בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי Plasmodium Sporozoites

מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות הקטלניות בעולם, הרג יותר מחצי מיליון בני אדם בשנה. זיהום על ידי Plasmodium, הסוכן סיבתי של המחלה, מתחיל שלב טרום האריתרוציטים (PE). במהלך שלב זה, sporozoites מוזרק לתוך העור מארח ידי יתוש נקבת Anopheline להגיע הכבד דרך מחזור הדם ולבדל hepatocytes בתוך לצורות הטפילות המדביקים תאי דם אדומים ולגרום הסימפטומים של המחלה.

שלבי PE של Plasmodium מהווים יעד חסוי לחיסון נגד מלריה. אכן, לחיות חיסונים מוחלשים נגד בשלבים אלה, כגון sporozoites נחלש קרינה (RAS), טפילים נעצר גנטית (GAP) או chemoprophylaxis ו sporozoites (CPS) הוכיחו את יכולתם להגן הן מכרסמים ומארחים האנושי ^1-9. במודל המכרסם, רוב מחקרי חיסון נערכים ניצול חיסון תוך ורידים, המהווה את תקן הזהב במונחים של יעילות מגן. עם זאת, התיאור של שלב עור ואת החשיבות של הבלוטה לימפה הניקוז הקשורים עור (DLN) ב לעורר הגנה השתנה התפיסה שלנו של שלב PE והדגיש את החשיבות של המסלול תוך-עורית של הזרקה. הדמיה Intravital של פ sporozoites berghei מוזרק לתוך העור של מכרסמים הראו כי רק ~ 25% של הבידוד מגיע הכבד דרך מחזור הדם. הנותרים ~ 75% מפיצה בין הפרוקסימלי DLN (~ 15%) ואת העור (~ 50%) ^10,11, שבו חלק קטן יכול להפוך ולהישאר בחיים במשך שבועות בתוך תאי העור ^12,13. יתר על כן, מחקרים מאוחרים יותר תיאר כי הקמת הגנה חיסונית יעילה לאחר חיסון intradermal בעיקר מתרחש בעור-DLN, שבו טפיל ספציפי תאי CD8 ⁺ T מופעלים, ורק באופן שולי בטחול או בכבד-dLNs ^14,15.

בזמןרוב המחקרים התמקדו באפיון תא המפעיל המעורב בהקמה בתגובת מגן חיסון, הרבה פחות ידוע על גורלם של טפילי מוחלשים חיים מוזרקים לתוך העור, במיוחד יחסי הגומלין שלהם עם מערכת החיסון המולדת. בפרט, אפיון של תאי מציגי אנטיגן מעורבים ספיג אנטיגן הטפיל, עיבוד והצגה לתאי CD8 ⁺ T הוא בעלת חשיבות מכרעת, בידיעה כי רכישת אנטיגן PE יכולה להתרחש הוא בעור ותאי DLN. מחקרי הדמיה intravital הקודם תיאר נהירה מוקדם של תאים חיוביים במאור פלורסנט ליס-GFP בעור בעקבות עקיצת יתוש זיהומיות ¹⁶ תוך אינטראקציות מוקדם בין sporozoites ותאים דנדריטיים נצפו DLN ^10,17. לאחרונה, זה כבר דווח כי sporozoites המחוסן בעור על ידי יתושים מגביר את תנועתיות של שני תאי T הדנדריטים ורגולטוריים בעורעכברים, בעוד מספר ירידה של תאים מציגי אנטיגן נצפתה DLN ^18.

החוקרים ביקשו לזהות ולכמת ליתר דיוק תת לויקוציטים גייס בעור המקביל DLN כמו גם אלה אינטראקציה עם הטפיל לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של RAS ^19. בהקשר זה, אנחנו מבודדים תאי מיאלואידית (CD45 ⁺ CD11b ⁺⁾ משני הרקמות ומאופיינות תת-אוכלוסיות של ריבית על ידי זרימה רבה = פרמטרית cytometry. עולה בקנה אחד עם התגובה החיסונית מתוארת בשלב המוקדם של דלקת עור גדולה שושנת יריחו ^20, תגובת המארח העיקרית sporozoite הזרקת מורכב גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^int) ואחריו מונוציטים דלקתיים (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ^- Ly6C ⁺⁾ אשר מזוהים על בסיס differentiביטוי אל של סמני משטח Ly6G ו Ly6C.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאי מיאלואידית מעור עכבר DLN לאחר הזרקת intradermal של מחסנת מינונים של RAS שחולצו מן בלוטות רוק יתוש נגועות. זריקות תוך-עורית לשחזור ועיבוד רקמה הם שלבים קריטיים לכמת שינויים פנוטיפי של הסתננות אוכלוסיית תאים בתוך רקמות נגועות. הגישה כמפורט להלן מספק assay אמין להעריך את העור לתגובה דלקתית DLN כדי טפיל Plasmodium ויכול להתארך עד מערכות ניסיוניות שונות.

כל ההליכים אושרו על ידי ועדה של מכון פסטר על ידי ועדת האתיקה המקומית על ניסויים בבעלי חיים (ועדה אתית צה"ל-פריז 1, פריז, צרפת; מספר הסכם: 2012-0015) וביצע בהתאם להנחיות והתקנות החלים.

1. חומרים ריאגנטים

1. השתמש אנופלס נקבה יתושים stephensi (זן Sda500) הניזונים עכברים נגועים 3-5 ימים לאחר הופעתה ומאחור כפי שתואר לעיל ^21.
2. השתמש טפילים Plasmodium berghei אנקה שיבוט המבטאים את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הגן תחת שליטה של חלבון הלם חום המכונן 70 (HSP70) האמרגן. זה מניב קרינה בהירה לאורך כל מחזור החיים הטפילים ^22.
3. השתמש נקבה C57BL / עכברים 6JRj (7 שבועות בן).
   הערה: כל החומרים הכימיים המשמשים הפרוטוקול המתואר מפורטים T המסוגל של חומרים / ציוד.

1. בין 18-25 ימים לאחר ארוחת דם זיהומיות, לאסוף וקור-להרדים יתושים לתוך צינור 15 מיליליטר על קרח כפי שתואר קודם לכן ^21. בזהירות להעביר אותם על צלחת פטרי על ידי צינור היפוך. לשמור על חרקים על הקרח ולחשוף את היתושים מנה 12 krad של הקרנה x γ- או.
2. לבודד sporozoites מוחלש מבלוטות רוק יתוש מוקרנות כפי שתואר לעיל ^21. אסוף בלוטות רוק נגועות בנפח קטן (סביב 15 μl) של בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) על קרח בעדינות למחוץ אותם לשחרר sporozoites.
   הערה: ההזרקה של השעיה טפילה מרוכזת מאוד בנפח קטן להיות קריטי, לכן זה חיוני כדי לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק ממספר רב של יתושים שנבחרו מראש גם נגועים, כפי שמעידים הביטוי החזק שלהםקרינה ירוקה.
3. סנן את ההשעיה sporozoite באמצעות כובע מסננת תא 35 מיקרומטר המותאמים צינור הידבקות 1.5 נמוך מ"ל microcentrifuge כדי לחסל גושים ופסולת יתוש.
4. לספור את המספר הכולל של sporozoites מבודד כפי שתואר לעיל ²¹ ולהתאים את הריכוז של השעיה טפיל עם DPBS 1x קר להשיג 83,000 sporozoites / μl. אחסן את הטפילים על קרח תוך המשך בשלבים הבאים.
5. אסוף את המספר השווה של בלוטות רוק מפני יתושים נגועים כי תשמשנה שליטה שלילית ולעבד המדגם כמתואר בשלבי 2.2 ו -2.3. לדלל את המדגם כמצוין לעיל כדי להשיג ריכוז דומה של תמציות בלוטת רוק ההשעיה.
   הערה: ניתן לאחסן Sporozoites על הקרח לכל היותר 2 שעות. עם זאת, באופן אידיאלי הם מוזרקים תוך שעה לאחר ריסוק בלוטות הרוק.

3. הזרקה של Sporozoites לתוך La Dermalyer של האוזן

1. להרדים בעלי חיים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג) תערובת. חכה 5-8 דקות עבור בעכבר כדי להיות במצב של חוסר הכרה וליישם משחת עיניים אל העיניים כדי למנוע התייבשות קרנית. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ בוהן עדין על רגליים אחוריות הוא.
   הערה: המינון של הרדמה נמשך פחות מ -20 דקות, כך על פי השלבים הבאים חייבים להיעשות במהירות.
2. יצבו את אפרכסת האוזן האוזן של העכבר על ידי תיקון בצד הגחון עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת (איור 1 א) סטראו. לחץ בעדינות את האוזן כדי למנוע נזק של כלי הדם.
3. טען מחט ומהוקצע 10 מזרק μl / 35 מד עם 0.6 μl של טפילים resuspended ^10.
4. לספק את ההשעיה sporozoite ב 4 המוזרקים (0.15 μl לכל אתר) על ידי החדרת מחט על הגב בצד של האוזן (איור 1 א), מתחת לאפידרמיס בקפידה, עםאת ההטיה, מקפיד להימנע מכל כלי דם. אפשר מחט להישאר בדרמיס עבור כמה שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant לפני הסרתו. שימו קשריר מאפיין בכל הזריקה בסוף ההליך (איור 1B ו 1C).
5. לאחר ההזרקה, להסיר את האוזן בזהירות מהקלטת.
6. להזריק את האוזן הנגדית באותו המינון של טפילים על ידי ביצוע שלבי 3.2-3.4.
7. להזריק 2 עכברים נוספים עם או 0.6 μl של 1x DPBS או 0.6 μl של תמצית בלוטת הרוק 1x DPBS + מפני יתושים נגוע על מנת להעריך את התגובה הדלקתית מתווכת על ידי הזרקת לבד ואת בתצהיר של חומר נגד יתושים בדרמיס.
8. צג התאוששות עכבר מן ההרדמה לפני ההצבה אותו בחזרה לתוך הכלוב.
   הערה: בתצהיר sporozoite הנאה בעור ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א ו -2), מכין את העכבר כמתואר previsously ^23.

עור 4. וניקוז הלימפה צומת Dissection

1. הכן בינוני סטנדרטי (SM) כדלקמן: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) + 25 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) בתוספת 400 U / collagenase מ"ל ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​deoxyribonuclease (DNase) .
2. הכינו שתי צלחות תרבית הרקמה 6 גם שטוח התחתונה על קרח עם 4.5 מ"ל SM + 70 מיקרומטר תא מסננת לכל טוב עבור דגימות DLN (צלחת) ו -4.5 מ"ל SM לכל טוב עבור דגימות עור (פלייט B).
3. בנקודת הזמן הרצוי הבאה חיסון sporozoite, עמוק להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (125 מ"ג / ק"ג) / xylazine (12.5 מ"ג / ק"ג) נקע בצוואר הרחם לפני התערובת. ודא העכבר מדגים סימני מוות קליני ולהתחיל לנתיחה מיד.
   הערה: קינטיקה של גיוס תא מיאלואידית יכול להיבחן במועדים שונים לאחר injשיקוף (כלומר 2 hr, 4 hr ו -24 שעות כפי שתוארו לעיל ^14).
4. לחטא את האוזן המחוסנת ובאזור הצוואר המקביל עם אתנול 70% כדי לצמצם את האפשרות של זיהום.
5. בעזרת מספריים מלקחיים סטרילית, בסביבה נקייה מחיידקים לנתח את DLN אזני הפרוקסימלי ללא איסוף השומן שמסביב. לבצע חתך ראשון מענית jugulo-carotidian ולהסיר את השערות משדה ההפעלה. למתוח את החתך עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה אפרפר לעומת הרקמה הסובבת.
6. לצבוט את רקמות החיבור בקפידה על החלק העליון של DLN עם מלקחיים כדי להקל הסרתו. חלץ את DLN ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה (איור 3 א ו 3 ב). מניחים את DLN בתוך (צלחת) מסננת תא היטב המכיל 4.5 מ"ל SM + 70 מיקרומטר.
7. קציר את האוזן המחוסנת כולו באמצעות מספריים חדים סטרילית מלקחיים (איור 4 א). separאכל את ההיבטים הגב ועל הגחון של האוזן ידי צובט וריווח מלבד הקיצוץ מסתיים עם שני מלקחיים (איור 4 ב - 4E). מניח אותם (B פלייט) 4.5 היטב המכיל מיליליטר SM מוודא הרקמות הם שקועות לחלוטין בטווח הבינוני.
   הערה: על מנת לשפר את מהימנות הניסוי ולהגדיל את מספר התאים של עניין, ברכה 2 מוזרק אוזניים או 2 dLNs מאותו העכבר לדגימה.
8. קציר ולעבד במקביל האוזניים dLNs של עכברים מחוסנים עם או 1x DPBS או תמציות של בלוטות רוק. כלול 2 דגימות אוזן והלימפה נוספות צומת קוצרות עכבר נאיבי עבור פקדי פיצוי מכתים שליליים יחיד.

בידוד תא 5. מן בלוטות הלימפה

1. דגירת בלוטות הלימפה (צלחת) ב 37 ° C + 5% CO ₂ במשך 15 דקות תחת תסיסה עדינה. הוסף 10 מ"מ הסופי חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לכל טוב לנטרל collagenase ואת acti DNasevities. בצע את הצעדים הבאים על קרח.
2. לנתק בלוטות הלימפה באמצעות הקצה העליון של הבוכנה מזרק 5 מ"ל. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן.
3. יש לשטוף את מסננת תא פעמיים עם 500 μl 1x DPBS + 2% עוברית בסרום שור (FBS) + 2 מ"מ EDTA. העבר כל נפח של הבאר בתוך שפופרת 15 מ"ל.
4. שוטפים את פעמיים היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 מ"מ EDTA ולהעביר את נפח לתוך הצינור 15 מ"ל. שמור צינורות על הקרח.

בידוד תא 6. מעור של האוזן

1. דגירת עלוני האוזן (פלייט B) ב 37 ° C + 5% CO ₂ עבור שעה 1 תחת תסיסה עדינה.
   הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, לחתוך את כרוזי אוזן עם מספריים לחתיכות קטנות כדי להקל על עיכול רקמות ולשים את הדוגמת לראש בחממה במשך 40 הדקות הנותרות. תאים בודדים ניתן לצפות בטווח הבינוני בסוף זמן הדגירה.
2. הוסף 10 מ"מ סופי EDTA לכל טוב לנטרל פעילויות collagenase ו DNase. בצע את הצעדים הבאים על קרח.
3. מעביר את שברי רקמות אוזן ואת כל הנפח של מדיום חדש המכיל גם מסנן תא 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 1ml. חותכים 2 עד 3 מ"מ מהקצה של קצה כדי לאסוף את שברי רקמות האוזן בקלות רבה יותר.
4. לנתק שברי רקמת אוזן באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק 5 מיליליטר. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן.
5. שוטפים את מסננות תא פעמיים עם 500 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
6. מעבירים את כל נפח של הבאר לתוך צינור מ"ל 50 דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
7. יש לשטוף היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולהעביר את נפח לתוך שפופרת 50 מ"ל. שמור את הצינור על הקרח.
   הערה: פעולות שונות על מנת לבודד תאים בסך הכל מן העור והרקמות DLN מסוכמים באיור 5.

1. צנטריפוגה העור דגימות DLN במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
2. אסוף נפח קטן של מדגם זה לספור את המספר הכולל של תאים מבודדים מן העור DLN באמצעות hemocytometer. להוסיף 0.04% trypan כחול כדי לקבוע את כדאיות התא.

8. חסימה ללא Antigen ספציפית מחייב

1. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CD16 נטולות-תווית / CD32 Fc-בלוק נוגדן. דגירה 20 דקות ב 4 ° C (יכול ללכת יותר).
2. הוסף 2 מ"ל של קר 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולשמור על דגימות קרח.

9. עור מכתים תאי מיאלואידית הלימפה

1. דגירת סקי חסם בעברn ו- DLN מבודדים תאים עם גשש Live / Dead (כלומר 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole או DAPI), אנטי CD45 ואנטי CD11b נוגדנים ספציפיים.
   הערות: על מנת להעשיר את תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של עניין, במיוחד אלו נדירים, CD45 ⁺ תאים לימפוציטים יכולים להיות מטוהרים בהתאמה מהעור או מדולדלת מן DLN ידי מיון תא מגנטי חרוז עזר '. מאחר שרוב התאים המבודדים מן DLN הם CD45 ^+, השימוש בתרופות אנטי-CD45 הוא לא חובה. ניתן לכלול סמנים אחרים לזהות תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של הריבית על ידי אסטרטגיה חיובית או שלילית-gating. בפרוטוקול זה, התאים מיאלואידית גייס את DLN הועשרו על ידי למעט תאי CD8α ⁺ (תא תא T כולו יכול להיות ממוקד באמצעות נוגדן ספציפי אנטי CD3).
2. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך. הוספת 500 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 מ"מ EDTA, צנטריפוגה דקות מדגם 5 ב 450 XG ב 4 ° C ו להתעלמות Supernatant. חזור על השלב לשטוף פעמיים.
3. Resuspend דגימות עם 300 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 mM EDTA. מעביר את כל הנפח בתוך שפופרת FACS דרך מסננת תא 35 מיקרומטר. יש לשטוף את המסנן עם 100 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
4. הפעל את התאים מוכתמים בתוך cytometer זרימה. שער לחיות תאים בודדים (DAPI ^-, FSC-W) כדי לכלול תאים ו כפילויות מתים. מגרש CD45 ⁺ CD11b ⁺ אירועים העור (איור 6 א) ו- ⁽⁺ CD45) CD8α ^- CD11b ⁺ אירועים עבור (6B איור) DLN.

אנחנו לאחרונה הראינו כי הזרקת מחט מזרק של מינונים מחסנים של פ berghei sporozoites בעור העכבר גורם גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear ואחריו מונוציטים דלקתיים בעור DLN 19. באזור הפרוטוקול שתואר לעיל מפרט את ההליך המשמש לבודד תאי מיאלואידית חיו בהצלחה משני ברקמות באות זריקות מרובות של מספר רב של sporozoites בדרמיס האוזן (איורים 1 ו -2). בתוך 24 השעות הראשונות, DLN (איור 3) ואת זריקת עור (איור 4) היו מבודדים ומעובד כפי שמסוכם איור 5 לנתח את חדירת הסלולר על ידי זרימה רבה פרמטריים cytometry. בסך הכל, טכניקה זו אפשרה לנו לבודד בממוצע 10 4 CD45 + CD11b + ו- 2.10 4 CD11b + תאים בודדים חיעבור העור DLN בהתאמה. הכדאיות המקובלת של תאי בודדים שאינם פסולת נעה בין 40-70% עבור העור 70-90% עבור DLN. כפי שניתן לראות בתרשים 6, תדירות של תאים מיאלואידית בעור (CD45 + CD11b +) ואת DLN (CD8α - CD11b +) המגביר משמעותית לאחר ההזרקה intradermal של RAS לעומת עכברים שלא נדבקו.

איור 1: אני ntradermal הזרקת Sporozoites לתוך האוזן של עכבר. תמונה (A) מראה זריקה תוך-עורית של sporozoites של אפרכסת האוזן האוזן של העכבר בהרדמה. צד הגחון של האוזן הוא התייצב עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת מיקרוסקופ לנתח. המחט מוחדרת בזהירות בצד הגבי של האוזן, מתחת לאפידרמיס, עם למעלה שפוע. (B - Cתמונות) מראה את הגב בצד של אפרכסת האוזן האוזן לפני (B) ואחרי (ג) הזרקה תוך-עורית של 0.1-0.2 μl של השעיה טפיל. קשריר מאפיין (חץ שחור) ניתן לצפות באזור הזריקה בסוף המבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 2: הדמיה של Sporozoites שהופקדו האוזן הדרמיס של עכבר (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה RAS נודדות מאתר ההזרקה (מסומן על ידי קווים מקווקווים) בעור עכבר 15 דקות לאחר ההזרקה (בר סולם = 60 מיקרומטר; 10X הַגדָלָה). הנתיב של sporozoites מיוצג על ידי הקרנת העוצמה המקסימלית של האות ניאון. מחדש קרינה ירוקה ואדוםspectively יראה את מיקומך הטפיל בעור בתחילה ואחרי 10 שניות של רכישה. (ב) הגדלה גבוהה של RAS (ירוק) מוזרק בעור (בר סולם = 20 מיקרומטר; 25x הגדלה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ניקוז עיבוד הלימפה (א) תמונה המציגה דיסקציה של DLN אזני הפרוקסימלי לאחר ההזרקה intradermal של אוונס כחול למטרות הדגמה.. לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, הצוואר הוא לחטא עם אתנול 70%. החתך ראשון הוא עשה באזור צוואר-התרדמה במספרי חדי העור הוסר משדה ההפעלה. החתך נמתח עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה גרעייש לעומת הרקמה הסובבת. רקמות החיבור ואז הם צבטו בזהירות עם מלקחיים על החלק העליון של DLN בהדרגה להינתק ממנה. לבסוף, DLN מופק על ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה. (ב) תמונה מראה את DLN חילוץ ירידה של PBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4:. עיבוד עור אוזן תמונות מראות את השלבים הרצופים לעבד את האוזן המחוסנת. (א) לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, האוזן היא לחטא עם 70% אתנול ו להסיר באמצעות מספרי מלקחיים חדים סטרילי. (B - D) הגבו והיבטי גחון של האוזן מופרדים בקלילות על ידי צובט ו- sצעדה בנפרד לחתוך מסתיימת עם שני מלקחיים. (ה) תמונה המציגה את ההיבטים הגב ועל הגחון של טיפול אנזימטי לפני האוזן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5:.. סיכום פרוטוקול ייצוג סכמטי של השלבים העיקריים לבודדות תאים הכוללים מן העור ורקמות DLN אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: אוכלוסיית תאים מיאלואידית מבודדת מעור האוזן ואת DLN הפרוקסימלי מגרש FACS נציג מראה את.האסטרטגיה gating לנתח בתא מיאלואידית בעור (א) ואת DLN (B). CD45 + CD11b + ו- CD8α - CD11b + תאים היו מגודרים על אירועי גופייה הכוללים חיים עבור העור DLN בהתאמה. עבור כל תנאי, 5 x 10 5 סך כל האירועים נרכשו (2 האוזניים ו -2 DLN ונקווה לדגימה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.