Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

סיכום

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

תקציר

יש רצון גובר במדעים הביולוגיים והקליניים לשלב ולתאם סוגים מרובים של ביומולקולות כדי לפענח ביולוגיה, להגדיר מסלולים, לשפר את הטיפול, להבין מחלות ולסייע בגילוי סמנים ביולוגיים. גליקוזילציה מקושרת ל-N היא אחד השינויים החשובים והחזקים ביותר לאחר תרגום בחלבונים ומווסתת תפקודי תאים קריטיים כגון איתות, הידבקות ותפקוד אנזימטי. טכניקות אנליטיות לטיהור וניתוח N-גליקנים נותרו סטטיות יחסית בעשור האחרון. למרות שהם מדויקים ויעילים, הם בדרך כלל דורשים מומחיות ומשאבים משמעותיים. למרות שפותחו כמה תוכניות טיהור בתפוקה גבוהה, הן עדיין לא זכו לאימוץ נרחב ולעתים קרובות מסתמכות על העשרת גליקופפטידים. שיטה מבטיחה אחת, שפותחה על ידי תומס-אוטס ואחרים, הפרדת N-גליקן בעזרת מסנן (FANGS), הודגמה באופן איכותי על רקמות. כאן, התאמנו את FANGS לפלזמה וחיברנו אותו לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד על מנת להשיג כימות יחסי מדויק על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית ויינון משופר של אלקטרוספרי. יתר על כן, עיצבנו פונקציונליות חדשה לפרוטוקול על ידי השגת ניתוח אתר טנדם, פרוטאומיקה של רובה ציד וגליקוזילציה בפלזמת תרנגולות. הראינו ש-N-גליקנים מטוהרים על מסנן ונגזרים על ידי תגי הידרזיד הידרופוביים היו דומים מבחינת השפע והמעמד לאלה על ידי מיצוי פאזה מוצקה (SPE); האחרון נחשב לסטנדרט זהב בתחום. חשוב לציין, השונות בשני הפרוטוקולים לא הייתה שונה סטטיסטית. נתונים פרוטאומיים שנאספו בהתאמה לנתונים גליקומיים היו בעלי עומק זהה בהשוואה לעיכול טריפסין סטנדרטי. הפחתת פפטידים ממוזערת בפרוטוקול, ומגבילה את ה-deamidation הלא ספציפי שזוהה במוטיבים של גליקוזילציה. זה איפשר ניתוח ישיר של אתר גליקוזילציה, אם כי הפרוטוקול יכול להכיל גם תיוג של ^{אתר 18}O. בסך הכל, הדגמנו פרוטוקול חדש מבוסס תפוקה גבוהה, בלתי מוטה, מבוסס מסנן לגליקומיקה כמותית וניתוח פרוטאומיקה.

מבוא

בתחום חקר חלבונים, הכנת מדגם בעזרת מסנן (FASP) אומצה באופן נרחב על יכולתו כדי למזער את הכמות של חומר מוצא, להקטין חפצי הכנת מדגם, וכן למקסם את תפוקת מדגם ^1. עם זאת, שיטה כזו אמורה לצמוח ולהשיג מתיחה לתחום glycomics. פיתוח של תפוקה גבוהה, זרימות עבודה כמותיים נדרשות בגלל התפקיד האינטגרלי של glycosylation בהגנה ביולוגית האפנון על ידי סרטן או מחל ^2,3. ביונקים, -glycans N מורכבים חוזר יחידות saccharide (hexoses (Hex), hexosamines (HexNac), חומצות sialic (NeuAc), ו fucoses (FUC)), אשר לקשט מבנה הליבה (Hex ₃ HexNac ₂₎ ⁴ קוולנטית כבול כדי asparagine. למרות glycospace הוא גדול משמעותית כאשר איזומרים נספרים (> 10 ^12), הוא קטן למדי על בסיס הרכב ומשקל מולקולרי בדרך כלל נע בין 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. ההומוגניות ההלחנה של המעמד ואת hydrophilicity של גליקנים אתגרים ייחודיים טיהור, הפרדה, ו ספקטרומטריית מסה (MS) זרימות עבודה ^6.

באופן מסורתי, -glycans N מתעכלים מחלבונים או פפטידים על ידי peptide- N -glycosidase F (PNGase F) והעשירו מכן על ידי זיקה לקטינים כרומטוגרפיה ^7, שנתפסו על ידי חרוזים hydrazide ^8, או מטוהרים באמצעות מיצוי שלב מוצק (SPE) ^9,10. בעוד שיטות אלה הן כל יעילות, הם מציגים שלבים נוספים עבור desalting ולהגביל את מספר דגימות מעובד בו זמנית. בעשור האחרון, מספר רב של פלטפורמות תפוקה גבוהה עבור glycomics הוצע. קים et al. מפרסמת שיטה חצי אוטומטית באמצעות מופעלי ואקום, 96-גם צלחת SPE ^11. לחלופין, שיטת זיקה-מסנן (N -glyco-FASP) פותחה על ידי קבוצת מאן, אשר חייבה את derivatization הראשונית של fiLTER עם שילוב של לקטינים ^12. לבסוף, הקבוצה תומאס-אוטס הציע שיטה כמותית למחצה, מסנן בעזרת N -Glycan ההפרדה (ניבים), אשר ניצלו את גודל הרכב הצר של glycospace ^13. בהסתמך על מסנני משקל מולקולרי חתוכים, מזהמים קטנים נשטפו ראשון לבזבז ואז -glycans N היו מתעכלים eluted. חלבונים Deglycosylated להישאר על המסנן בפרוטוקול זה ואת יכולה להיות נתונה FASP ב-קו.

זיהוי וכימות של גליקנים על ידי יינון electrospray (ESI) MS דורשים off-line פרדות עבור (חלקית) ברזולוציה של איזומרים derivatization לגילוי של מינים נמוכים בשפע. תיוג של האינדיבידואליות כאשר נרמול עם האסטרטגיה תגי hydrazide glycan מקנה תאימות עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה פאזיים (RPLC) ^14,15. 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) תג הידרופובי מתווך hydrophilicity של גליקנים, enhancing יינון ידי, בממוצע, פי ארבעה ^16. למרות טכניקות אחרות, כגון permethylation ¹⁷ או אמין-reactive כימי תיוג ^18, מציעות יתרונות דומים, תגובת hydrazide, גליקנים מגיבים 1: 1 stoichiometrically בתנאים קלילים. כימות יחסית מושגת על ידי ניתוח טנדם של דגימות derivatized עם הילידים (NAT) או ¹³ תוויות איזוטופ סטאבילה C ₆ (SIL).

השיטה הבאה מתפתחת ניבים ליישומי פלזמה וזוגות אותו אל תג הידרופובי P2GPN כימות ביחס מדויק. יתר על כן, היא תוכננה לבצע חקר חלבונים רובה הציד, פרופיל deamidation, ו glycomics כמוני על aliquot יחיד של מדגם, מבלי להתפשר על שלמות הניתוחים.

פרוטוקול

חלבון 1. גליקופרוטאין Denaturation ו אלקילציה

1. תכשירים סטנדרטיים, עומס 2.5 μl של פתרון 0.1 מיקרוגרם / μl של גליקופרוטאין (למשל Fetuin או RNase B) על 30 kDa או 10 משקל מולקולרי kDa (MW) חתוכים מסננים.
   1. לקבלת דוגמיות פלזמה ביולוגיות, לבדוק את ריכוז החלבון על ידי ²⁰ חומצת תקן ברדפורד ¹⁹ או bicinchoninic (BCA) assay חלבון. לדלל את הפלזמה, במידת הצורך, עם אמוניום ביקרבונט 100 מ"מ (NH ₄ HCO ₃₎ ב H ₂ O (Buffer Digest PNGase) ב- pH של ~ 7 להכיל בין 10-100 מ"ג / מ"ל החלבון הכולל. פלזמה טען 2.5 μl (25-250 חלבון מיקרוגרם) על מסנן.
      הערה: פרוטוקול זה נבדק רק על פלזמה מדגימות דם שנאספו בנוכחות חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
2. הוסף 2 μl של 1 M Dithiothreitol פתרון (DTT) לדגום כל במסנן.
3. לדלל את המדגם עם 200 μl PNGase לעכל חיץ.
4. כיסוי או צינור מסנן מדגם מערבולת בקלילות, נזהר שלא להפריע את המסנן ממקומו שלה. דגירת המדגם ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לפגל חלבונים גליקופרוטאינים.
5. כדי alkylate הדגימות, להוסיף 50 μl 1 M iodoacetamide, לתת ריכוז סופי של ~ 200 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
   הערה: אם הניתוח פרוטאומיקה אינו רצוי, צעד 1.5 ניתן לדלג.
6. תתרכז גליקופרוטאין מפוגל על ​​המסנן על ידי צנטריפוגה דגימות ב 14,000 XG במשך 40 דקות. וזורקים לזרום.

2. N -linked עיכול אנזימתי glycan

1. לשטוף את המדגם עם 100 μl PNGase לעכל חיץ. תתרכז גליקופרוטאין על המסנן 14,000 XG במשך 20 דקות וזורקים לזרום.
   1. חזור על השלב לשטוף ותרכיז פעמים, עבור סכום כולל של שלוש פעמים, מניב להתרכז בהיקף המת המסנן (~ 5 μl). מחק את כללזרום דרך.
   2. בקבוקון אוסף מחק פעם השטיפות הושלם. לאסוף את כל eluents ושוטף בעתיד בבקבוקון הקולקציה חדש.
      הערה: PNGase לעכל חיץ H ₂ O ¹⁸ ניתן להשתמש במהלך שלב עיכול PNGase F תיוג איזוטופ יציב של אתרי asparagine-glycosylated דה, אשר הופכים כימי deamidated.
2. הוסף 2 μl של נטול גליצרול PNGase F (75,000 x יחידות / מ"ל) כדי לסנן אחרי שעברה בקבוקון אוסף טרי. להוסיף 98 μl של PNGase לעכל חיץ, להביא הנפח הכולל עד 100 μl, ו פיפטה בעדינות מעלה ומטה על מסנן לערבב. Enzymatically לעכל את גליקנים בתנאים בצעדים 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 או.
   הערה: שלוש שיטות עבור deglycosylation של חלבונים ניתן להשתמש. לניתוח glycomics בלבד (לא חקר חלבונים), הדגירה הארוכה בשלב 2.2.1 מומלצת. למחקר glycomics ו פרוטאומיקה, צעדים 2.2.2 ו -2.2.3 יפיק פפטידים באיכות גבוהה עם אי-sp מינימליdeamidation ecific.
   1. Glycomics בלבד פרוטוקול העיכול (18hr): דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כדי לבקע enzymatically כל -glycans N.
   2. ספייק-בפרוטוקול העיכול (SPI): דגירה דגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. עבודה במהירות, להסיר דגימות ספייק בתוך μl 2 נוספות של F PNGase ללא גליצרול (75,000 x יחידות / מ"ל). קלות המערבולת דגימות במשך 1-2 שניות כדי לערבב. דגירת הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך שעה 2 נוספת.
   3. פרוטוקול עיכול מיקרוגל (MD): דגימות מקום במעמד צף microcentrifuge צינור. דגימות Float בכוס L 1 מלא 1 ליטר של מים deionized (DI). מניחים את הכוס במרכז במיקרוגל (950 W) עם צלחת מסתובבת. מיקרוגל בהספק 60% (570 W) במשך 5 דקות. כדי לקרר, להסיר דגימות וחזקות בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. ואז במיקרוגל במשך 5 דקות נוספות בהספק 60%.
      הערה: הגדרות צריכת חשמל מיקרוגל תצטרכנה להיות מותאמות על בסיס עוצמת השידור המרבי של במיקרוגל.הספק ממוצע צריך להיות מוחזק קבוע בין הדגמים.

3. Elution של N -glycans

1. Elute גליקנים על ידי צנטריפוגה מדגם ב 14,000 XG במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
2. הוספת 100 μl של PNGase לעכל חיץ לפילטר צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. אסוף לשטוף המכילים כל שנותר N -linked glycan, באותו בקבוקון אוסף כמו eluent. חזור פעמיים. הסר מסנן ומכניסים בקבוקון אוסף חדש.
3. דגירה דגימות glycan במקפיא -80 ° C עד (דקות 30-60) קפוא. יבש עד להשלמתו, בטמפרטורת החדר, ב concentrator ואקום (4-6 שעות).
   הערה: N -glycans עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים לפני derivatization.

4. חלבון עיכול FASP

הערה: אם פרוטאומיקה או deamidation באתר ניתוח אינו רצוי, סעיף 4 של הפרוטוקול ניתן לדלג.

1. לשטוף tהוא לסנן, המכיל פפטידים deamidated, עם 400 μl של חיץ 8 אוריאה ז. כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב. תתרכז המסנן 14,000 XG במשך 15 דקות. מחק את כל הזרימה דרך.
   1. חזור על שלב 4.1 פעמים נוספות, עבור סכום כולל של שטיפות חיץ שלוש אוריאה.
2. יש לשטוף את המסנן, המכיל פפטידים deamidated, עם 400 μl של 2 M אוריאה, 10 מ"מ CaCl ₂ חיץ (טריפסין לעכל חיץ). כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב. תתרכז המסנן 14,000 XG במשך 15 דקות. מחק את כל הזרימה דרך.
   1. חזור על שלב 4.1 פעמים נוספות, עבור סכום כולל של טריפסין שלוש לעכל שוטף חיץ.
   2. בקבוקון אוסף מחק פעם השטיפות הושלם. לאסוף את כל eluents ושוטף בעתיד בבקבוקון הקולקציה חדש.
3. הוסף 50 μl טריפסין החזירי שונה בתוך 1:50 או 1: טריפסין 5: חלבון (w / w) יחס לניסויי גילוי או פרוטאומיקה כמוני, בהתאמה.כיסוי או בקבוקון אוסף קלות המערבולת לערבב.
4. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. עבודה במהירות, להסיר דגימות ספייק בתוך 50 μl נוספים של טריפסין על 1:50 או 1: יחס חלבון: טריפסין 5. קלות המערבולת דגימות במשך 1-2 שניות כדי לערבב. דגירת הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך שעה 2 נוספת.
5. Elute פפטידים על ידי ספינינג ב 14,000 XG במשך 15 דקות.
6. שוטפים את פפטידים הנותרים ממסנן עם 400 μl 1% חומצה פורמית 0.001% Zwittergent 3-16 (חיץ להרוות). Elute את המסנן על ידי ספינינג ב 14,000 XG במשך 15 דקות.
7. לכמת את ריכוז הפפטיד בדגימות על ידי ברדפורד ¹⁹ או BCA assay ^20.
8. דגירת דגימות פפטיד מקפיאה -80 מעלות צלזיוס עד קפוא (30-60 דקות). יבש עד להשלמתו, בטמפרטורת החדר, ב concentrator ואקום (4-6 שעות).
   הערה: פפטידים יבשים ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
9. Resuspend חלבונים tryptic רק לפני Liquiד-כרומטוגרפיה המוני ספקטרומטריית (LC-MS) ניתוח אצטוניטריל 2%, 98% H ₂ O, ו -0.1% חומצה פורמית (שלב א נייד) לריכוז רצוי. ריכוזי הפפטיד tryptic מטווח פלזמה 2.5 μl מ 100 - 300 ננוגרם / μl.

Derivatization 5. N -linked גליקנים עם הידרופובי Hydrazide תגיות

1. לשקם קל או כבד מיובש (SIL) (NAT) ריאגנטים P2GPN ב 1 מ"ל של 75:25 MeOH: חומצה אצטית (פתרון derivatization), ריכוז סופי של 0.25 מ"ג / מ"ל. ריאגנטים ייקחו עד 10 דקות כדי solubilize מלא. מערבולת נרחבת כדי להבטיח solubilization מלא.
   הערה: במקרה פרוטוקול derivatization זה נמצא בשימוש עם -glycans תקן N, לעומת גליקנים מטוהרים, היחס הטוחן של P2GPN: glycan צריך להיות כ (ולא פחות) מ -17: 1.
2. תג יבשים N -glycans עם 200 μl (50 מיקרוגרם) של מגיב SIL או NAT P2GPN. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend גליקנים יבשים. sa וורטקסmples ואז ספין למטה דוגמאות ~ 5 שניות על צנטריפוגות הספסל העליון.
3. מגיב גליקנים עם ריאגנט עבור 3 שעות ב 56 מעלות צלזיוס.
4. מיד להעביר גליקנים מן החממה עד concentrator ואקום. יבש עד להשלמתו על 55 מעלות צלזיוס (3-5 שעות).
   הערה: שלב זה מרווה התגובה derivatization; חייב להיות המדגם יבש לחלוטין למנוע תגובתיות צולבת בשלבים הבאים.
   הערה: יבשים, מתויג דגימות עשויות להיות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
5. Resuspend מתויג N -glycans ב 25-50 μl של H ₂ O רק לפני ניתוח LC-MS. פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח -glycans N הם solubilized לחלוטין.
   הערה: היקף עבור resuspension הוא תלוי בריכוז ההתחלתי של גליקופרוטאין, אשר עשוי להיות מוערך מן הריכוז המוצא חלבון. עם זאת, בטווח ישתנה לפי סוג מדגם צריך להיות מותאם באופן אינדיבידואלי.
6. דגימות צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant, נזהר לא לתת את קצה פיפטה לגעת התחתון של הצינור צנטריפוגות.
   הערה: תג עודף לא יכול להיות גלוי לעין, אך יופחת על ידי צנטריפוגה.
7. שלב זוג דגימות NAT ו- SIL, אם תרצה בכך כימות יחסית, ביחס של 1: 1 לניתוח טנדם.

6. Ultra-בלחץ גבוה כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: תנאי LC ו- MS תארו קלים nLC-1000 ושדה גבוה Q Exactive, בהתאמה, היו אופטימיזציה ללא צורך במיקור חוץ עבור ניתוח proteomics ו לניתוח glycan ^21. תנאים אלו יכולים להיות מותאמים למערכות LC גבוהות במיוחד pressure- או ננו אחרות ספקטרומטרים המוניים כוח גבוה בפתרון אחרים אבל עשוי לדרוש שינויים קלים. השימוש ספקטרומטריית מסה מתח גבוה בפתרון הכרחי לזיהוי glycan וניתוח deamidation ^22,23.

הערה: שלבי 6.1-6.3 יכול להיות יםkipped אם כרומטוגרפיה הפוכה פאזיים מתאים או מלכודת ועמודה מסחרית אינטראקצית הידרופילי משמשות.

1. לסנתז frit ב נימי 100 מיקרומטר מזהה פי Meiring et al. ²⁴ לשימוש כמלכודת.
2. ארוז את המלכודת בלחץ עם 2.6 מיקרומטר, 100, חומרי אריזה C ₁₈ ופצע באורך של 5 סנטימטר.
3. לארוז טור פולט מזהה 75 מיקרומטר תחת לחץ עם 2.6 מיקרומטר, 100, חומרי האריזה C ₁₈ ופצע באורך של 30 ס"מ.
4. הכינו שתי שיטות LC-MS שונה עבור פרוטאומיקה (6.4.1) ו glycomics (6.4.2) זרימות עבודה.
   הערה: חלבון דגימות glycan ניתן לרוץ על ההתקנה מלכודת / עמודה זהה בכל סדר.
   1. לניתוח חלבונים, להזריק ~ 400 ng של חלבון על הטור בשלב נייד (MPA). הפעל את המדגם ב 300 NL / min, לפי טבלה 1, עם איזון 1 μl מראש הטור (500 הבר) וכן איזון עמודה 5 μl אנליטיים(500 בר). ליינן חלבונים בתנאי MS הניתנים בטבלה 2.
   2. לניתוח glycan, להזריק 5 μl של resuspended, P2GPN מתויג NAT / SIL דגימות equimolar על הטור. הפעל את המדגם ב 300 NL / min, לפי טבלה 3, עם איזון 2 μl מראש טור (500 בר) וכן איזון טור אנליטי 5 μl (500 בר). ליינן גליקנים בתנאי MS הניתנים בטבלה 4.

זְמַן	MPA%	MPB%
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

טבלת 1. תנאי LC לניתוח proteomic. Elution שיפוע עם B שלב נייד (MPB, 98% אצטוניטריל, 2% H ₂ O, 0.1% חומצה פורמית) בוצעו על מנת elute פפטידים עבור פרוטאומיקה-רובה ציד, נתוני רכישה תלויה , ניסויי MS.

פרמטרים MS 1
Mass טווח (Th)	375-1500
הַחְלָטָה	120,000
AGC	1 × 10 6
מקס יינון זמן	30
S-Lens FR רמה	55
נימי TemPC)	300
תרסיס מתח	1.75
פרמטרים MS 2
סוג הרכישה	Top20
הַחְלָטָה	15,000
AGC	1 × 10 5
מקס יינון זמן	30
יחס underfill	2%
חלון בידוד (ה ')	1.4
הרחקת מדינת תשלום	+1
אנרגית התנגשות מנורמלת	27
זמן הכללה (ים)	20

טבלה 2: MS תנאים לניתוח proteomic הפרמטרים עבור יינון electrospray, רכישת MS ^1, ו- MS ² רכישת מכשיר orbitrap באמצעות dissociatio אנרגיה גבוהה יותר.n (HCD) מקבלים.

זְמַן	MPA%	MPB%
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

טבלה 3:. תנאי LC לניתוח glycan elution שיפוע בוצע כדי elute hydrazide מתויג N -glycans לניתוח MS.

פרמטרים MS 1
Mass טווח (Th)	600-1900
הַחְלָטָה	60,000
AGC	5 × 10 5
מקס יינון זמן	64
S-Lens FR רמה	65
Temp נימים (° C)	325
תרסיס מתח	1.75
פרמטרים MS 2
סוג הרכישה	Top12
הַחְלָטָה	15,000
AGC	5 × 10 4
מקס יינון זמן	100
יחס underfill	1%
חלון בידוד (ה ')	1.4
קבועה מהדרגה הראשונה Mass 125
אנרגית התנגשות מנורמלת פסעה	10/20/30
הכללת זמן (שניות)	15

לוח 4: תנאי MS עבור hydrazide מתויג ניתוח N -glycan הפרמטרים עבור יינון electrospray, רכישת MS ^1, ו- MS רכישת ² מכשיר orbitrap באמצעות ניתוק-אנרגיה גבוהה יותר (HCD) מקבלים..

פרוטאומיקה 7. וניתוח Deamidation

1. לזהות חלבונים / פפטידים באמצעות כלי חיפוש ביואינפורמטיקה סטנדרטיים.
   הערה: פרוטוקול הניתוח הבא תוכנן באמצעות מסדי נתונים Swiss-Prot / TrEMBL ב UniprotKB וחיפוש דרך SEQUEST בתוכנה 1.4 Discoverer Proteome, אולם בפרוטוקול עלול להיות מתורגם ישירות לכל מנוע חיפוש הניקוד חלבון באמצעות תוכנת GUI. כל הפקודות כדלקמן ניתן לגשת ממשקי תוכנה באמצעות תפריטים נפתחים.
   1. צור או להוריד מסד נתוני רצף החלבון מתאים האורגניזם מנתונים גנומית או מסדי נתוני proteome זמינים כפי שתואר על ידי Apweiler et al. ²⁵
      הערה: מאגרי מידע proteome נפוצים כוללים Swiss-Prot, TrEMBL, ואת צמח שדה, אך ניתן לבנות מנתונים בתוך הבית גם כן.
2. בתוך התוכנה, לבחור מנוע חיפוש בבסיס נתונים ופרמטרים בחרו לפי איכות הנתונים שנרכשו ואת הכללים המחמירים של החיפוש הרצוי, כפי שתואר על ידי פרקינס et al. עבור הקמע ²⁶ או Eng et al. עבור SEQUEST ^27.
   1. לקבלת נתוני דיוק גבוהים המוניים, מאפיינים קבועים עבור החיפוש בתוכנה כדלקמן: שסעי מקסימום 2 החמיץ, 5 עמודים לדקה מבשר סובלנות המונית, 0.02 סובלנות Da שבר מסה (לגילוי deamidation המדויק אופטימיזציה ²²⁾ וכולל את שינויי פפטיד tryptic הבאים : "carbamidomethyl (C)" שינוי סטטי "deamidation (N / Q)" ו "שורidation (M) "שינויים דינמיים. אם אתה משתמש ¹⁸ O תיוג עיכול, כולל" deamidation ¹⁸ O (1) "בתור שינוי דינמי נוסף.
   2. חיפוש, באמצעות המנוע שנבחר, נתוני פפטיד הגלם מול מסד נתוני החלבון (7.1.1).
      הערה: טולרנסים Mass צריכים להיות מתאימים עבור המכשיר בשימוש ולא נמוכים באופן שרירותי.
      הערה: פונקציית החיפוש הושלמה באופן אוטומטי על ידי התוכנה באמצעות אלגוריתמים ספציפיים חיפוש שונה מנוע. האלגוריתם פרקולטור (הקמע), SEQUEST, או שילובים אחרים של אלגוריתמים מועסקים לזהות חלבונים ופפטידים להבקיע את תוקפו של להיטים; מידע נוסף על הכלים הזמינים מכוסים בביקורתם מ גונזלס-Galarza et al. ^28,29. בהתאם לתוכנה, פרמטרים חיפוש נוספים ייתכן שיהיה צורך נבחרים על פי שיקול דעתו של המשתמש.
3. יצאת את פפטידים המזוהים אוצרות ו Furth ידניותניתוח אה.

ידני לאצור רשימה של פפטידים המכילים deamidation מזוהה על asparagine של N -linked מוטיב glycosylation (NX- (S / T), כאשר X ≠ P). חוצה לאמת את האתרים הללו עם מוטיבים glycosylation הידוע מהספרות וליצור שתי בריכות של התוצאות (תוקף תיאורטי).

השתמש רפאי ספירה ³⁰ להשוות את תפוסת אחוזי אתר glycosylation נתון על ידי השוואת השפע של צורות deamidated והלא deamidated.

8. כימות glycan יחסית

הערה: זיהוי וכימות הבאים הושלמה באמצעות תוכנת Xcalibur. עם זאת, כל תוכנת מנתחת נתונים גולמיים ומשלבת אוטומטי פסגות chromatographic ניתן להחליף.

1. צור רשימה תיאורטית של יצירות glycan מן הצירופים אפשריים הביולוגי של hexoses, deoxy-hexoses, hexosamines, חומצות sialic, ו- SA האחרccharides. לשם כך, מסד נתונים glycan אנוש יוצא לאור על ידי ווקר et al. ¹⁵ וניתן להשתמש בו כפי שהוא. עבור מסדי נתונים תיאורטיים, אילוצים ביולוגיים ספציפי מינים חייבים להיות מוטלים על שטח קומבינטורית, וכללים אלה מתוארים על ידי Kronewitter et al. ^31.
2. חשבתי את המוני monoisotopic glycan (M) מההמונים האטומיים לכל רכב למדינות תשלום פרוטון + 1-3. שנה את ההמונים monoisotopic לכלול תוספת של NAT (254.14191 g / mol) או SIL (260.162042 g / mol) תג P2GPN.
3. פתח את התוכנית "הגדרת עיבוד" מתצוגת מפת הדרכים Xcalibur. הגדרת שיטת עיבוד כמתואר בדיוק ההשלמות מווקר et al. ¹⁵ באמצעות הרשימה שנוצר בשלב 8.2 המכיל את ההמונים monoisotopic התיאורטי [M + H] ^1+, [M + 2H] ^{2 +,} ו [ M + 3H] ³⁺ מינים.
   הערה: כדי לאמת את זהות glycan מעבר מדויקהמוני עבור NAT / SIL duplexed ריצות, לבדוק כי NAT ו- SIL N -glycan זוגות שיתוף elute עם אותו זמן השמירה. איכותי, צולב לאמת הזדהויות עם ספקטרה ² MS, אשר חייב לכלול פסגות השייכים סדרת oxonium יון ^32.
4. יצא את הכרומתוגרמה יון משולבת, חילוץ (XIC) באזורים ל- Excel כדי להשיג את שכיחותם SIL ונט כמתואר בדיוק ההשלמות מווקר et al. ¹⁵
5. ב- Excel, תכנית תאי עמודה חדשה לחשב את התיקון נדרש חפיפת המשקל המולקולרית על ידי התאמת שפע SIL פי המשוואה בהוצאת ווקר ואח ^{1 5.:}
   ,
   כאשר A היא פסגת monoisotopic ואת חפיפת איזוטופ תיאורטיים, , ניתן לחשב לכל רכב באופן עצמאי.
6. בטור שני, תכנית התאים לנרמל את ערוצי NAT ו- SIL באמצעות המשוואה עבור גורם glycan המנורמל הכולל (TGNF), לכל ספקטרום, כפי שתוארו על ידי ווקר ואח ^{1 5.:}
   ,
   כאשר N הוא מספר N -glycans מעל לגבול הכימות.
7. בטור חדש, תוכנית התאים לקחת את היחס של SIL: גליקנים NAT (או להיפך) על מנת לחשב את השינוי לקפל בריכוז בין שני המדגמים.

תוצאות

איור 1:. התוכנית של תיוג הידרופובי ניבים-P2GPN מצמידים השיטה (שיטה) לניתוח פרוטאומיקה ו glycomics בשילוב ניתנת שלבים שונים בין glycomics בלבד glycomics עיבוד טנדם וניתוח פרוטאומיקה, עם זיהוי האתרים glycosylation, מודגשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ב-קו פרוטאומיקה ו glycomics, מסנן מבוסס שיטת תיוג הידרופובי P2GPN (שיטה) קבלה תוקף לזיהוי, לכמת, והטיית משקל מולקולרי באמצעות דגימות פלזמת תרנגולת נקווה (איור 1). בניסויים glycomics בלבד, בין השוואות שכיחותם של N -glycans שחולצו על ידי שיטהא 'עד carbograph SPE (תקן הזהב, שיטה ב) נעשו (איור 2). לא היו הבדלים משמעותיים שכיחותם של גליקנים בין שתי השיטות. התוך-ההשתנות גם הוערכו על ידי לכימות SIL: יחס NAT של גליקנים חילוץ באותה השיטה. יומן ₂ -distributions של שתי השיטות היו גאוס, התרכזו אפס, ולא שונה משמעותית (איור 3A-B). המשקל המולקולרי נע בין שני הפרוטוקולים חפפו לחלוטין, דבר המצביע על כך מסנן לא להפלות N -glycans מבוסס על טווח המשקל המולקולרי hydrophilicity (איור 4).

איור 2: תערובת equimolar של NAT ו- SIL N -glycans שחולצה על ידי שיטה או שיטה ב הוכן מ -2.5 μl של פלזמת תרנגולת (N = 4) דוגמאות אנאליות היו.yzed ידי UPLC-MS פי הפרמטרים מומלץ הציע בסעיף 6. שכיחותם עבור כל glycan, בכל ערוץ NAT / SIL, חושבו על ידי שילוב השטח מתחת הכרומתוגרמה יון חילוץ (MMA = 3 ppm), תיקון עבור מולקולרית חפיפת משקל, וכוונון ידי TGNF. יחסים אלו מוצגים עם סטיות התקן שלהם. השכיחויות של השיטה ב: -glycans N השיטה לא היו שונות משמעותי (p <0.05). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: The-השתנות התוך ב (א) שיטת א (N = 133) או (ב) שיטה ב (N = 123) אסטרטגיות הושוו. תערובות equimolar NAT ו- SIL של -glycans N, מאותה תוכנית החילוץ , נותחו מעל שלושה משכפל טכני. יומן ₂ -distributions התרכזו על אפס ולא היו שונים משמעותית בין שתי זרימות עבודה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: טווח המשקל המולקולרי של גליקנים מכל אסטרטגיה הושווה. שתי זרימות עבודה הניב גליקנים פורש באותו טווח משקל מולקולרי. N -glycans מזוהה בפרוטוקול אחד מול השני נפל בדיוק מעל הגבול של גילוי (1 × 10 ⁵ בשפע) ואינם משקפים הטיה שיטתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

בתוך-page = "1"> שייר של חלבוני deglycosylated ידי מסנן המשקל המולקולרי לאפשר אונליין ניתוח ואתר glycosylation רחב proteome זיהוי. פרוטוקולים מרובים עבור הטיהור של גליקנים וחלבונים בשילוב הושוו הכנת FASP מסורתית ללא deglycosylation (לוח 5). טיפוסי 18 hr מסנן מבוסס PNGase F העיכול, ואחריו FASP טריפסין לעכל (פרוטוקול Std) שלנו הביא רמות משמעותיות של deamidation שאינם ספציפיים, אשר יכול להפריע לזיהוי glycosites. לכן, שיטת ניצול זמן דגירה קצרה בטמפרטורה גבוהה (50 מעלות צלזיוס), צעד ספייק-ב PNGase F (פרוטוקול SPI) שנחקרה כחלופה, יחד עם פרוטוקול עיכול מיקרוגל (פרוטוקול MD), כדי למזער אי deamidation הספציפי. גליקנים שנצפו שיטות העיכול החדשות לא היו שונים משמעותי בהרכבים או שכיחותם מ -18 שעות התקן, 37 ° C מסנן PNGase F לעכל ( (לוח 5).

		חלבונים					פפטידים					פפטידים Deamidated					Glycosites					גליקופרוטאינים
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

. לוח 5: השוואות של נתונים proteomic מתוך טריפסין תקן לעכל לעומת שיטת תיוג ב-קו ניבים-P2GPN נעשו הכנות בוצעו עם (+) ובלי (-) PNGase F לקבוע שיעורי רקע deamidation הלא ספציפית ואומדן glycosite שיעורי חיובי כוזב. חלבונים זוהו עם שיעור התגליות השגויות 1% (FDR); פפטידים סוננו מבוסס על אמון פפטיד "גבוה" Proteome Discoverer 1.4 (q <0.01); glycosites היה identified מבוסס על רצפים ייחודיים המכילים deamidation של מוטיב glycosylation המשומר (NXS / T); גליקופרוטאינים הוגדרו חלבונים מזוהים המכילים לפחות glycosite אחד מזוהה.

איור 5: קיצור פרוטוקולים גליקנים פותחו כדי למזער דיאמינציה בדגימות ולעומת לעכל 18hr ניבים PNGase F. ממוצע ההבדלים ב שכיחותם היו 10% ו -5% עבור MD (2.2.3) ו SPI (2.2.2) פרוטוקולים, בהתאמה. של 48 גליקנים מזוהים, 90% מוצגים פחות מ וריאציה פי 1.5. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

יש צורך בשיטות כמותיות בעלות תפוקה גבוהה כדי להקל על ניתוח גליקן שגרתי. בשלושים השנים האחרונות, ניתוח גליקומיקה הוגבל לתת-קבוצה של קבוצות מחקר, למרות חשיבותו במחלות, יישומים קליניים ותרופות. שיטת הטיהור והתיוג FANGS-P2GPN לגליקומיקה ופרוטאומיקה מבצעת את אותו ניתוח על מנת אחת של דגימה, ומפחיתה את עלות האספקה ואת כמות החומר הדרוש (חשוב במיוחד במחקרים בבני אדם ועכברים). יתר על כן, המאמצים למזער את השונות בתכשירים הם חשובים ביותר, שכן כל צעד נוסף תורם לטעות, ועלול להסוות שינויים חשובים אך נמוכים במחקרי מקרה-ביקורת. צימוד של FANGS לתיוג הידרזיד הידרופובי מאפשר להריץ דגימות חלבון וגליקן על אותה עמודת RPLC, משפר את יינון הגליקן, מספק כימות יחסי וניתן ליישם אותו כמותית על פלזמה.

לניתוח N-גליקן, חיוני להשתמש ברמה המומלצת של PNGase F כדי להשיג דה-גליקוזילציה מלאה. למרות שגליקנים חשופים לממסים, דנטורציה של חלבונים ועודף אנזימים עוזרים להבטיח מחשוף יעיל ומלא. לצורך כימות מדויק של הגליקנים, יש לוודא שהם מיובשים לחלוטין לאחר הנגזרת כדי להרוות את התגובה ולמנוע תגובות צולבות בעת ערבוב מיני NAT ו- SIL. לבסוף, כאשר מרחיבים את זרימת העבודה לניתוח גליקוזיט, תזמון השלבים הוא קריטי כדי למזער את ההפחתה הלא ספציפית. הפרוטוקולים המותאמים שסופקו לניתוח משולב של גליקומיקה ופרוטאומיקה פועלים באופן עקבי כאשר הם מבוצעים בהתאם.

זרימת העבודה משיגה כימות יחסי מדויק של N-גליקנים מפלזמה בהשוואה לשיטת SPE בתקן הזהב. אין הטיה נראית לעין בסוגי הגליקנים המופקים מבחינת משקל מולקולרי, הידרופיליות ומבנה הרכב. למרות שלא חקרנו את הניתוח האיכותי של גליקנים מקושרים ל-O, אנו מצפים ש-FANGS יוכל להכיל תוספת של שלב חיסול β לאחר עיכול PNGase F של גליקנים מקושרים ל-N. עם זאת, נהלים ידרשו שינוי משמעותי לניקוי ריאגנטים לפני ספקטרומטריית מסה, וניתוח פפטידים יושפע באופן משמעותי. עבור פרוטאומיקה, אותו עומק של כיסוי פרוטאום מושג בהשוואה לשיטות FASP מסורתיות. חשוב לציין, שיטות משיגות שיעור גילוי שווא מינימלי עבור הפחתת N-גליקן. בעוד שהשיטה תואמת לתיוג ¹⁸O של Asn במהלך שלב העיכול של PNGase^22,23, שיעור הגילוי השגוי הנמוך של אתר הגליקוזילציה מצביע על כך שייתכן שזה לא נחוץ, מה שמפחית עוד יותר את העלויות והמורכבות.

הפרוטאום אינו מועשר לגליקופרוטאינים בשיטה זו, שיש לה יתרונות וחסרונות כאחד. ייתכן שגליקופרוטאינים מסוימים בשפע נמוך לא יתגלו בניתוח. עם זאת, ניתן להשוות את התפוסה של אתרים מסוכררים לכל חלבון, בין דגימות ביולוגיות. בנוסף, השגיאה וההטיה המוכנסות מטיהור זיקה ללקטין או העשרה כימית מתבטלות. לסיכום, צימוד של FANGS לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד מביא לשיטה פשוטה, כמותית ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח טנדם של הגליקום והפרוטאום עם פוטנציאל גדול ליישום במחקרי מקרה-ביקורת קליניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה אצטית (50%)	סיגמא אולדריץ'	45754
אצטוניטריל, HPLC כיתה	בורדיק & ג'קסון	AH015-4
אמוניום ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	A6141
ריאגנט ברדפורד	סיגמא אולדריץ'	B6916	: ערכת חומצה ביצינצ'ונינית (Sigma Aldrich BCA1)
סידן כלורי	סיגמא אולדריץ'	C1016
צנטריפוגה	Eppendorf	5804 R	צנטריפוגות חלופיות המגיעות ל-14,000 x g מתאימות
DL-Dithiothreitol, 1  M בתמיסה	סיגמא אולדריץ'
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	ננו חלופי או LCs בלחץ גבוה במיוחד יפיקו נתונים דומים, כגון: 1. Dionex UltiMate Ò 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (מים).
מתלה צינורות צף	TedPella	20831-20
Fetuin	ניו אינגלנד Biolabs	P6042S
תנורי מעבדה סטנדרטיים של פישר סיינטיפיק איזוטמפ	פישר סיינטיפיק	11-690-625F	אינקובטורים חלופיים המגיעים ל-56  ° C מתאימים
חומצה פורמית	סיגמא אולדריץ'	56302
GE תנור מיקרוגל	ג'נרל אלקטריק	57B5 E82904	כל מיקרוגל עם הגדרות הספק מתכווננות מתאים
INLIGHT Glycan Tagging Kit	מעבדות איזוטופ קיימברידג'	GTK-1000	ערכת INLIGHT מספקת גרסאות NAT ו-SIL של מגיב P2GPN.
יודואצטמיד	סיגמא אולדריץ'	A3221
Kinetix 2.6 מ"מ, 100 Å, C18 פאזה נייחת בתפזורת	Phenomenex	מדיה בתפזורת	: כל C18 שלב נייח 5
mM קמע Daemon תוכנה ומטריקס שרתים	מדעית		: תוכנת Proteome Discoverer (Thermo Scientific)
מתנול, HPLC כיתה	בורדיק & ג'קסון	AH230-4
PicoFrit טור אריזה עצמית: 360  μ מ', OD 75  μ מזהה מ', 15  μ m טיפ, לא מצופה, 5 בקופסה, 50 ס"מ	מטרה חדשה	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (ללא גליצרול), 75,000  יחידות/מ"ל	ניו אינגלנד BioLabs	P0705L
Q Exactive HF היברידי Quadrupole-Orbitrap ספקטרומטר מסה	תרמו מדעי		דיוק מסה גבוה חלופי (5  ppm) ספקטרומטרי מסה יספקו נתונים דומים
RNase B	New England Biolabs	P7817S
טריפסין מלבלב חזיר	סיגמא אולדריץ'	T6567-5X
אוריאה	סיגמא אולדריץ'	51456
רכז ואקוםSavant SPD131DDA רכז SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA	רכזי ואקום חלופיים מתאימים
מסנני Vivacon 500 30 kDa	VN01H22	Sartorius Stedim Biotech	: יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra 0.5 עם Ultracel-10  ממברנה kDa (Millipore UFC501096)
מים, בורדיק בדרגת HPLC	& ג'קסון	AH365-4
מים, 18O	מעבדות איזוטופ קיימברידג'	OLM-240-97-1	התוספת של 18O בשלב העיכול של PNGase F היא אופציונלית וייתכן שלא תהיה נחוצה למחקרי deamidation שהושלמו בביטחון של 95%
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test	Kit Merck Millipore	693030