הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מזין ללא גזירת "מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

3 במרץ 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.

תקציר

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מייצגים פלטפורמה לחקר התפתחות אנושית במבחנה בתנאים נורמליים ומחלה כאחד. חוקרים יכולים לכוון את ההתמיינות של hPSCs לסוג התא המעניין על ידי מניפולציה של תנאי התרבית כדי לסכם את האותות שנראו במהלך ההתפתחות. סוג תאים אחד כזה הוא המלנוציט, תא מייצר פיגמנט ממקור פסגה עצבית (NC) האחראי על הגנה על העור מפני קרינת UV. פרוטוקול זה מציג הרחבה של פרוטוקול התמיינות Neural Crest הזמין כיום במבחנה מ-hPSCs כדי להבדיל עוד יותר NC למלנוציטים פיגמנטיים מלאים. ניתן להעשיר את מבשרי המלנוציטים מפרוטוקול Neural Crest באמצעות חשיפה מתוזמנת למפעילים של איתות WNT, BMP ו-EDN3 בתנאי עיכוב SMAD כפול. מבשרי המלנוציטים המתקבלים מטוהרים ומבשילים למלנוציטים פיגמנטיים לחלוטין על ידי תרבית במדיום סלקטיבי. המלנוציטים המתקבלים הם פיגמנטיים לחלוטין ומכתימים כראוי לחלבונים האופייניים למלנוציטים בוגרים.

מבוא

תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) לספק פלטפורמה לחקות בידול נורמלי להרחבת אופנת דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולי התחדשות תאי 1-6. מעניין במיוחד, hPSCs לפתוח אפיקים ללימוד קשה לבודד או נדירים / סוגי תאים חולפים שבו דגימות חולות הן נדירות. יתר על כן, תאי גזע מושרים (iPSCs) לאפשר לחוקרים ללמוד פיתוח מודלי מחלה באופן ספציפי לחולה לפענח מנגנונים ייחודיים 1,2,7-11. הפרוטוקול שפורסם בעבר לבידול של מלנוציטים מ hPSCs דורש עד 6 שבועות של בידול כרוך תאים culturing עם בינוני מותנה מתאי L-Wnt3a 12. הפרוטוקול מובא לראשונה על ידי מיכה et al. ותאר כאן מייצר תאי פיגמנט בשלושה שבועות ומסיר את העמימות וחוסר עקביות הקשורים בינוני מותנה.

מלנוציטים arדואר נגזר הרכס העצבי, אוכלוסיית נדידה של תאים ייחודיים בעלי חוליות. הרכס העצבי מוגדר במהלך gastrulation ומייצג אוכלוסייה של תאים בקצה ההצלחה העצבית, גובל בין עצביים האאקטודרם שאינם עצביים. במהלך neurulation, רקמת העצבים מתפתחת מתוך צלחת עצבית כדי ליצור קפלים עצביים, אשר מתכנסים על קו אמצע הגב וכתוצאה מכך 13,14 בצינור העצבי.

התאים הרכס העצבי לצאת מהצלחת הגג של הצינור העצבי, מול notochord, ו לעבור אפיתל המעבר mesenchymal לפני נודדות הרחק להצמיח אוכלוסיה מגוונת של תאים מובחנים. גורלן של תאי הרכס מוגדר בחלקו על ידי המיקום אנטומי של צלחת הגג לאורך ציר הגוף של העובר. נגזר תאי רכס עצבי כולל שושלות אופייניות הוא mesoderm (תאי שריר חלק, osteoblasts, adipocytes, chondrocytes) ותאי האאקטודרם (מלנוציטים, ג שוואןאמות, נוירונים) 14. תאי גזע רכס עצביים upregulate גורם שעתוק SOX10 ויכולים להיות מבודד על ידי תא מופעל קרינת מיון עם נוגדני p75 ו HNK1.

תאי הרכס העצביים נגזרו להיות מלנוציטים לעבור שלב melanoblast ו upregulate KIT ו MITF (גורם שעתוק הקשורים microphthalmia) 6,21 MITF הוא רגולטור של פיתוח מלנוציט ומהווה גורם שעתוק אחראי לשליטה הרבה של פיתוח מלנוציט 22- 24. melanoblasts אדם נודד אל שכבת הבסיס של האפידרמיס שבו הם מתגוררים בין אם בליטת השיער או מוקף קרטינוציטים באפידרמיס (הקמת יחידות פיגמנטציה) לשמש מבשר אל מלנוציטים הבוגר, פיגמנט. הבידול וההתבגרות של melanoblasts לתוך מלנוציטים פיגמנט מתרחשים בד בבד עם קולוניזציה של נורת השיער וביטוי של מסלול ייצור המלנין (TYRP1, TYR, OCA2 וPMEL) 25,26.

בידוד מלנוציטים אדם melanoblasts מחולים הוא יקר, קשה להגביל בכמות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבחין hPSCs (induced או עוברי) לתוך מלנוציטים או מבשרי מלנוציט בשיטה מוגדרת היטב, מהירה, לשחזור, מדרגים, וזולה ללא מיון תא. הפרוטוקול שמש בעבר לזהות פגמים ספציפיים למחלה כאשר הבחנת iPSCs מחול עם הפרעות פיגמנטציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול מלנוציט המפורטים כאן הוצגה לראשונה על ידי מיכה et al.

1. הכנת בינוני תרבות, מצופה כלים ותחזוקה של hPSCs

  1. הכנת בינוני
    הערה: יש לאחסן את כל מדיום ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. לסנן את כל בינוני עבור עיקור.
    1. כן DMEM / 10% FBS. מערבבים 885 מ"ל DMEM, 100 FBS מ"ל, 10 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס ו -5 מ"ל L-גלוטמין. מסנן עבור עיקור.
    2. כן-בינוני hESC. מערבבים 800 מ"ל DMEM / F12, 200 מ"ל KSR, 5 מ"ל L-Glutamine, 10 מ"ל ממ פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום, 1 מ"ל β-mercaptoethanol, ו -5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס. לאחר סינון להוסיף 10 ng / ml FGF-2.
    3. הכן בינוני KSR-בידול: מערבבים 820 מ"ל נוק DMEM, 150 מ"ל KSR, 10 מ"ל L-Glutamine, 10 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס, 10 מ"ל ממ פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום 1 מ"ל β-mercaptoethanol. מסנן עבור עיקור.
    4. כן בינוני N2 בידול. ממיסים 12 גרם DMEM / F12 אני אבקתn 980 מ"ל DH 2 O. להוסיף גלוקוז 1.55 גר ', 2 גרם סודיום ביקרבונט ו -100 transferrin האדם apo מ"ג. מערבבים 2 מ"ל DH 2 O עם 25 מ"ג אינסולין לאדם 40 μl 1 N NaOH; פעם מומסת, מוסיף את התערובת למדיום. הוספת 100 dihydrochloride פוטרסין μl, 60 סלניט μl, 100 פרוגסטרון μl. תביא את הנפח הסופי 1 ליטר עם DH 2 O לפני הסינון.
    5. כן בינוני מלנוציט מלא. שלב 50% בינוני Neurobasal, 30% DMEM גלוקוז נמוך, ו -20% MCDB201. להוסיף זה: 0.8% + ITS, 250 ננומטר L- גלוטמין, 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית (L-AA), 50 ng / ml רעלן הכולרה, 50 ng / ml SCF, 0.05 מיקרומטר Dexamethasone, 100 ננומטר EDN3, 4 ng / FGF2 מ"ל . סינון סטרילי ואז להוסיף ריאגנטים הנותרים: תוספת B27 2%, 25 ng / ml BMP4, 3 מיקרומטר CHIR99021, cAMP מיקרומטר 500.
  2. ציפוי של תרבות מנות
    1. לבצע ציפוי באמצעות חלבון דביק כגון Matrigel. לקראת הפתיחה המחודשת, aliquot ולהקפיא Matrigel לתוך 1 מ"ל חלקים כדי למנוע ג ההפשרה להקפיא חוזרותycles. ההפשרה מחדש להשעות aliquot קפוא 1 מ"ל עם 19 מ"ל DMEM / F12. פלייט 5 מ"ל על צלחת 10 ס"מ. דגירת המנות עבור שעה 1 ב RT. לשאוב החלבון הדביק מייד לפני ציפוי התא ולשטוף עם DMEM / F12.
    2. לבצע ציפוי באמצעות פולי-L ornithin hydrobromide / עכבר Laminin-I / פיברונקטין (PO / לאם / FN). צלחת מעיל עם PBS המכיל 15 מיקרוגרם / מ"ל ​​Poly-L ornithin hydrobromide. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. לשאוב את הפתרון לשטוף את הצלחות עם PBS שלוש פעמים לפני ציפוי עם PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​עכבר Laminin-I ו- 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין. דגירה מנות O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified.
      1. לפני תאי ציפוי, לשאוב את הפתרון ולתת הצלחות להתייבש היטב ללא מכסה למכסת המנוע בתרבית הרקמה. אפשר הצלחות להתייבש במשך כ 10-15 דקות.
        הערה: המנות יבשות ומוכנות ציפוי תא כאשר מבנים גבישיים להופיע על פני השטח על ידי עין. plates יכולים להישמר עם PBS המכיל LAM / FN בחממה במשך שבועיים, כל עוד הנוזל אינו להתאדות. הלוחות יכולים להישמר יבשים ב RT במשך כמה שעות.
  3. תחזוקה של hPSCs
    הערה: hPSCs נשמרות על ג'לטין 0.1% ו פיברובלסטים עובריים בעכבר מומת mitotically (MEFs) ב-בינוני hESC. התאים יש לפצל כל 6-8 ימים.
    1. מעיל צלחת 10 ס"מ עם ג'לטין 0.1% ב PBS ב RT במשך 5 דקות.
    2. להפשיר MEFs קפוא במהירות באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
    3. לשאוב את הג'לטין ואת צלחת התאים. MEFs פלייט בצפיפות של ~ 50,000 תאים / 2 ס"מ ב FBS DMEM / 10%. דגירה MEFs ב 37 ° CO / N לפני הוספת hPSCs.
    4. לשאוב FBS DMEM / 10% מהצלחת MEF מוכן, לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף 10 מ"ל בינוני hESC עם hPSCs. המסדרון, hPSCs לפי יחס של 1: 5/10 תלוי צפיפות לפני passaging.
      הערה: אם hPSCs שמתבצע מופשר או passaged כמו תאים בודדים, supplement עם 10 מיקרומטר Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) עד המעבר הראשון.
    5. Feed תאים יומי עם טרי 10 מ"ל בינוני hESC.
    6. לפני שמתחילים יש ליצור בידול להסיר כל מושבות פלוריפוטנטיים המופיעים להכיל תאים מובחנים, גבולות לא סדירים, או מרכזי שקוף 28. מבחינה מכאנית לסלק לשאוב מושבות הסדירות עם טפטפת מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית עם מיקרוסקופ לנתח.

ציפוי 2. של hPSCs לבידול

הערה: תנאי בידול מתוארים עבור 10 מנות ס"מ.

  1. הכן 10 ס"מ מנות Matrigel לפני תחילת בידול כמתואר שלב 1.3.1.
  2. כאשר hPSCs ציפוי עבור בידול להתחיל עם צלחת של hPSCs בצפיפות מוכן למעבר (~ 80% ומחוברות) לשאוב בינוני hESC, לשטוף עם PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA על התאים.
  3. במרץ לנער את צלחת horizontally עבור 2 דקות תוך הדמיה תחת מיקרוסקופ עד MEFs להמריא כמו תאים בודדים. מושבות hPSC צריכות להישאר מחוברות כקולוניות.
  4. לשאוב טריפסין לאחר MEFs נוקף אבל לפני המושבות hPSCs לנתק.
  5. הוסף 10 מ"ל של מדיום hESC המכיל 10 מיקרומטר dihydrochloride Y-27632 לצלחת ולנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה על המושבות.
  6. לשאוב את הפתרון Matrigel מצלחת 10 ס"מ מוכן בשלב 2.1 ולשטוף עם DMEM / F12 כדי להסיר גושים. פלייט hPSCs ביחס של 1: יחס 2 לצלחת Matrigel. התוספת בינוני hESC המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 dihydrochloride עד 10 מ"ל. לדגור על 37 מעלות CO / N.
    הערה: ציפוי זה אמור לגרום כ 100,000 תאים / 2 ס"מ.

3. אינדוקציה של בידול העצבי

הערה: בידול יש ליזום (יום 0) כאשר hPSCs הם 80% ומחוברות. התאים יכולים להיות מוזנים יומי עם-בינוני hESC10 מיקרומטר Y-27632 המכיל dihydrochloride עד תחילת בידול.

  1. ביום 0 וביום 1, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום KSR-בידול המכיל LDN193189 100 ננומטר ו -10 מיקרומטר SB431542.
  2. ביום 2, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום בידול KSR המכיל LDN193189 100 ננומטר, 10 מיקרומטר SB431542 ו -3 מיקרומטר CHIR99021.
  3. ביום 3, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום KSR-בידול המכיל 10 מיקרומטר SB431542 ו -3 מיקרומטר CHIR99021.
  4. בימים 4 ו -5 להאכיל את התאים עם 15 מ"ל של 75% בינוני KSR-בידול 25% בינוני N2 בידול המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021.
    הערה: אל תיבהל לראות כמות גדולה של מוות של תאים מבחינת תאים צפים. זוהי תופעה רגילה שיש לצפות.
  5. בימים 6 ו -7 להאכיל את התאים עם 15 מ"ל של 50% בינוני KSR-בידול 50% בינוני N2 בידול הן המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.
  6. בימים 8ו -9 להאכיל את התאים עם 20 מ"ל של 25% בינוני KSR-בידול 75% N2 בידול הן מדיום המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.
  7. בימים 9 ו -10 להכין PO / לאם / מנות FN כמצוין 1.2.2 עבור מחדש ציפוי של תאים ביום 11.
  8. ביום 10 תאים להאכיל עם 20 מ"ל של מדיום N2 בידול המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.

4. replating בטיפות עבור מפרט NC

  1. ביום 11 לשאוב לאם / FN מן PO / LAM / FN צלחות המוכנות ויבשות לחלוטין.
  2. הסר בינוני 11 תאים יום, לשטוף עם PBS ולהוסיף פתרון ניתוק התא 4 מ"ל כגון Accutase לכל צלחת 10 ס"מ. דגירה של 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 5 מ"ל של מדיום מלאה מלנוציט כדי בצלחת resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה באופן ידני עם טפטפת 10 מ"ל עד שכל התאים נוקף מהצלחת. מעבירים את ההשעיה לצינור 15 מ"ל.
  4. ספיןתאים למטה במשך 5 דקות ב 200 XG ו resuspend התאים ב 2 x 10 6 תאים לכל מ"ל במדיום מלאה מלנוציט. ספירת התאים באמצעות ההרחקה trypan הכחולה על hemocytometer או טכניקה מקבילה.
  5. פלייט 10 μl טיפות קרובים זה לזה (בלעדיהם נגיעה) על PO / לאם / FN 10 ס"מ מנות יבשים. אם הצליח כבר יבש מספיק, הטיפין צריכות מוגדרות היטב בקצוות ולא לרוץ.
    הערה: זה יוצר סביבה מקומית צפיפות גבוהה עבור התאים, וזה חשוב כאשר replating התאים, תוך שמירה על חדר בתוך הצלחת להתרחבות.
  6. אפשר טיפות לעמוד ב RT במשך 10-20 דקות, כדי לאפשר לתאים לדבוק, ואז לאט לאט (לא להפריע תאים המצורפת) להוסיף 10 מ"ל של מדיום מלאה מלנוציט. זז צלחת אל האינקובטור.

5. הרחבת מלנוציט אבות

  1. המשך האכלה עם מדיום מלנוציט מלא כל 2 עד 3 ימים.
    הערה: פיגמנטציה צריך להתחיל להיות גלוי within אשכולות של תאים עד סוף השבוע הראשון ולהיות ברורים מאוד מצד בשבוע השני. הצג את הצלחת מעל רקע לבן כמו דף הנייר להבחין מוקדם אלה אשכולות קטנים וחשוכים. תאים יהפכו יותר ויותר פיגמנט לאורך זמן, עד שהצליח כולו הוא אחיד פיגמנט (ראה תרשים 2B).
  2. תאי המעבר פעם בשבוע ביחס של ~ 1: 6 (ציפוי כמו טיפות כבר לא נחוץ בשלב זה). השתמש Accutase לנתק תאים ולשטוף פעמיים עם מדיום Neurobasal רגיל לפני מחדש ציפוי במדיום מלאה מלנוציט. שמור על תאים על PO / LAM / צלחות FN.
    הערה: מצאנו כי המדיום המלא מלנוציט הוא מתאים ביותר עבור שמירה והרחבת hESC ו מלנוציטים נגזרים iPSC. עם זאת, תאים יכולים להיות מתורבתים בקצרה במדיום זמין מסחרי M254 אבל התקשורת פשוט מעלה את הסיכון של תאים המתים והרמה מהצלחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מספק שיטה להפקה, מלנוציטים בוגר פיגמנט לחלוטין מן hPSCs בצורה במבחנה ללא מזין, עלות היעילה, לשחזור. בניגוד לפרוטוקול פאנג הוקם בעבר et al. עבור מלנוציטים נגזרים hPSC, הפרוטוקול המתואר אינו המחייב בינוני מותנים ומפחית את דרישת הזמן. פאנג ואח הפרוטוקול. מנוצל בינוני מותנה משורת תאים בעכברים מייצר WNT3A ולקח עד 6 שבועות לדמיין פיגמנטציה 6,12. כדי להטות את תאי גזע רכס העצביים כלפי גורל מלנוציט (melanobl...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבור הבידול המוצלח של מלנוציטים מ hPSCs את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. בראש ובראשונה, חשוב לעבוד בתנאי תרבות סטרילית בכל העת. בנוסף, חשוב להתחיל עם פלוריפוטנטיים, hPSCs מובחן לחלוטין; אם האוכלוסייה החלה מכילה תאים מובחנים התשואה תמיד תרד כגורם הזיהום לא יכול להיות מופנה כלפי מלנוציטים ועלול עוד יותר לשבש את תאי מבדילים כראוי.

כדי להבטיח את התאים נשארים פלוריפוטנטיים דואגים להתאים לכללים והמבוססים לצורך תחז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין המחברים אינטרסים מנוגדים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מלנומה מקרן ג'ואנה מ ניקולאי ועל ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת רות ל Kirschstein הלאומית למחקר שירות הפרס F31. עבודה זו נתמכה על עוד דרך מענקי NYSTEM והיוזמה תא גזע Tri-המוסדית (סטאר הקרן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo טרנספרין אנושיSigmaT1147
חומצה אסקורבית (L-AA)SigmaA4034100 מ"מ
B27 (תוסף B27)Invitrogen17504044
&-MercaptoethanolGibco-Life Technologies21985-02310 מ"ג/מ"ל
BMP4מו"פ D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 מ"מ
רעלן כולרהסיגמאC805250 מ"ג/מ"ל
cAMP (cyclicAMP)סיגמאD0627100 מ"מ
דקסמתזוןסיגמאD2915-100 מ"ג50 μ M
DMEM - Modified Eagle MediumGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת נוטריאנטים F-12Gibco-Life Technologies1133--032
אבקת DMEM/F12Invitrogen12500-096
EDN3 (אנדותלין-3, אנושי)חברת הפפטידים האמריקאית88-5-10B100 μ M
פיברונקטיןBD Biosciences356008200 μ גרם/מ"ל
ג'לטין (PBS ללא מ"ג/Ca)בבית0.1% ב-PBS
גלוקוזסיגמאG7021
אינסולין אנושיסיגמאI2643
ITS+ תוסף תרבית אוניברסלי Premix BD Biosciences354352
KSR (החלפת סרום נוק-אאוט)Gibco-Life Technologies10828-028
נוקאאוט DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-גלוטמיןGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 מ"מ
דל גלוקוז DMEMInvitrogen11885-084
מטריצת מטריג'לBD Biosciences354234להמיס 1:20 ב-DMEM/F12
MCDB201SigmaM6770
MEM תמיסת חומצות אמינו חיוניות מינימליותGibco-Life Technologies11140-080
פיברובלסטים עובריים של עכבר (7 מיליון תאים/בקבוקון)GlobalStemGSC-8105M
עכבר Laminin-Iמו"פ D Systems3400-010-011 מ"ג/מ"ל
מדיום נוירו-בזאליInvitrogen21103049
פניצילין/סטרפטומיציןGibco-Life Technologies15140-12210,000 U/ml
Poly-L Omithin hydrobromideSigmaP365515 מ"ג/מ"ל 
פרוגסטרוןסיגמאP87830.032 גרם ב-100 מ"ל 100% אתנול
פוטרסין דיהידרוכלורידסיגמאP5780
FGF2 (בסיסי FGF אנושי רקומביננטי)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 מ"ג/מ"ל
SB431542Tocris-R& D Systems181410 מ"מ
סלניטסיגמאS5261
נתרן ביקרבונטסיגמאS5761
SCF (גורם תאי גזע, אדם רקומביננטי) פפרוטק בע"מ300-0750 μ גרם/מ"ל
TYRP1 (G-17) נוגדןסנטה קרוז104431:200
TYRP2 נוגדןAbcam740731:200
טריפסין-EDTA (0.05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 דיהידרוכלורידTocris-R& די סיסטמס125410 מ"מ
בינוני

מקורות

  1. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  4. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
  7. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  8. Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
  9. Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  10. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
  11. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  12. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
  13. Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
  14. White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
  15. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  16. Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
  17. Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
  18. Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
  19. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
  20. Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
  21. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
  22. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
  23. Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
  24. Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064(2011).
  25. Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
  26. Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
  27. Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
  28. Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
  29. Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

WNT BMP EDN3Dual SMADPO Laminin Fibronectin
מזין ללא גזירת "מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.