Method Article

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

DOI:

10.3791/53736

⸱

February 16th, 2016

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות תאי מערכת החיסון ברקמות ממלאות תפקיד חיוני בתיווך חסינות מקומית ובשמירה על הומאוסטזיס של רקמות, אך מעט ידוע על אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות ברירית הפה ובחניכיים. הקמנו טכניקה לבידוד ומחקר של תאים חיסוניים מרקמות חניכיים של עכברים, אזור של חשיפה מיקרוביאלית מתמדת ואתר פגיע למחלה דלקתית נפוצה, דלקת חניכיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר אפיון פנוטיפי מפורט של אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות בחניכיים, גם במצב יציב. ההליך שלנו מניב גם מספיק תאים עם כדאיות גבוהה לשימוש במחקרים פונקציונליים, כגון הערכת הפרשת ציטוקינים ex vivo. שילוב זה של אפיון פנוטיפי ותפקודי של רשת תאי חיסון החניכיים אמור לסייע בחקירת המנגנונים המעורבים בחסינות אוראלית ובהומאוסטזיס חניכיים, אך גם יקדם את הבנתנו את המנגנונים המעורבים באימונופתולוגיה מקומית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2.

כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH.

1. להכין מראש

  1. הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו FBS 10%.
  2. כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת).
  3. הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מומנו בחלקם על ידי התוכנית הפנימית של NIDCR (N.M.M) ונתמכו על ידי מלגת Wellcome Trust Stepping Stones (097820/Z/11/B to J.E.K) ועל ידי מענק של המרכז השיתופי של מנצ'סטר לחקר דלקת (ל-J.E.K). המחברים מודים לתרזה ויילד על הביקורת על כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מספריים עדיניםכלי מדע עדינים14058-11
ידית אזמל #3כלים מדעיים עדינים10003-12
להבי אזמל #10כלים מדעיים עדינים10010-00
מלקחיים סטריליים רסיסיםאינטגרה Miltex6-304
מחטים עם שיפוע רגיל BD Medical30510927 גרם, אורך 12.7 מ"מ
מזרקי מונו-ג'קטCovidien8881513934Luer-lock, 3 מ"ל
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-049ללא סידן ומגנזיום
RPMI 1640לונזה12-167Fללא L-גלוטמין
DNase I מלבלב בקרSigma-AldrichDN25-1G
קולגנאז סוג IVג'יבקו (מבית Life technologies)17104-019
סרום בקר עובריג'מיני מוצרים ביולוגיים100-106
ג'נטמיצין 50 מ"ג/מ"לאיכות ביולוגית120-098-661EA
עט סטרפטוקוקוסג'יבקו (מבית Life technologies)15140-122
L-גלוטמיןג'יבקו (מבית Life technologies)25030-081
0.5 מ' EDTA pH 8.0ביולוגי איכותי351-027-721EA
צינורות 50 מ"לקורנינג352070פוליפרופילן, סטרילי
70 μ מסננות תאים Mקורנינג352350
צלחות פטריקורנינג351029סטריליות
5 מ"ל צינורות FACSקורנינג352052סטרילי
BD GolgiPlugBD Biosciences555029מכיל תמיסת ברפלדין A פורבול
12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)סיגמא-אולדריץ'P8139
מלח סידן יונומיציןSigma-Aldrich13909
Saponin מקליפת quillajaSigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתיםDead TechnologiesL34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450eBioscience48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780eBioscience47-5961-82
נגד עכבר גמא דלתא TCR FITCeBioscience11-5711-82
נגד עכבר IL-17A APCeBioscience12-7311-82
נגד עכבר IFN-γ PEeBioscience11-5931-82
נגד עכבר NK1.1 PE-Cy7eBioscience25-5941-82
נגד עכבר CD90.2 APC eFluor 780eBioscience47-0902-82
נגד עכבר CD3e FITCeBioscience11-0031-82
נגד עכבר CD19 FITCeBioscience11-0193-82
נגד עכבר CD11b FITCeBioscience11-0112-82
נגד עכבר CD11c FITCeBioscience11-0114-82
נגד עכבר TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
נגד עכבר Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
נגד עכבר Ly-6C FITCBD פארמינגן553104
Aqua

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gingival Immune CellsImmune Cell IsolationTissue DigestionFlow CytometryCytokine SecretionCollagenase DNaseCell StrainerEx Vivo StimulationPhenotypic CharacterizationFunctional Examination

Related Articles