אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גרורה היא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה מסרטן. גרורה הוא תהליך רב שלב ובשל מורכבותו, התהליכים התאיים והמולקולריים המדויקים שולטי הפצה וצמיחה גרורתי עדיין חמקמקים. הדמיה חיה מאפשרת הדמיה של האינטראקציות הדינמיות המרחבי של תאי microenvironment שלהם. גידולים מוצקים גרורות בדרך כלל אל הריאות. עם זאת, המיקום האנטומי של הריאות מציבה אתגר בפני הדמיה intravital. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומהירה יחסית הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות דינמי בין תאים סרטניים stroma הסובבת אותם בתוך גרורות ריאה. באמצעות שיטה זו, תנועתיות של תאים סרטניים כמו גם יחסי הגומלין בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ב microenvironment שלהם ניתן דמיינו בזמן אמת במשך כמה שעות. באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים, שורת תאי פלורסנט, בזריקות שכותרתו fluorescentlyמולקולות ו / או נוגדנים, מספר רכיבים של microenvironment הריאות יכולות להיות חזותי, כגון כלי דם ותאי חיסון. כדי לדמות את סוגי התאים השונים, דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal המאפשר הדמיה רציפה ארוכת טווח עם מהירה, רכישת תמונה בארבעה צבעים נוצל. הזמן לשגות סרטים מלוקטים מתמונות שנאספו במשך מספר רב של עמדות ומטוסים מוקדי להראות אינטראקציות בין גרורה חיים ותאי חיסון במשך שעה לפחות 4. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להוסיף ולבדוק כימותרפיה או טיפול ממוקד. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר פתולוגיות הקשורות ריאה אחרת שעלולים להשפיע על המיקרו-סביבת הריאות.
מבוא
ההיבט הקטלני ביותר של סרטן הוא גרורות, המהווה יותר מ-90% מהתחלואה והתמותה הקשורות לסרטן1. גרורות הן תהליך רב-שלבי ובשל מורכבותו, המנגנונים התאיים והמולקולריים המדויקים השולטים בהתפשטות וצמיחה גרורתית עדיין חמקמקים. כדי לשלוח גרורות, תאי הגידול בגידול הראשוני חייבים להתנתק מהתאים השכנים ומקרום הבסיס, לחצות את המטריצה החוץ-תאית, לעבור דרך כלי דם או לימפה, לעבור באתר המשני, ולבסוף, לשרוד ולהקים גידולים משניים. בנוסף לתכונות תאי הגידול, התרומה של המיקרו-סביבה, הכוללת את הסטרומה הסמוכה יחד עם המקבילים הרגילים של תאי הסרטן, היא קריטית לזריעה והקמה של נגעים גרורתיים2.
שיטות מסורתיות לחקר זריעה וצמיחה גרורתית בוחנות מצבים סטטי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי טיפול מוסדי בעלי חיים הוועדה המקומית שימוש (IACUC).
דור 1. ריאות גרורות עבור vivo לשעבר הדמית חיה (מהונדס או זנב וריד הזרקה)
הערה: גרורות ריאות יכול להיווצר על ידי ניצול מודלים עכבר מהונדס גנטית או על ידי תוך ורידי (IV) הזרקה של תאים סרטניים.
- צור גרורות סרטניות בריאות הדמיה ידי חצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, מערכות במודל של עכברים שונים הזרקה, במיקרו-סביבה של גרורתי ניתן דמיינו מסומנים לאורך זמן. שימוש MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ג-FMS-EGFP במודל עכבר משולשת מהונדס, מרכיבים תאיים שונים מסומנים fluorescently (איור 2 א, סרט 1). המבנה הטיפוסי של parenchyma ריאות ניתן דמיינו בערוץ CFP מאז כל התאים לבטא ECFP תחת האמרגן β-אקטין. גדולות / גרורות סרטניות בריאות רבה-תאיים נפתרות בקלות כמו אלה מופיע כמעין בתפזורת של ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב יד זה מתאר שיטה מפורטת עבור הדמית vivo לשעבר חיים של גרורות ריאה בעכברי מודל של גרורות. פרוטוקול הדמיה זו מספקת להדמיה ישירה של אינטראקציות stroma תאים סרטניים דינמית מרחבית במיקרו-סביבה של הריאות. זוהי השיטה קלה ומהיר יחסית המאפשר הדמיה אמינה של גרורות ריאה במשך שעה לפחות 4. סרטים רכשו מניסויים אלה יכולים לשמש למעקב אחר תהליכים דינמיים כמו תנועתיות תא אינטראקציות הסלולר.
שתי שיטות לייצור גרורות ריאו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC, UCSF.
תודות
אנו מודים ל-Nguyen H. Nguyen על עזרתה הטכנית ולאודרי אוניל על תמיכתה במיקרוסקופ הקונפוקלי של Zeiss Cell Observer. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של משרד ההגנה (W81XWH-11-01-0139) ומכון ויצמן למדע - התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט לקידום נשים במדע (לסגן נשיא).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברי MMTV-PyMT/FVB | מעבדת ג'קסון | 2374 | עכברים נקבות |
| ACTB-ECFP/FVB עכברי | UCSF Werb | עכברים נקבות | |
| c-fms-EGFP/FVB עכברים | UCSF Werb | עכברים נקבות | |
| עכברי FVB | מעבדת ג'קסון | 1800 | עכברים נקבות |
| GFP+ תאי VO-PyMT | מעבדת UCSF Werb | ||
| 70,000 kDa Dextran, | Invitrogen | D1818 | יש לדלל ל-4 מ"ג/מ"ל ב-1 x PBS ולאחסן ב-20 °C. השתמש ב-0.4 מ"ג לכל בעל חיים. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 מצומד | Invitrogen | D22914 | יש לדלל ל-4 מ"ג/מ"ל ב-1 x PBS ולאחסן ב-20 °C. השתמש ב-0.4 מ"ג לכל בעל חיים. |
| נוגדן נגד עכבר Gr-1 Alexa Fluor 647 | UCSF ליבת נוגדן חד שבטי | מלאי 1 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-7 ug לכל חיה. | |
| הרדמה | הרדמה מאושרת על ידי IACUC, משמשת להרדמה ו/או המתת חסד | ||
| 1X PBS | UCSF מתקן | ||
| PBS, USP סטרילי | Amresco INC | K813-500ML | כיתה טהורה במיוחד להזרקת IV |
| פלטפורמת | תשמש כלוח חיתוך | ||
| מספריים עדינים חדים | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| מלקחיים | Roboz חנות כירורגית | RS-5135 | |
| מעקר חרוזים חמים | Fine Science Tools | 18000-45 | הפעל 30 דקות לפני השימוש |
| אוויר | UCSF | ||
| חמצן | UCSF | ||
| פחמן דו חמצני | UCSF | ||
| 1 מ"ל מזרק ללא מחט | BD | 309659 | |
| 27 גרם x 1/2 מחט | 305109 BD | להזרקת עירוי | |
| 20 גרם x 1 מחט, שיפוע קצר | BD | 305178 | |
| אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה | לונזה | 50111 | להכנת 10 מ"ל תמיסה, שוקלים 0.2 גרם אגרוז, מוסיפים ל -10 מ"ל 1 x PBS ומחממים להמסה. אגרוז יתמצק בטמפרטורת החדר, לכן יש לשמור על טמפרטורה של 37 מעלות; C אמבט מים עד לשימוש לניפוח. |
| RPMI-1640 בינוני ללא פנול אדום | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 באר לוחית הדמיה | E& K scientific | EK-42892 | |
| שקופיות כיסוי זכוכית, 15 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 22-031-144 | |
| בקר CO2 וטמפרטורה דיגיטלי | Okolab | DGTCO2BX | |
| http://www.oko-lab.com תא אקלים | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer מסתובב דיסק קונפוקלי מיקרוסקופ | Zeiss | ||
| Zen תוכנה | Zeiss | ||
| מיקרוסקופ | הפוךCarl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD מצלמה | סטנפורד פוטוניקה | XR-Mega-10EX S-30 | |
| מסתובב דיסק קונפוקלי ראש סריקה | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | תוכנת קוד פתוח |
מקורות
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
