללו שתי שיטות עיקריות למתן תרופות מקומיות: יונטופורזה והזרקת לחץ. בשתי השיטות תרופות מועברות דרך מיקרופיפטות העשויות זכוכית או פלדה. עם יונטופורזה, זרם חשמלי מווסת את שחרור התרופה7. בנוסף, קיימת תרומה משמעותית של אלקטרו-אוסמוזה לכמות הכוללת של מולקולות שנפלטו8, בקורלציהעם קוטר הקצה 9 של המיקרופיפטה וכן עם ריכוז8 של החומר בו נעשה שימוש. יונטופורזיס הוא כלי רב עוצמה למניפולציה מהירה ומדויקת של כמויות קטנות של רקמת עצבים. עבור הזרקות יונטופורטיות, משתמשים בדרך כלל במיקרופיפטות מרובות חביות10, כאשר אחת משמשת כמכשיר הקלטה ואילו המיקומים האחרים משמשים כפיפטות משלוח. מגבלה של שיטה זו היא שניתן להשתמש רק במולקולות טעונות, מה שמגביל מאוד את בחירת התרופות.
הזרקת לחץ משתמשת בדחיסת אוויר או בלחץ מכני כדי להוציא חומר ממיקרופיפטה. בשיטה זו ניתן להשתמש בכל חומר מסיס, טעון או לא טעון, כולל מולקולות גדולות. שיטת הזרקת הלחץ תוארה לראשונה על ידי רייניירס ב-1933 ושוכללה עוד יותר בשנות ה-50 של המאהה-20 (ראה Lalley 11 לסקירה). בשנות ה-80 של המאה ה-20 השיטה שוכללה עוד יותר כדי לאפשר העברת כמויות בתחום הננו-ליטר (בעיקר לידוקאין12) לאזור מוגדר במוח13 תוך ביצוע הקלטה של תא בודד. הנפח הנפלט נוטר בדרך כלל על ידי התבוננות בתנועה של סמן, כגון המניסקוס בחלק העליון של הפיפטה13. הזרקת לחץ שימשה לראשונה בשנות ה-90 בבעלי חיים ערים, הן חוץ-תאיים14 והן תוך-תאיים15,16. בהתבסס על המומחיות המצטברת שנצברה במחקרים אלה, ניתן כעת לתעד באופן מהימן ממבני מוח שונים בשילוב עם מניפולציה פרמקולוגית (ראה17 להשוואה בין מערכות הזרקת לחץ עדכניות).
בעיה פתוחה מתמשכת עבור שתי שיטות מתן התרופות היא הקושי לקבוע את הנפח המדויק המוזרק. זהו אתגר גדול עוד יותר עבור ניסויים עם קופי רזוס ערים ומתנהגים, שבהם החיה מבצעת את משימת הניסוי בחדר נפרד. ניתן להקל על כך על ידי שימוש במערכת מבוקרת תוכנה במקום להסתמך על סמן חזותי כדי לנטר באופן רציף את ההזרקה.
המערכת המתוארת כאן היא הרחבה של מערכת הקלטה אלקטרופיזיולוגית מבוססת היטב (מערכת מיני מטריקס) ומשלבת פיפטה הזרקה עם מספר אלקטרודות הקלטה באוריינטציה מקבילה במרחקים מוגדרים בסידור הניתן להתאמה אישית. מניפולציה פרמקולוגית של הרקמה ליד אלקטרודת ההקלטה אפשרית באמצעות כמות קטנה בלבד של חומר, מה שמבטיח התאוששות מהירה ומאפשר חסימות מרובות של הזרקה ובקרה/התאוששות בחלון הזמן המוגבל שמציעה המשימה ההתנהגותית של בעל החיים.
פרוטוקול
טיפול בבעלי חיים וכל הפרוצדורות בוצעו בהתאם לחוקים הגרמנים טיפול בבעלי חיים מסדיר ואושרו על ידי ממשלת המחוז של בראונשווייג, סקסוניה תחתונה, גרמניה.
הערה: ככל שהניסוי מבוצע in vivo, חשוב לשמור על הסטנדרטים היגיינה הגבוהים ביותר האפשריים. במידת האפשר, לעבוד בתנאים סטריליים.
1. הכנת מערכת ההזרקה / הקלטה
- לעקר את הצינור המחבר בין micropipette עם המזרק. השתמש אורך הקצר של צינור אפשרי הניסוי הגדרת בין משאבת הזרקה ומערכת הקלטה אלקטרו.
- נקה את צינורות המדריך של שיטת הרישום באמצעות חוטי ניקוי. טובלים אותם בשמן סיליקון סטרילי ולהאכיל אותם דרך צינורות מדריך הפרט מספר פעמים.
- הכנס את micropipette זכוכית קוורץ לתוך צינור מדריך אחד מערכת ההקלטה. ראה איור 1 א.
- לאחר תיקון micropipette במערכת ההקלטה, לצרף את צינור סטרילי לפין המתכת של micropipette. שמור על עצמך; למרות micropipette הוא קבוע במערכת זה יכול לשבור בקלות בעת צירוף הצינור. השתמש בשתי פינצטה סטרילית להפעיל לחץ שווה על פיני צינור.
- להשתמש בדבק סופר נוזלי לאטום את הצומת בין צינור micropipette. חכו לפחות שעה 3 עבור דבק להקשיח לפני מילוי micropipette עם נוזל.
- הכנס microelectrodes (למשל, טונגסטן פלטינה מבודדת קוורץ זכוכית) לעמדות האחרות של מערכת ההקלטה לפני או לאחר כניסת micropipette.
2. הכנה והאלכוהול
- לעקר צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge לאחסון מאוחר יותר של פתרונות הזרקה באמצעות חיטוי או הליך אמין אחר.
- לשקול את hydrochloride סקופולמין חומר המקביל להכין 5 מ"ל של פתרון 0.1 טוחנת. ממיסים ב תמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl).
- תחת i בתנאים סטרילייםנה עשן מכסה מנוע, לסנן את הפתרון באמצעות מזרק מסנן עם קוטר נקבובי גדול מספיק, למשל, 0.2 מיקרומטר.
- מתחת למכסה המנוע קטר, aliquot הפתרון לתוך כרכים מספיק עבור ניסוי בודד, למשל, עבור סקופולמין, 500 μl בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge סטרילית. השתמש צינורות כהים כדי להגן על החומר מפני אור; לחילופין, לעטוף צינורות בנייר אלומיניום. לקבלת סקופולמין, לאחסן הפתרון עד 14 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
3. הכנת יומי של מערכת ההזרקה / הקלטה
הערה: כאשר מותקנים במערכת ההקלטה, אלקטרודות micropipette מאוחסנים פתרון אנזים (Tergazyme, 1 פתרון% עם מים ללא יונים) בין הקלטות. השלבים הבאים חייבים להתבצע לפני כל הקלטה.
- אסוף צינור של החומר להיות מוזרק. אפשר לו להגיע RT אם בקירור.
- לבטל את מערכת הזרקה / הקלטה מפתרון האנזים ולשטוף אלקטרודותו micropipette עם מים ללא יונים לנקות לחלוטין של פתרון האנזים.
- הסר את המכסה הקדמי של מערכת הקלטה כדי לבדוק חזותית את החותם בין micropipette צינור.
- החל שמן סיליקון סטרילי לפער צינור מדריך (ראה איור 1 א) וטיפים של אלקטרודות micropipette כדי לשמן את המערכת עבור תנועה חלקה.
- בדוק טיפים של אלקטרודות micropipette באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא שהם שלמים. יישר את האלקטרודות ואת micropipette מתחת למיקרוסקופ, כך שהם להאריך מתוך צינורות מדריך עם אותו אורך. כונן אותם לתוך צינורות המדריך, מפסיק ברגע שהם כבר לא נראים לעין. זה מוגדר עמדת אלקטרודה אפס. הגדר את עומק אלקטרודות micropipette ל -0 התוכנה.
- ממלאי מזרק סטרילי עם מי מלח סטרילית להכניס את המחט לתוך הצינור, נזהר שלא לחדור את החומה של הצינור. להסיע את micropipette מתוך צינור מדריך Visuשליטה אל זרימת החומר.
- סומק לפחות 2 מ"ל תמיסת מלח סטרילית דרך הצינור micropipette על מנת להבטיח שום האוויר נשאר בתוך המזרק או בצינור. אין להפעיל לחץ רב מדי על הבוכנה של המזרק. ודא את הצומת בין הצינור micropipette הוא חתום. אם הדליפה גלויה, מחדש להדביק את הצומת (ראה שלב 1.5) ולדחות הקלטה.
- ממלאי מזרק סטרילי חדש עם הפתרון להיות מוזרק ולהחליף אותו עם החבית של המזרק המלוח, כלומר, לשמור את המחט של המזרק מלא המלוח בצינור. יש לוודא שאין אוויר מועבר למערכת. זו מושגת הטובה ביותר על ידי מילוי רכזת המחט עם מי מלח לאחר הסרת החבית המלאה המלוחה.
- לרוקן את המערכת עם 250 μl של הפתרון להיות מוזרק, על מנת להסיר את מלוחים לחלוטין מהצינור.
- שימוש בתוכנת שליטה מוטורית, לחזור אלקטרודות micropipette לתוך guidetubesto לעומק של לפחות -500 מיקרומטר.
- מנמיכה את טבעת צינור מדריך (איור 1 א) לחלק התחתון של צינורות המדריך כדי לשמור על המיקום היחסי שלהם קבוע.
- נקה את הבסיס של המערכת עם אתנול, ובמיוחד כאשר זה ייגע לתא ההקלטה של הקוף.
- סגור את מערכת ההקלטה על ידי החלפת המכסה הקדמי הידוק הברגים.
4. אימות של מערכת ההזרקה
הערה: למרות שהחברה מכיילת את המערכת, מומלץ לאמת את הכרכים נפלטו עם החומרים המשמשים ניסוי ההגדרה (צינורות, מזרקים וכו ').
- הכן את המערכת כמתואר בשלב 3, שמירה אלקטרודות micropipette המורחבת מתוך צינורות מדריך. בעומק של לפחות 7,000 מיקרומטר מומלץ כדי למנוע אובדן של נפח המדידה עקב הידבקות לאורך המשטח החיצוני של micropipette ואלקטרודות.
- מניחים את מערכת ההקלטה במצב זה ישמש במהלך הניסוי וקבע syringe למשאבת microinjection. תקן את המזרק במקום באמצעות גומייה אחיזה מתכווננת (ראה איור 1 א). חלק את החלק הנע של המשאבה עד שהוא במקומו מאחורי הבוכנה של המזרק.
- באמצעות יחידת המנוע שבשליטת תוכנה, להוציא נפח גדול מספיק כדי למדוד בדייקנות, למשל., 1000 NL. עדיף להשתמש שלב אחד בלבד כדי להוציא את הנפח הכולל על מנת למנוע תופעות של פעולה נימי לאורך משטח micropipette. מהירויות נמוכות מאוד (1 NL / s) יכולות גם להוביל את האפקט הזה במהלך הליך האימות.
- אסוף את הנפח הכולל במיכל תחת micropipette, או בזהירות לאסוף את הירידה נפלט ישירות קצה micropipette. לאמוד את היקף נפלט בעזרת פיפטה ובין בהתחשב עם סולם דיוק.
- חזור על התהליך מספר פעמים כדי לאשר מדידות.
5. הקלטות חריפות
- לקבוע את מיקום XYשל מערכת ההקלטה. זה מגדיר את הנקודה שבה צינורות מדריך להגיע דורה מאטר בתוך חדר הקלטה מושתל כרוני. ודא צינורות המדריך הם חזרו בו לחלוטין (מיקום z צינור מדריך 0).
- תביאו את מערכת ההקלטה למצב ולמקם את המזרק משאבת microinjection. תקן את המזרק במקום באמצעות גומייה אחיזה מתכווננת (ראה איור 1 א). חלק את החלק הנע של המשאבה עד שהוא במקומו מאחורי הבוכנה של המזרק. אם ירידה של חומר גלוי בקצה של צינורות מדריך, בזהירות להסיר אותם באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי.
- הכן את החיה להקלטת בהתאם לנוהל של המעבדה (ראה 18 להנחיות למשל).
- מאובטח לעלות את מערכת ההקלטה על חדר ההקלטה של הקוף.
- לאט באופן ידני להוריד את צינורות מדריך החדרת ההקלטה עד להשגת הדורה, ואז לנסוע האלקטרודות באמצעות שיתוף המנועתוכנת ntrol.
- כמו כן, הוא לא ניתן למדוד עכבה של micropipette, כונן הראשון עם אלקטרודות ולבדוק העכבות שלהם באופן קבוע בעומקים שונים. לאחר חדירת הדורה מבוצעת בהצלחה מבלי לפגוע אלקטרודות, לקדם את micropipette.
- להסיע את האלקטרודות ואת micropipette לעומק אלקטרודה היעד שבו השטח של עניין המוח צפוי להימצא. לאט לקדם את האלקטרודה עד שהוא מספיק קרוב כדי להקליט את הפעילות של יחידה אחת, כפי שמעיד יחס אות לרעש טוב את האות המוקלט. חשוב לציין, למקם את האלקטרודה ההקלטה ואת micropipette באותו עומק על מנת להבטיח את המרחק המינימלי בין האלקטרודה micropipette.
- במידת האפשר, לשמור על אלקטרודות micropipette בעומק זה עבור הקלטת כולה. עם זאת, אם הדרך היחידה לשמור על איכות אות של התא רשם היא להעביר את האלקטרודות, ואז לנסוע את האלקטרודות ואת micropipetteבעת ובעונה אחת כדי לשמור על המרחק ביניהם.
6. שימו לב מרחבית משימות
- בסדרה של ניסויים, הוצגו שני דפוסי נקודה נעו על המסך, אחד ממוקם בתוך השדה הפתוח של הנוירון הקליט מבחוץ השניים של זה, יחד עם נקודת קיבעון הציגה מאתר מרכזי, החיה צריכה foveate לאורך כל ניסוי 19, 20.
הערה: הקוף הוא אימן להגיב שינוי כיוון בדפוס נקודות הרמז (במקרה היעד) תוך התעלמות כל שינוי כיוון בדפוס הנקודות האחר, והוא מתוגמל טיפת הנוזל על כל השלמה מוצלחת של ניסוי 19, 20. כתנאי שליטה חושיים, הקוף יש לדווח על שינוי בהיקות של נקודת הקיבעון תוך התעלמות הוא דפוסי הנקודה נעו (ראה איור 2 עבור תיאור מפורט יותר של המשימה).
7. מניפולציה תרופתית בזמן הקלטה
הערה: בעוד קוף ביצוע המשימה, להזריק את החומר באופן גוש-חכם. שלושה בלוקים רצופים מוגדרים: שליטה, אשר משמש כבסיס; זריקה, שבמהלכו חומר נפלט; התאוששות, שבמהלכו התאים ממוקדים ידי חזרת הזרקת לקו הבסיס.
- במהלך לחסום זריקה, להזריק כמות מוגדרת מראש של החומר במרווחי זמן קבועים למשל., 2 nl מכל רגע בשיעור של 2 s / NL. בדוגמה זו, השתמש hydrochloride סקופולמין. תהליך ההזרקה נשלט באמצעות תוכנה הספק אפשרויות שונות. לדוגמא, השתמש בפונקצית הצעד להגדיר עוצמת זריקה, ולחץ על כפתור זריקה מכל רגע על פי השעון של תוכנת הצריבה.
הערה: משך הזמן המדויק של גוש הזריקה היא חומר ולהתנסות תלויים, למשל, לשימוש סקופולמין 2 זריקות NL כל דקה במשך 10 דקות (20 nl בסך הכל).. עדיף שלא לקדם את האלקטרודות ואת דורי micropipetteng לחסום זריקה. - הערה הזמן והמשפט שבמהלכו החומר מוזרק, עומק אלקטרודות micropipette, כמו גם את כמות החומר נפלט.
- בצע את הבלוק הזרקה עם בלוק התאוששות, שבו אין חומר מוזרק. משך בלוק ההתאוששות הוא חומר ספציפי צריך להיות מוגדר ב-בדיקות טרום. לפקח ולשמור על איכות ההקלטה של יחידות בודדות שנבחרו עד סוף בלוק ההתאוששות.
- חזור על שלושה רחובות כל עוד את איכות ההקלטה ומוטיבציה של הקוף לאפשר.
8. ונהלי הקלטת ההודעה
- לאחר הקלטת נתונים, לחזור אלקטרודות micropipette לתוך צינורות מדריך ולאחר מכן באופן ידני לחזור בו צינורות המדריך. לבטל את מערכת ההקלטה מאולם ההקלטה של הקוף. שחרר את מזרק משאבת ההזרקה ולהעביר את המערכת לאזור ההכנה לניקוי.
- ידית החיה(כולל ניקוי של תא ההקלטה 18) על פי הנהלים הקבועים של המעבדה ולהחזיר אותו למתקן הדיור.
- יש לשטוף את החלק החיצוני של צינורות מדריך עם מי חמצן (3%) ולאחר מכן עם מים ללא יונים. אלקטרודות דרייב micropipette מתוך צינורות מדריך, לשטוף עם מי חמצן ומים deionized מכן.
- להחליף את הקנה של המזרק עם חבית מזרק המלא עם תמיסת מלח סטרילית, שמירת המחט בצינור. שטוף את הצינור ואת micropipette עם 1-2 מ"ל של תמיסת מלח. לאחר השטיפה, להסיר את החבית ולמלא אותו עם אוויר. הכנס מחדש את הקנה לתוך המחט ולייבש את הצינור ואת micropipette מבפנים על ידי דחיפת אוויר דרך בעדינות.
- אחסן את צינורות מדריך, אלקטרודות המורחבת micropipette שקוע בפתרון האנזים כדי למנוע התייבשות, כמו גם על מנת להבטיח את התפלגות החומר האורגני.
תוצאות
איור 2 מתאר את משימת תשומת לב מרחבית הקוף מבוצע תוך תהליך ההזרקה נערך. הקוף הוכשר לטפל גם הגירוי ממוקם בתוך השדה הפתוח של הנוירון המוקלט (להשתתף בפעילותו ב), הגירוי הממוקם מחוץ לשדה הפתוח (להשתתף-אאוט) או נקודת הקיבעון (להשתתף לתקן). תנאים אלה מאפשרים השוואה של פעילות עצבית במדינות קשב שונות.
איור 3 מראה היסטוגרמה זמן פרי-גירוי של נוירון מדגם ניסוי בעזרת סקופולמין, אנטגוניסט כולינרגית מוסקריניים. העלילה מדגימה דיכוי התגובה במהלך הזרקת סקופולמין מול שום זריקה, כאשר דפוס נע בכיוון המועדף של התא מוצג בתוך השדה הפתוח של הנוירון והוא בהשתתפות החיה. שתי הפסגות הראשונות לייצג הנוירון9; s בתגובה וחוץ קיזוז קיו מרחבית, המופיע בתוך השדה הפתוח שלה. זה ואחריו התגובה לדפוס המרגש המופיע על המסך 500 מילישניות לאחר תחילת קיו. האזור המוצל האפור מתאר ניתוח התקופה ששמשה לחישוב קצב ירי הממוצע עבור כל בדיקה. האזור הירוק מדגיש השפעה המדכאת של הזרקת סקופולמין על קצב הירי של התא. האזור הירוק הכהה מראה את הדיכוי בתוך ניתוח התקופה.
איור 4 א מראה את ההשפעה של סקופולמין על קצב ירי הממוצע של הנוירון מדגם בכל אחד משלושת תנאי הקשב. השיעור של ירי נוירון לשני תנאי הלב מרחבית (לב בתוך או מחוץ לשדה הפתוח של הנוירון ההקלטה) וכן על מצבו החושי (תשומת לב בשלב קיבוע) ירדה זמן קצר לאחר הזריקה הראשונה של בלוק ההזרקה (מוצל אפור הואא) ובמהלך לחסום ההתאוששות גדל באיחור לאותה רמה כמו לפני הזריקה.
איור 4B מראה שליטת הקלטת נוירון דגימה שנייה שבה מלוח (0.9% NaCl) שהוזרק, באמצעות בפרוטוקול זהה עבור הזרקת סקופולמין. במהלך ההזרקה לחסום כל שינוי קצב הירי של נוירון נצפה לעומת דבוקת השליטה.
איור 1. קמה המשמשת מניפולציה תרופתית בעת ההקלטה. (א) מתארת את משאבת microinjection ומערכת הקלטת אלקטרו מצוידת אלקטרודות micropipette. הפער guidetube, שלתוכו שמן סיליקון מוכנס לשמן את אלקטרודות micropipette, מוצג מוגדל. (B) מציג micropipette למשל (לעיל)אלקטרודה הקלטה (להלן). לשם השוואה גודל, אגורה האירו (קוטר: 16 מ"מ). הוא ממוקם מתחת אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. עיצוב משימות כדי להנחות את תשומת מרחבית. קופים אומנו לזהות שינוי כיוון תנועה בדפוס נקודות הרמז. קיו הוצב גם בתוך שדה פתוח של הנוירון (להשתתף בפעילותו ב), כפי שמוצג באיור, או מחוצה לו (להשתתף-אאוט). כביקורת חושית, הוכשר הקוף כדי לזהות שינוי בהיקות של נקודת הקיבעון (להשתתף לתקן). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
< img alt = "איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 53,724 / 53724fig3.jpg" />
איור 3. השפעת סקופולמין אנטגוניסט על ירי שיעור. ההיסטוגרמה זמן פרי-גירוי של נוירון מדגם מוצג עבור להשתתף בפעילותו במצב (לב בתוך שדה פתוח של הנוירון מוקלט) במהלך לחסום זריקה ובמהלך דבוקת שליטה. ציר ה- X מתאר את הזמן באלפיות השנייה לאחר הופעת קיו ואת ציר y מראה את קצב ירי קוצים / sec. האיזור האפור מתאר ניתוח תקופה (300-800 מילישניות לאחר הופעת גירוי) המשמשת לחישוב שיעור ירי ממוצעים לדין. האזור המוצלל הירוק מראה דיכוי בירי שיעור על פני שני התנאים. הצבע הירוק הכהה מדגיש את הדיכוי בתוך ניתוח התקופה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Iles / ftp_upload / 53,724 / 53724fig4.jpg "/>
איור 4. השפעת סקופולמין ומליחות על ירי שיעור. (א) הזרקה סקופולמין אנטגוניסט. שיעור ירי ממוצעי משפטו של התא מדגם מתרשים 3 במהלך הניסוי הוצג עבור הגירוי המועדף עבור כל שלושת תנאי הקשב. ציר ה- X מתאר את שעת ההתחלה לדין דק ואת ציר y מראה את קצב הירי של יחידת קוצים לכל שניות. סמלים ( 
להשתתף בפעילותו ב, 
להשתתף בפעילותו לתקן, 
להשתתף-אאוט) מייצג את קצב הירי של נוירון בתוך תקופת הניתוח בכל משפט בצע בהצלחה, קווים אופקיים (קו מוצק: להשתתף בפעילותו ב, קו מקווקו: להשתתף לתקן, קו מקווקו: להשתתף-אאוט) להראות קצב ירי ממוצע עבור שלושה bl ניסויים שוניםocks (שליטה, זריקה, התאוששות). האזור המוצל האפור מציג את גוש ההזרקה, החל הזריקה הראשונה וכלת 1 דקות לאחר ההזרקה האחרונה. במהלך זריקת החסם 2 nL של 0.1 סקופולמין טוחן הוזרק מכל רגע עם מהירות זריקה של 2 s / NL. (ב) הזרקת תמיסת מלח. שיעור הירי של תא מדגם במהלך הניסוי המלא מוצג עבור הגירוי המועדף עבור כל שלושת תנאי הקשב. גריי מוצל באזור מדמיין את גוש הזרקת מי מלח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דיון
כאן אנו הדגמנו בפירוט כיצד לבצע זריקות אמינות ומדויקות והקלטות תא בודד באיכות גבוהה עם מערכת הזרקה בלחץ "ה- off- המדף". למרות ששיטה זו של אספקת סמים בעבר נעשתה שימוש מתנהג קופים (הנסקרת ב 17), המערכת הציגה יש כאן יתרונות, להלן סקירה.
כמו באיור 4 א, המערכת המתוארת כאן יכולה לספק מדידה יציבה של פעילות נוירון בודדת עם ובלי זריקות תרופתיות בסביבה הישירה של אתר ההקלטה. כפי שניתן לראות בתרשים 4 ב ', ההזרקה של שליטה בחומר, מלוח, לא להוביל לשינוי בירי שיעור. שליטה זו ממחישה כי תהליך ההזרקה עצם אין השפעה מדידה על נכסי הירי של נוירונים המוקלטים.
התצורה המרחבית של נוירון, אלקטרודה הקלטה, micropipette הוא של מכריע חשיבות בניסויים אלה. למרות מדידה מדויקת של עמדות ביחס שלהם בתוך הרקמה במהלך ההקלטה אינה אפשרית, אנחנו יכולים לשקול ובקרת מקורות אפשריים של שונות. ראשית, במהלך הזרקת נפח קיים סיכון כי הנוירון של עניין עשוי להיות שנעקר מן האלקטרודה ההקלטה, להם השלכה על איתנותו של אותות רשמו. מסיבה זו הוא פקח כדי להשוות את קצב הירי לפני ואחרי לחסום זריקה כדי לוודא את יציבותה אות. שנית, תצורת צינור מדריך של שיטת הרישום מגדירה את המרחק בין אלקטרודות micropipette (למשל., 305 מיקרומטר במערכת 3 ערוצים קונצנטריים השתמש בניסוי זה). כמו המערכת מספקת שליטה על מיקום מדויקת של עומק אלקטרודות micropipette בתוך הרקמה, המרחק ביניהם ניתן למזער על ידי כיול עומק ביחס בקפידה לפני ההקלטה (שלב 3.5), ושמירה על אותם בעומק נפוץ במהלך הקלטות.
אף אוזן גרון "> מגבלות פוטנציאליותבנוסף בקרת איכות ללא צורך במיקור חוץ על ידי היצרן, המערכת צריכה להיות מאומתת בתנאי מעבדה, כמו סוגים שונים של צינורות, מזרקים וכו 'יכולים לשמש עלול להוביל הבדלים בהיקפיים נפלט. למרות המערכת יכולה לשמש כדי להזריק כמויות קטנות מאוד כמו בניסוי המוצג כאן, אלה הם מתחת ההיקף המינימאלי שניתן תוקף בשל מגבלות מדידה מעשיות בסביבת מעבדה רגילה. עם זאת, כרכי הזרקה גדולים יכולים לשמש כדי להסיק את היחס בין הנפח מוגדר תוכנה בהיקף נפלט על ידי החומרה. אם צינורות שקופים משמשים, בדיקה חזותית נוספת של תהליך ההזרקה אפשרית על ידי מדידת התזוזה של סמן חזותי.
הכנסת micropipette לתוך המערכת היא יותר תובענית מאשר החדרת אלקטרודה, כמו הקוטר של micropipette הוא מעט גדול יותר ואת החומר הוא יותר שביר. בנוסף,הצטרפותו הצינור לפין של micropipette היא מאתגרת שכן יש בה סיכון גבוה לשבור את החלק העליון של micropipette. עם זאת, אורך החיים של micropipette נטען בהצלחה הוא מספר חודשים, אפילו עם לשימוש יומיומי.
בפועל, אנחנו עדיין לא נתקלנו סתימה במערכת ההזרקה במהלך הניקוי-הקלטת פוסט של המערכת. אף על פי כן, אין בדיקה "מקוונת" אפשרית, קיים סיכון כי חסימה פיזית (כגון רקמה על קצה micropipette) עשויה למנוע הזרקת חומר. זה יכול אפוא להיות רצוי לנתח את הנתונים באופן שמרני, כגון כולל רק אותם התאים לניתוח נוסף המראים שינויים משמעותיים ירי שיעורים בין בלוקים מלאי הזרקת הניסוי.
למרות הקוטר הקטן שלהם, microelectrodes ו טפטפות יתפוס את מקומו של רקמת המוח ועלול לגרום נזק לרקמות מקומיות. זה יכול להיות ממוזער באופן ידני על ידי צבת הקצה הדואר מדריך צינורות בדיוק מעל דורה מאטר. האלקטרודות ואז לחדור הדורה התקינה שלהם הוא להסיק על ידי מדידת העכבות שלהם באינטרנט. לאחר מכן, micropipette מוכנס. בעת השימוש בגישה זו, הסרה קבועה של רקמה מעל הדורה מומלצת לצמצם עוד יותר את הסיכון של שבירת אלקטרודה או טפטף.
השוואה לשיטות חלופיות
המערכת המשמשת כאן מראה יתרונות ברורים בהשוואה למערכות הזרקה בלחץ אחרות. יתרון חזק אחת הוא בקוטר של micropipette (כ 100 מיקרומטר), אשר הוא חצי בגודל של בדיקות זמינות אחרות 17 ולכן ממזער את ניזק רקמה עצבי. בניגוד עיצובים קודמים, המערכת הנוכחית מעסיקה מופרדים מרחבית אלקטרודה הקלטה micropipette. בעוד שמערכות אחרות לספק מרחק קטן יותר בין האלקטרודה פיפטה, המערכת המתוארת כאן מאפשרת שינויי עומק עצמאיים של אלקטרודות פיפטה, ובכך permitting מרחקים יחסיים משתנים בתוך הקלטות. חשוב לציין, ללא פשרות לגבי איכות הקלטה צריכה להיעשות, כמו מערכת ההזרקה הוא רחבה של מכשיר הקלטה הוקם. בעוד רק micropipette אחד ובכך חומר אחד משמש פרוטוקול זה, אפשר להזריק מספר חומרים בתוך הליך ניסיוני אחד. כדי להשיג זאת, כמה micropipettes ניתן מושחל לתוך צינורות מדריך נפרדים ומחובר המזרקים רכובי משאבות הזרקת פרט. לבסוף, שליטה על המערכת קלה, כמו שרק תוכנת מחשב אחד נדרשה כדי לקדם את אלקטרודות micropipette, וכדי לבצע את ההזרקה בלחץ במהלך הניסוי.
השוואת הזרקה בלחץ כדי iontophoresis, יש יתרונות וחסרונות יחסיים. לדוגמא, הזרקה בלחץ דורשת כמויות יותר יוכנסו הרקמה מ iontophoresis, ובכך מגדיל את הסיכון של עקירה עצבית. פרוטו הנוכחיcol בשימוש כרכים בטווח NL, ואנחנו כמעט ולא חווינו שינויים מורגשים בתוך איכות האות של תא מוקלט. המערכת גם מאפשרת נפחים גדולים יותר להיות מוזרקים, וזה שימושי פוטנציאלי עבור מניפולציות התנהגותיות אבל יכול להשפיע על יציבות של הקלטה עצבית. יתרון ברור של הזרקה בלחץ מעל iontophoresis הוא המגוון הגדול יותר של חומרים שמישים כמו אין דרישה להשתמש בחומרים טעונים. עם זאת, ערכי ה- pH צריכים להיבדק ומשווים בין חומרים ניסיוניים ובקרה (למשל., מלוח).
השאלה שעלולה להתעורר למה להשתמש בשיטה הוותיקה של הזרקה בלחץ במקום טכניקות חדשות יותר כגון optogenetics מניפולצית פעילות עצבית. למרות וותיקה במכרסמים, optogenetics כי לא נקבע עדיין מהימן בקופי רזוס. בפרט, זה אינו מאפשר המניפולציה המקומית של תאים סלקטיבי לסוג הנוירוטרנסמיטר בפרט. בטווח הארוך יותר, אנו רואיםפוטנציאל גדול עבור שילוב היתרונות של מניפולציות תרופתיות עם היתרונות של מניפולציות optogentic הבהרת הבסיס העצבי של תפקודים קוגניטיביים.
הנה הראינו כיצד הזרקה בלחץ יכולה לשמש פרמקולוגית לתפעל אזור מקומי מוגבל במוח של ער, מתנהגת קופי רזוס. אנו מקווים כי שיטה זו מעניקה השראה למדענים אחרים כדי לחקור תרומות neuromodulatory לדינמיקה של פעילות עצבית.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft דרך מרכז שיתופי מחקר 889 "המנגנונים התאיים של בעיבוד החושי" ל- ST (פרויקט C04). אנו מודים סינא פלומר, לאונור Burchardt, דירק Prüsse, קלאוס Heisig ואת ראלף Brockhausen לתמיכה טכנית חיה הקשורות ומשתפי הפעולה שלנו ביחידה תאי גזע של מרכז הפרימאטים הגרמני, ד"ר קתרינה Debowski ואנה Magerhans עבור סיוע טכני תהליך סינון.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (-)-סקופולמין הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 55-16-3 | מר 339.81 גרם/מול |
| NaCl 0.9% | ב. בראון Melsungen AG | 3079870 | 5 מ"ל |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 אנזים דטרגן | |
| מי חמצן | Roth | משמש בתמיסה של 3% עם מים נטולי יונים | |
| אתנול | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| מים | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | מזרק ומחט |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf Safe-Lock, ענבר | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | תומס הקלטה | ||
| אלקטרודה הקלטה | תומס הקלטה | אלקטרודה סיבי קוורץ/פלטינה-טונגסטן; ערך עכבה 1-2 MΩ ו-0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | גודל: 0,25 x 2,05 מ"מ (Wd: 0,9 מ"מ) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | |
| Superglue שמן סיליקון | תומס הקלטה | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761----------R | מסנן מזרק |
| רב ערוצי מערכת מיקרו הזרקה | תומס הקלטה | מניפולטור מיקרואלקטרודות רב ערוצי " מערכת אקהורן" מצויד במיקרואלקטרודות ומיקרו-פיפטות ומשאבת מיקרו-הזרקה רב-ערוצית מדויקת | |
| פנימית מותאמת אישית | McLab | לשליטה בהצגת גירויים |
מקורות
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M. Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , Available from: http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
הדפסות חוזרות והרשאות
