מאמר שיטה

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

DOI:

10.3791/53736

⸱

16 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות תאי מערכת החיסון ברקמות ממלאות תפקיד חיוני בתיווך חסינות מקומית ובשמירה על הומאוסטזיס של רקמות, אך מעט ידוע על אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות ברירית הפה ובחניכיים. הקמנו טכניקה לבידוד ומחקר של תאים חיסוניים מרקמות חניכיים של עכברים, אזור של חשיפה מיקרוביאלית מתמדת ואתר פגיע למחלה דלקתית נפוצה, דלקת חניכיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר אפיון פנוטיפי מפורט של אוכלוסיות תאי החיסון השוכנות בחניכיים, גם במצב יציב. ההליך שלנו מניב גם מספיק תאים עם כדאיות גבוהה לשימוש במחקרים פונקציונליים, כגון הערכת הפרשת ציטוקינים ex vivo. שילוב זה של אפיון פנוטיפי ותפקודי של רשת תאי חיסון החניכיים אמור לסייע בחקירת המנגנונים המעורבים בחסינות אוראלית ובהומאוסטזיס חניכיים, אך גם יקדם את הבנתנו את המנגנונים המעורבים באימונופתולוגיה מקומית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2.

כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נוכחות של קהילות מיקרוביאלי dysbiotic, מצב דלקתי, חניכיימיים עולות 3 4. חניכיים היא מחלה דלקתית נפוצה, שמוביל לאובדן השן sמבני upporting. במקרים חמורים שלה הוא נתפס בתוך כ -10% מכלל אוכלוסיית 5. הביתור הגורמים המרכזיים המעורבים הרגישות חניכיים והתקדמות הוכיחה קשה 6. עם זאת, במודלים של בעלי החיים היו מאוד שימושיים בהבנת מנגנוני חניכת חניכיימיים והתקדמות 7. מודלים יכולים להיות מועסקים על מנת להגדיר את אוכלוסיות תאי מפתח ומתווכים מולקולריים כי הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חיסון ופיתוח כונן של מיסב שן. תובנה כזו תהפוך הבנתנו שליטת חניכיימיים הספציפיות של הומאוסטזיס חיסונית לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של בהיווצרות מחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH.

1. להכין מראש

  1. הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו FBS 10%.
  2. כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת).
  3. הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ"ל של התקשורת DNase בתוספת 3.2 מ"ג / מ"ל ​​של IV סוג Collagenase (הפוך טריים, לשמור על הקרח בכל עת).
  4. טרום מגניב חיץ FACS: 0.5% FBS מדולל PBS.
  5. צנטריפוגות טרום מגניב עד 4 מעלות צלזיוס.
  6. חממה שייקר חם 37 ° C.

בידוד 2., Dissection, ובידוד התא מפני חניכיים בלוקים

  1. להרדים עכברים על ידי חשיפה אותם ל- CO 2 בתא מתאים, על פי הנחיות AraC.
  2. פתח את חלל בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואיברים פנימיים. כדי perfuse, עושים חתך את הווריד הנבוב נחות perfuse 3 מ"ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G.
  3. לשתק את הגוף ואת הראש של עכבר על הכרית עם בטן כלפי מעלה.
  4. חותכים כל שליבה של השפה לכיוון הצוואר במספריים, הפרדת העור שמכסה באזור הלסת התחתונה והצוואר, חשיפת רקמות השרירים הבסיסית. לנתח את השפה התחתונה לחשוף את הלסת התחתונה.
  5. חותך בין החותכות התחתונות להפריד משני צידי הלסת התחתונה ואת לשתק כל צד לגשת חלל הפה.
  6. דמיינו לנתח את החיך משם מחלל האף.
  7. לנתח אזורים באמצעות 10 להב וכוללים אזורי טוחנת בלסת העליונה mandibular עם הסובבים החניכיים (איור 1). ודא חתכים אנכיים רק קדמי טוחן ואת האחורי הראשונים הטוחן השלישי חתך אופקיהגבול של החניכיים (הצווארון הלבן של השיניים לרקמות).
  8. מניחים את לסתי וחוסם mandibular צינור חרוטי 50 מ"ל עם 5 מ"ל Collagenase / DNase (לשמור על הקרח).
  9. דגירה באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ובמהלך הדגירה 5 דקות של האחרון להוסיף 50 μl של 0.5 מ 'EDTA.
  10. הוסף 5 מ"ל של התקשורת DNase קר אל הצינור 50 מ"ל עם רקמות בעדינות מערבולת לערבב.
  11. מעבירים את 4 בלוקים של רקמות על צלחת פטרי ולכסות עם 500 μl של התקשורת DNase. סר חניכיימיים מכל גוש הרקמות, באמצעות סכין אזמל ומכוון את הלהב לתוך אזורי החניכיים ו-שיניים.
  12. מעבירים את הרקמות ואת התקשורת מצלחת פטרי כמו גם בתקשורת DNase שהופעלה במהלך לנתיחה, לצינור חדש 50 מ"ל דרך מסננת התא (70 מיקרומטר גודל). לשטוף עם התקשורת DNase (3-5 מ"ל) כל המכשירים המשמשים ולסנן.
  13. באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר סטרילי, ומועך את הרקמה נגד המסננת,סינון עם התקשורת DNase קר (30 עד 35 מ"ל).
  14. שטוף את מסננת התא עם תקשורת DNase קרה.
  15. צנטריפוגה ב 4 ° C, 314 XG במשך 6 דקות.
  16. בטל supernatant, מחדש להשעות ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.
  17. ספירת תאים (סכום הצפוי צריך לנוע בין 8 x 10 5 כדי 1.2 x 10 6 תאים עם כדאיות של> 80%) באמצעות דלפק תא אוטומטי.

3. גירוי ו FACS צביעת תאים חניכיים

  1. לעורר את ההשעיה תא בודד עם PMA (50 ng / ml) ו ionomycin (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) בנוכחות של 1 μl / מ"ל ​​של Brefeldin א
  2. דגירה של 3.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. ספין למטה לשטוף עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס; 314 XG במשך 6 דקות.
  4. כתם תאים באמצעות כתם כדאי בעקבות ההוראות יצרן.
  5. כתם על סמנים תאיים (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ או נמלהibodies בחירה) בעקבות הוראות יצרן.
  6. שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות קר FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
  7. בעדינות מערבולת לשבש את התא גלולה.
  8. תקן את התאים עם paraformaldehyde 2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שוטפים את התאים עם חיץ FACS קר, צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות ו כתם ציטוקינים תאיים.
    1. ממלאים את צינורות FACS עם תמיסה של saponin 0.5% קר מדולל חיץ צנטריפוגות FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    2. הוספת 300 μl של פתרון saponin 0.5% אל צינורות FACS, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    3. כתם תאים עבור סמנים תאיים (IL-17A ו IFNγ או ציטוקינים בחירה) בעקבות הוראות יצרן. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות saponin 0.5% ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    4. שטפו שוב עם FACSחיץ צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
    5. מחדש להשעות את התאים 300 μl של חיץ FACS.
  10. נתחו את התוצאות על cytometer הזרימה.

4. ניתוח cytometry זרימה

  1. דמיינו תאים להיות מנותח על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SCC) ושער להוציא פסולת.
  2. בחר תאים בודדים עם שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פרמטרים גובים (FSC-H).
  3. שער תאים כי הם חיים (כפי שצוין על ידי מכתים כדאי) וחיוביים עבור + CD45 סמן hematopoietic לניתוח נוסף (איור 2 א ו 2 ג).
  4. המשך ניתוח של סמנים ספציפיים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מומנו בחלקם על ידי התוכנית הפנימית של NIDCR (N.M.M) ונתמכו על ידי מלגת Wellcome Trust Stepping Stones (097820/Z/11/B to J.E.K) ועל ידי מענק של המרכז השיתופי של מנצ'סטר לחקר דלקת (ל-J.E.K). המחברים מודים לתרזה ויילד על הביקורת על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים עדיניםכלי מדע עדינים14058-11
ידית אזמל #3כלים מדעיים עדינים10003-12
להבי אזמל #10כלים מדעיים עדינים10010-00
מלקחיים סטריליים רסיסיםאינטגרה Miltex6-304
מחטים עם שיפוע רגיל BD Medical30510927 גרם, אורך 12.7 מ"מ
מזרקי מונו-ג'קטCovidien8881513934Luer-lock, 3 מ"ל
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-049ללא סידן ומגנזיום
RPMI 1640לונזה12-167Fללא L-גלוטמין
DNase I מלבלב בקרSigma-AldrichDN25-1G
קולגנאז סוג IVג'יבקו (מבית Life technologies)17104-019
סרום בקר עובריג'מיני מוצרים ביולוגיים100-106
ג'נטמיצין 50 מ"ג/מ"לאיכות ביולוגית120-098-661EA
עט סטרפטוקוקוסג'יבקו (מבית Life technologies)15140-122
L-גלוטמיןג'יבקו (מבית Life technologies)25030-081
0.5 מ' EDTA pH 8.0ביולוגי איכותי351-027-721EA
צינורות 50 מ"לקורנינג352070פוליפרופילן, סטרילי
70 μ מסננות תאים Mקורנינג352350
צלחות פטריקורנינג351029סטריליות
5 מ"ל צינורות FACSקורנינג352052סטרילי
BD GolgiPlugBD Biosciences555029מכיל תמיסת ברפלדין A פורבול
12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)סיגמא-אולדריץ'P8139
מלח סידן יונומיציןSigma-Aldrich13909
Saponin מקליפת quillajaSigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתיםDead TechnologiesL34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450eBioscience48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780eBioscience47-5961-82
נגד עכבר גמא דלתא TCR FITCeBioscience11-5711-82
נגד עכבר IL-17A APCeBioscience12-7311-82
נגד עכבר IFN-γ PEeBioscience11-5931-82
נגד עכבר NK1.1 PE-Cy7eBioscience25-5941-82
נגד עכבר CD90.2 APC eFluor 780eBioscience47-0902-82
נגד עכבר CD3e FITCeBioscience11-0031-82
נגד עכבר CD19 FITCeBioscience11-0193-82
נגד עכבר CD11b FITCeBioscience11-0112-82
נגד עכבר CD11c FITCeBioscience11-0114-82
נגד עכבר TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
נגד עכבר Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
נגד עכבר Ly-6C FITCBD פארמינגן553104
Aqua

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gingival Immune CellsImmune Cell IsolationTissue DigestionFlow CytometryCytokine SecretionCollagenase DNaseCell StrainerEx Vivo StimulationPhenotypic CharacterizationFunctional Examination

מאמרים קשורים