עבודה זו מתארת פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מזין ללא גזירת "מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מייצגים פלטפורמה לחקר התפתחות אנושית במבחנה בתנאים נורמליים ומחלה כאחד. חוקרים יכולים לכוון את ההתמיינות של hPSCs לסוג התא המעניין על ידי מניפולציה של תנאי התרבית כדי לסכם את האותות שנראו במהלך ההתפתחות. סוג תאים אחד כזה הוא המלנוציט, תא מייצר פיגמנט ממקור פסגה עצבית (NC) האחראי על הגנה על העור מפני קרינת UV. פרוטוקול זה מציג הרחבה של פרוטוקול התמיינות Neural Crest הזמין כיום במבחנה מ-hPSCs כדי להבדיל עוד יותר NC למלנוציטים פיגמנטיים מלאים. ניתן להעשיר את מבשרי המלנוציטים מפרוטוקול Neural Crest באמצעות חשיפה מתוזמנת למפעילים של איתות WNT, BMP ו-EDN3 בתנאי עיכוב SMAD כפול. מבשרי המלנוציטים המתקבלים מטוהרים ומבשילים למלנוציטים פיגמנטיים לחלוטין על ידי תרבית במדיום סלקטיבי. המלנוציטים המתקבלים הם פיגמנטיים לחלוטין ומכתימים כראוי לחלבונים האופייניים למלנוציטים בוגרים.
מבוא
תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) לספק פלטפורמה לחקות בידול נורמלי להרחבת אופנת דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולי התחדשות תאי 1-6. מעניין במיוחד, hPSCs לפתוח אפיקים ללימוד קשה לבודד או נדירים / סוגי תאים חולפים שבו דגימות חולות הן נדירות. יתר על כן, תאי גזע מושרים (iPSCs) לאפשר לחוקרים ללמוד פיתוח מודלי מחלה באופן ספציפי לחולה לפענח מנגנונים ייחודיים 1,2,7-11. הפרוטוקול שפורסם בעבר לבידול של מלנוציטים מ hPSCs דורש עד 6 שבועות של בידול כרוך תאים culturing עם בינוני מותנה מתאי L-Wnt3a 12. הפרוטוקול מובא לראשונה על ידי מיכה et al. ותאר כאן מייצר תאי פיגמנט בשלושה שבועות ומסיר את העמימות וח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול מלנוציט המפורטים כאן הוצגה לראשונה על ידי מיכה et al.
1. הכנת בינוני תרבות, מצופה כלים ותחזוקה של hPSCs
- הכנת בינוני
הערה: יש לאחסן את כל מדיום ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. לסנן את כל בינוני עבור עיקור.- כן DMEM / 10% FBS. מערבבים 885 מ"ל DMEM, 100 FBS מ"ל, 10 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס ו -5 מ"ל L-גלוטמין. מסנן עבור עיקור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מספק שיטה להפקה, מלנוציטים בוגר פיגמנט לחלוטין מן hPSCs בצורה במבחנה ללא מזין, עלות היעילה, לשחזור. בניגוד לפרוטוקול פאנג הוקם בעבר et al. עבור מלנוציטים נגזרים hPSC, הפרוטוקול המתואר אינו המחייב בינוני מותנים ומפחית את דרישת הזמן. פאנג ואח הפרוטוקול. מנוצל בינוני מותנה משורת תאים בעכברים מייצר WNT3A ולקח עד 6 שבועות לדמיין פיגמנטציה 6,12. כדי להטות את תאי גזע רכס העצביים כלפי גורל מלנוציט (melanobl.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבור הבידול המוצלח של מלנוציטים מ hPSCs את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. בראש ובראשונה, חשוב לעבוד בתנאי תרבות סטרילית בכל העת. בנוסף, חשוב להתחיל עם פלוריפוטנטיים, hPSCs מובחן לחלוטין; אם האוכלוסייה החלה מכילה תאים מובחנים התשואה תמיד תרד כגורם הזיהום לא יכול להיות מופנה כלפי מלנוציטים ועלול עוד יותר לשבש את תאי מבדילים כראוי.
כדי להבטיח את התאים נשארים פלוריפוטנטיים דואגים להתאים לכללים והמבוססים לצורך תחז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין המחברים אינטרסים מנוגדים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מלנומה מקרן ג'ואנה מ ניקולאי ועל ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת רות ל Kirschstein הלאומית למחקר שירות הפרס F31. עבודה זו נתמכה על עוד דרך מענקי NYSTEM והיוזמה תא גזע Tri-המוסדית (סטאר הקרן).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo טרנספרין אנושי | Sigma | T1147 | |
| חומצה אסקורבית (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 מ"מ |
| B27 (תוסף B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| &-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 מ"ג/מ"ל |
| BMP4 | מו"פ D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 מ"מ |
| רעלן כולרה | סיגמא | C8052 | 50 מ"ג/מ"ל |
| cAMP (cyclicAMP) | סיגמא | D0627 | 100 מ"מ |
| דקסמתזון | סיגמא | D2915-100 מ"ג | 50 μ M |
| DMEM - Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת נוטריאנטים F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| אבקת DMEM/F12 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (אנדותלין-3, אנושי) | חברת הפפטידים האמריקאית | 88-5-10B | 100 μ M |
| פיברונקטין | BD Biosciences | 356008 | 200 μ גרם/מ"ל |
| ג'לטין (PBS ללא מ"ג/Ca) | בבית | 0.1% ב-PBS | |
| גלוקוז | סיגמא | G7021 | |
| אינסולין אנושי | סיגמא | I2643 | |
| ITS+ תוסף תרבית אוניברסלי Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (החלפת סרום נוק-אאוט) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| נוקאאוט DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-גלוטמין | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 מ"מ |
| דל גלוקוז DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| מטריצת מטריג'ל | BD Biosciences | 354234 | להמיס 1:20 ב-DMEM/F12 |
| MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| MEM תמיסת חומצות אמינו חיוניות מינימליות | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| פיברובלסטים עובריים של עכבר (7 מיליון תאים/בקבוקון) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| עכבר Laminin-I | מו"פ D Systems | 3400-010-01 | 1 מ"ג/מ"ל |
| מדיום נוירו-בזאלי | Invitrogen | 21103049 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 מ"ג/מ"ל |
| פרוגסטרון | סיגמא | P8783 | 0.032 גרם ב-100 מ"ל 100% אתנול |
| פוטרסין דיהידרוכלוריד | סיגמא | P5780 | |
| FGF2 (בסיסי FGF אנושי רקומביננטי) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 מ"ג/מ"ל |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1814 | 10 מ"מ |
| סלניט | סיגמא | S5261 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא | S5761 | |
| SCF (גורם תאי גזע, אדם רקומביננטי) | פפרוטק בע"מ | 300-07 | 50 μ גרם/מ"ל |
| TYRP1 (G-17) נוגדן | סנטה קרוז | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 נוגדן | Abcam | 74073 | 1:200 |
| טריפסין-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד | Tocris-R& די סיסטמס | 1254 | 10 מ"מ |
מקורות
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
