הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 במרץ 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

פרסום זה מדגים שיטות לדגימה ותרבית מוצלחת של רירית אפיתל האף מילדים, ותכנות מחדש של תאים אלה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs).

תקציר

תאי אפיתל באף (NECs) הם החלק של דרכי הנשימה המגיבים למזהמי אוויר והם התאים הראשונים הנגועים בנגיפי נשימה. הם גם מעורבים במחלות רבות של דרכי הנשימה באמצעות התגובה החיסונית המולדת שלהם והאינטראקציה עם תאי סטרומה של מערכת החיסון ודרכי הנשימה. NECs מעניינים במיוחד למחקרים בילדים בשל נגישותם במהלך ביקורים קליניים. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) נוצרו מסוגי תאים מרובים ומהווים כלי רב עוצמה למידול התפתחות ומחלות אנושיות, כמו גם ליישומים הפוטנציאליים שלהם ברפואה רגנרטיבית. זהו הפרוטוקול הראשון שפורס שיטות לייצור מוצלח של iPSCs מ-NECs שמקורם במשתתפים ילדים למטרות מחקר. הוא מתאר כיצד להשיג תאי אפיתל באף מילדים, כיצד לייצר תרביות NEC ראשוניות מדגימות אלה, וכיצד לתכנת מחדש NECs ראשוניים ל-iPSCs מאופיינים היטב. דגימות רירית האף שימושיות במחקרים אפידמיולוגיים הקשורים להשפעות זיהום אוויר בילדים, ומספקות כלי חשוב לחקר מחלות דרכי הנשימה. תאי אף ראשוניים ו-iPSCs הנגזרים מהם יכולים להוות כלי לאספקת חומר בלתי מוגבל למחקר ספציפי למטופל בתחומים מגוונים של ביולוגיה אפיתל של דרכי הנשימה, כולל מחקר אסתמה ו-COPD.

מבוא

תאי גזע מושרים ממדגם אדם (hiPSCs) הם טכנולוגיה לפיתוח מהיר של חקר תאי גזע. הם מציעים אלטרנטיבת תאי גזע עובריים (hESC) מחקר עם הרבה פחות 1,2 חסרונות אתיים ומוסריים. למרות שהם אינם זהים epigenetically כדי hESCs 3-5, hiPSCs מציע דרך ייחודית לבנות מודל פנוטיפים התפתחות ומחלות, והם יכולים לנבוע רקמות רלוונטיות למצב המחלה 5-8. שיטות חדשות של hiPSCs יצירת נבדקות ללא הרף כדי לזהות סוגי תאים אופטימלי להתחיל עם, כדרך להכין iPSCs GMP באיכות מתאימה להשתלה, וגם להגדיל את העיתוי ואת היעילות של תהליך תכנות מחדש 6,9-11.

תאי אפיתל דרכי נשימה הם קריטיים בהתפתחות דלקת אלרגית 12, ו האפיתל הוא נהג עיקרי של תגובות אלרגיות שיפוץ דרך נשימה באמצעות אינטראקציה עם immunתאי דואר סטרומה. אפיתל דרכי הנשימה ממלאת תפקיד חיוני מהמוצא וההתמדה של מחלות ריאה כגון אסטמה. עם זאת, תאי אפיתל דרכי נשימה תחתונה קשים להשיג במסגרת רפואית, במיוחד מחולים וילדי ביקורת בריאים. נתונים ממחקרים כמה תומכי ההנחה כי תאי אפיתל מן רירית אף הם פרוקסי תקף ומעשי עבור תאי אפיתל דרכי נשימה נמוכה 13-20, במיוחד כאשר לומדים תגובות מזהמי אוויר אלרגנים. רירית האף מורכבת יותר מ -90% דרך נשימה ריסי בתאי אפיתל דגימה לתאי האפיתל אף אלה (NECs) יכולה להתבצע בקלות אצל ילדים צעירים כמו גיל ארבעה או חמש, כפי שהוא פחות פולשנית מאשר טכניקות דגימת תא / רקמה אחרות והוא קשור לסיכון מינימאלי של תופעות לוואי כגון זיהום 20-23. הוא מציע דרך מהירה ופשוטה לדגום שני ילדים בריאים וחולים ללא ארוכה, מיותר, ולעתים קרובות procedu ברונכוסקופיה הכואבמיל מחייבי הרגעה. מחקרים קודמים מצאו כי תת המחלה קשורה חומרת האסתמה ניתן להבחין הן רירית האף, כמו גם דגימות תאים הסימפונות שנלקחו ילדים אסתמטיים, ביטוי גנים בין שני סוגי רקמות היה דומה כ -90% מהגנים הלא בכל מקום 22 , 24. כמקור iPSCs, NECs להציע יתרונות על פני סוגי תאים אחרים מנוצל לעיתים קרובות. פיברובלסטים משמשים לעתים קרובות דור iPSC, אבל למרות תאים אלה יכולים להיות מתורבתים בקלות מתוך ביופסיה של עור, תהליך זה בדרך כלל דורש הרדמה מקומית, חתך, ותפרים, והיא קשורה עם סיכון מסוים של זיהום. לכן השיג הסכמה מדעת מחולים עבור סוג זה של ביופסיה יכולה להיות קשה 25. חלופה אחת כדי פיברובלסטים היא תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs). עם זאת, זה יכול להיות קשה להשיג דם מספק עבור דור iPSC מחול ילדים. בנוסף, קיימות מגבלות של ap במורד הזרםplications עבור פיברובלסטים iPSCs דם תא נגזר, במיוחד קיבולת הבידול שלהם סוגי תאים מסוימים 5,26. לכן, בהתחשב הנגישות היחסית ואת הסיכון הנמוך של תופעות לוואי בעקבות בגבייתם NECs מהווה מקור תא אידיאלי עבור דור iPSC מאוכלוסיות ילדים.

iPSCs קיבלו הרבה תשומת לב לאחרונה כפלטפורמה ללימוד ההתפתחות האנושית, יצירת מודלים המחלה רומן, כמקור פוטנציאלי של תאים עבור טיפולים אישית. לפני את מלוא הפוטנציאל של הטכנולוגיה הזו יכולה להתממש, את הבסיס המולקולרי של תהליך תכנות מחדש צריך להיות הובהר, אך לעת עתה פרוטוקול זה ואת הנהלים המפורטים בתוך יבהיר את המחקרים התמקדו חשיפות דרכי הנשימה, כמו גם לספק פלטפורמה לומד את ההשפעות של טיפול תרופתי אישי המעורב iPSCs.

העבודה השיתופית של מספר מעבדות הובילה generation של טכניקה מוצלחת לא רק דגימה של רירית האף, אבל גם culturing NECs, ו תכנות מחדש של תאים אלה iPSCs 23. מאמר זה מספק תיאור של פרוטוקול דגימה אופטימלית, culturing, ותנאי תכנות מחדש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא אחרי הקווים המנחים של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מוסדות.

1. דגימת האף הרירי

הערה: קבל דגימות נבדקים אשר הינם ללא סימני זיהום ויראלי בדרכי הנשימה.

  1. הכן טרי חרוטי 15 מ"ל לפני הביקור משתתף ולהוסיף 2 מ"ל BEGM (מדיום הגידול תא אפיתל הסימפונות) בתוספת 20 μl סטרילי פן / סטרפטוקוקוס / Fungizone (P / S / F) (0.01%).
  2. מברשת ציטולוגיה להרחיב רק לפני נטילת המדגם, ואל תשכחו לשמור מברשת סטרילית לא נוגע בו לכל משטחים מלבד משטחי האף.
  3. שאל משתתף לשבת בשקט להטות את הראש כלפי מעלה, אל התקרה. יש קטנים או ילדים חסרי מנוחה יותר לשבת על הידיים ו / או בשכיבה כדי למנוע לחבוט המברשת הצדה.
  4. כוון מברשת בחלק האחורי של האף שבו המעבר מצמצם (נראה כמו חור שחור קטן). חלק מברשת למטה ולסובב פרקים כמו המברשת תיוסר nostril.
  5. מניח מברשת חרוטים לצלול BEGM. חותכי מברשת עודפת ולהחליף כובע על צינור. לא מערבולת.
    הערה: אם המשתתף הוא מוכן, להשיג מברשת שנייה באותו אופן אבל בנחיר השני. קבלת רפרוף קל על שני הנחיריים תגרום סבירות גבוהה יותר כי הדגימה תהיה מוצלחת. דגימה באותו הנחיר עלולה לגרום לדימום לא ישפר את המדגם סביר.
  6. שמור דגימות קרובות ל -37 מעלות צלזיוס ככל האפשר במהלך הובלה באמצעות מבחנה עם מים חמים.

2. ספירת תאים ו Cytospin

  1. בעדינות להתסיס את המברשת BEGM ולקחת 10 μl של המדגם עבור ספירת תאים באמצעות hemacytometer. הוסף 10 μl של כתם חי / מת ולספור לחיות תאים רק תחת מיקרוסקופ.
  2. קח 50 μl של המדגם לדלל 200 μl עם 1x PBS. הוסף משפך cytospin המצורף שקופית זכוכית ספין ב 300 סל"ד במשך 2 דקות. בואו להחליק שקופית O / N ו- כתם יבש following להוראות היצרן. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך.
  3. שקופיות כתם עם המה 3 Stain
    1. העבר כל פתרון (מקבע המה, תכלת; המה 3 פתרון אני, ורוד; ו המיתי 3 פתרון שני, כחול עמוק) לתוך צלחת מכתים; שמור מכוסה כשאינו בשימוש. הכנס שקופיות לתוך סירה מכתימה שקופית
    2. טובלים שקופיות ברציפות מקבע במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות פתרון אני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות הפתרון השני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לנקז
    3. לשטוף עם מים ללא יונים עד המים זורמים ברורים. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך
  4. תראה שקף מתחת תאי מיקרוסקופ וספירה, לקבוע אחוז תאי אפיתל. צריך להיות 90% או יותר אם הדגימה היא טובה.

3. תאים מתזמנים

הערה: ביצוע כל הליכי תרבית תאים בתרבות רקמות נכונה מוסמכתמכסה המנוע באמצעות טכניקה סטרילית.

  1. מעיל צלחות עם שור Dermal קולגן (BDC), סוג 1. הוסף 0.5 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל ​​BDC מדולל 49.5 מ"ל 1x PBS. כן פחות אם רק כמה צלחות תשמשנה. מעיל בקבוקון T25 עם 2 מ"ל BDC דגירה O בשכונה סטרילי / N או ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, אם יהיה צורך בכך.
  2. לאחר דגירה, לשאוף כל נוזל נותר. לחשוף צלוחיות לאור UV למשך 30 דקות במנדף סטרילית. צלוחיות חנות עד חודש אחד בכל 4 ° C, אבל להביא אותם RT או 37 ° C לפני זריעת התאים.
  3. שמור מברשת ותאי BEGM על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן זרע. בעדינות מברשת סוויש בתוך חרוטים, אבל לא מערבולת.
    1. פלייט 7 x 10 5 תאים בבקבוק T25. אם יש פחות, להשתמש במיכל קטן, כגון אחד טוב של צלחת 6 באר. צלחת בגודל זה דורש כ 3 x 10 5 תאים.
      הערה: אם אין תאים רבים זה, זה לא מומלץ להמשיך.
  4. מתחת למכסה מנוע סטרילית, לקחת מברשת מתוך צינור gently לסובב מברשת על פני השטח של הבקבוק המצופה, נזהר שלא לשרוט את הציפוי. בטל המברשת במיכל Biohazard המתאים.
  5. לאט פיפטה את התאים הנותרים ב BEGM מתוך החרוטים לתוך בקבוק T25. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. מספר התאים הצפים יקוים וייתכנו כמה פסולת מהאף, אשר מקובל בשלב זה (איור 3 א).

4. תרבית תאים

  1. לאחר זריעת תאים, ולתת להם להתיישב במשך 48 שעות ללא הפרעה (איור 3). לאחר 48 שעות, לאט ובעדינות להוסיף 2 מ"ל חם BEGM ו -20 μl סטרילי פניצילין / סטרפטומיצין / Fungizone (P / S / F).
    הערה: אין לשאוב תקשורת 2 מיליליטר של המקורי.
  2. ביום 4 th לאחר הזריעה, לשאוב את כל הנוזל בזהירות, ולהחליף עם 4 מ"ל טריים, חימם BEGM בתוספת 1x פן / סטרפטוקוקוס (fungizone כבר לא נחוץ). שינוי בתקשורת כל יומיים ולהעריך תאים לצרףment, צמיחה מפגש. כאשר התאים מגיעים ~ 80% המפגש, בדרך כלל בתוך 2-3 שבועות, הם מוכנים להיות passaged.
  3. בקבוק T25 אחת (כ -2.5 x 10 6 תאים כאשר ומחוברות) ניתן passaged לשלוש צלוחיות T25 או בבקבוק T75 אחד. לאחר המעבר הראשון, תאים צריכים להיות חזקים ובריאים, להגיע למפגש על כל שלושה ימים.

5. תאים Passaging

  1. בעדינות לשאוב התקשורת מהצלחת. הוסף 1 מ"ל 0.05% פתרון טריפסין לכל בקבוק T25 לצלחת ומניחים בחממה במשך כ 4min, או עד תאים להתנתק הצלחת. בדוק את רמת הניתוק של תאים כל 2 דקות ואל תשאיר טריפסין על יותר מ 10 דקות.
  2. הוסף 5 מ"ל טריפסין נטרול פתרון (TNS), או מדיה המכילה סרום לנטרל את האנזים. הסר את כל הנוזל ותאי מהבקבוק ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב XG 200 (האצה 0 האטה 0) במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. לשאוב supernaתאי tant ו resuspend BEGM + P / S בהיקף הנדרש הצלוחיות החדשות (4 מיליליטר עבור בקבוק T25, 10 מיליליטר עבור בקבוק T75)
  4. בצעו ספירת תאים עם כתם חי / מת כפי שתואר לעיל (2.1). הוספת הכמות מתאימה של BEGM ותאי כדי הצלוחיות המצופות ולחזור אל האינקובטור. לשמור כמפורט לעיל או cryopreserve מקפיא בינוני (70% BEGM, 20% FBS ו 10% DMSO) בריכוז של 0.5-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.

6. תכנות מחדש כדי iPSCs

הערה: לפני יצירת iPSCs, לפקח על קיום כל התקנות המוסדיות המסדירות את הדור ושימוש iPSCs אדם. טכניקת סטרילית חשובה במיוחד עבור תרבויות iPSC, כמדיום תרבות אינו מכיל אנטיביוטיקה באופן שגרתי. זה קריטי, כי NECs נראה בריא והם שגשוג וחסון לתכנות מחדש מוצלח.

  1. פלייט 5 x 10 5 NECs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 6 היטב. לאחר 24 שעות, להוסיף polybreneכדי BEGM לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו transduce NECs ידי הוספת חלקיקים lentiviral להביע Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc לתקשורת. שואפים להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של ~ 5 27.
    1. כדי קביעת משרד הפנים, להכין דילולים סידוריים של המניות המרוכזות-lentiviral ו transduce HT1080 תאים עם דילולים אלה. לאחר זיהוי הראשון באופן חד משמע ביטוי dTomato בתאי HT1080, לחשב את המספר "יחידות transducing / מיליליטר" כשקלע את מספר תאי dTomato החיובי / גושים קטנים של תאים כל דילול.
      הערה: בדרך כלל, תהיה דילולים כי הן גבוהות מדי (הכל dTomato חיובי) ו נמוך מדי (ללא או רק כמה תאים חיוביים).
    2. בצע ניקוד הדילולים שבו נבדלו תאים חיוביים / גושים קטנים של תאים מזוהים. לקבוע את כייל על ידי תיקון מספר transducing מ"ל / יחידות עם גורם לדילול המתאים. משרד הפנים הוא אזי היחס בין מספרשל transduced תאים למספר חלקיקי הנגיף 27.
      הערה: כל תא dTomato החיובי / גוש קטן מניחה לנבוע חלקיק וירוס אחד.
  2. כ -3 שעות-שלאחר התמר, להסיר תקשורת ולהחליף עם BEGM הטרי. מחק תקשורת lentivirus המכיל באמצעות נהלים שאושרו מוסדי. חזור NECs transduced אל האינקובטור במשך 3 ימים.
  3. ביום 3, להחליף תקשורת עם BEGM הטרי, ולאחר מכן דגירה במשך 3 ימים נוספים. לשאוב בילה התקשורת, לשטוף תאים עם 1x PBS ולהוסיף 1 מ"ל 0.05% פתרון טריפסין אל הבאר. תאי מעבר עם טריפסין כפי שנכתב לעיל (סעיף 5). בזהירות לשאוב תאים supernatant ו resuspend ב 4 מ"ל BEGM + P / S. תאים יכולים להיות passaged כדי באר חדשה של צלחת 6 היטב מצופית BDC, או הוסיפו לתרבויות MEF, אם מוכן (ראו השלב הבא).
  4. כן צלחות מצופות MEF. ביום 4 להוסיף פתרון ג'לטין 0.1% (1 מ"ל / טוב) 2 הבארות של 6 היטב (כדי לבצע +/- Thiazovivin (SPT) ראה שלב 6.6). על הבאיום, להפשיר בקבוקון של MEFs מומת 28.
  5. מניחים MEFs לתוך 10 מ"ל של התקשורת MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). ספין על XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה. גלולה בתקשורת MEF. ג'לטין לשאוב מהצלחת 6 היטב ומוסיפים 1.87 x 10 5 MEFs לכל גם צלחת 6 היטב מצופה ג'לטין. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, או למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
  6. העברת 2 מ"ל של BEGM מכילים transduced תאים לכל גם לתוך 2 בארות צלחת 6 מצופה בעבר היטב דגירה O / N. ביום למחרת, להחליף BEGM עם 2.5 מ"ל לכל טוב של התקשורת תקן hESC המכיל 4 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ"ל. Feed תאים עם התקשורת hESC טרי +/- SPT יומי במשך 10 ימים
    הערה: אפשר להוסיף קוקטייל של מולקולות קטנות (SB431542, PD0325901, ו Thiazovivin (SPT) קוקטייל) כדי לשפר את היעילות ואת קינטיקה של תכנות מחדש עבור NECs 23.
  7. לאחר עשרה ימים, להמשיך להאכיל יומי באמצעות התקשורת hESC ללא SPT. Feed תרבויות יומיים עד מושבות hESC הדמוילהופיע (איור 5 א, המושבה P0). זיהוי מושבות מחסה iPSCs המשוערת על ידי הגרעין הגבוה שלהם: יחס cytoplasmic ו nucleoli הבולט.
  8. מושבות בלו והעברה ידניות עם מורפולוגיה hESC הדמוי להפריד בארות לתרבות והרחבה כקווים נפרדים במערכת מזין חינם. מושבות ניכרות צריכות להסתגל במהירות לתנאים אלה.
    1. לאחר מושבות ציפוי ניכר קווי iPSC המשוערים הדיסקרטיים אלה נחשבים כיום מעבר 1 (P1). תרבויות עדכונים יומיים עם mTeSR1. מעבר ולהרחיב קווי iPSC באמצעות נהלים סטנדרטיים. זה עלול לקחת מספר ימים עד שבוע עבור מושבות p1 להגיע לגודל שבו הם צריכים להיות passaged.

7. שימור iPSCs בתרבות

  1. Feed ולהעריך תרבויות יומיות. ידני באזורי בלו מפגינים בידול גלוי על ידי גירוד עם טפטף זכוכית סטרילית או קצה פיפטה מיקרו. שינוי תקשורת לאחר קטיף יומי.
  2. מעבר תאים לאחר approximately כל ארבעה ימים: בעדינות התקשורת לשאוב, להוסיף 1 מ"ל Dispase חם (1 מ"ג / מ"ל) לכל היטב צלחת 6-היטב (חצי נפח האכלה), ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ -4 דקות. הקצוות של המושבות יתחילו להרים, אשר נראה כמו מתווה לבן ברחבי המושבה. בעדינות לשאוב Dispase ולשטוף 3x עם חימם DMEM / F12.
  3. הוסף 2 מ"ל mTeSR1 ולהשתמש מרים תא להרים את מושבות מהצלחת. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגית או micropipette P1000 כדי triturate התאים בעדינות עד מושבות מחולקות לאשכולות קטנים.
    1. הימנע לייצר אשכולות קטנים מאוד או תאים בודדים, כמו התפשטות הישרדות עוקבת תהיה תת-אופטימלית. כאשר מחדש ציפוי מושבות, 1: 4 ל -1: 6 פיצול ישמור צפיפות מושבה אופטימלית. הוצא בעדינות מושבות תקשורת מהצלחת ולהוסיף חדשות, בארות מצופות matrigel.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החלק הראשוני של האף, שנקרא פרוזדור האף, הוא האזור המוקף סחוס 29. המברשת צריכה ללכת בצורה חלקה בעבר באזור זה של האף, מעבר שסתום האף (ostium internum, או "חור השחור" לראות בחלק האחורי של Nare), ואת המדגם המתקבל חלזוני הנח (איור 1). Turbinates האף הם מבנים גרמיים להגדיל את שטח הפנים של האף 29, מה שהופך אותם במיקום אידיאלי עבור דגימה. האזור הוא מצופה גם על ידי רקמה רירית vascularized, דומות מאוד רפידות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאי אפיתל האף (NECs) מהווים פלטפורמה נגישה ללימוד מחלות דרכי הנשימה, ו- NEC-iPSCs להציע דרך מרגשת לחקור את התפתחות המחלה, טיפול ותרפיה 1,31,32. NECs ניתן להשיג בקלות ללא 6,23 נהלים מלחיצים או מזיקים. מניסיוננו, הדגימה של רירית האף כמתואר בפרוטוקול זה נראה פחות מלחיץ נתפס טוב יותר מאשר איסוף דם לילדים. לכן, שיטה זו עשויה להיות שימושית במיוחד באוכלוסיות מטופלים ילדים ורלוונטי לומד מחלות דרכי הנשימה. היתרון השני של NECs הוא שברגע שהם בתרבות, תאי אפיתל נבחרים עם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות במתקן לתאי גזע פלוריפוטנטיים ואת Core הדמיה Confocal בבית החולים סינסינטי ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ו 2U19AI70235 (GKKH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-49Dחרוטי שלב 1.1.
BEGMLonzaCC-3170שלב 1.1.
Penn/Strep/FungicideLife Technologies15240-062פרוטוקול שלב 1.1.
פרוטוקול Penn/StrepLife Technologies15140-122שלב 4.א.
מברשת ציטולוגיה ציטוסופטפישר סיינטיפיק22-263-357פרוטוקול שלב 1.2.
טריפן כחולפישר מדעיMT-25-900-CIפרוטוקול שלב 2.1.
המציטומטרפישר סיינטיפיק02-671-54פרוטוקול שלב 2.1.
פרוטוקול PBSFisher ScientificBP2438-4שלב 2.2.
קליפס משפך ציטולוגיהפישר סיינטיפיק10-357שלב 2.2.
משפך ציטוספיןפישר סיינטיפיק23-640-320פרוטוקול שלב 2.2.
ציטוספין 4פישר A78300003 מדעישלב 2.2.
שקופית ריקהפרוטוקול פישר סיינטיפיקS95933שלב 2.2.
ערכת כתמים hema 3פישר סיינטיפיק22-122-911פרוטוקול שלב 2.2.
קולגן עורי בקר, סוג 1Life TechnologiesA1064401פרוטוקול שלב 3.2.
בקבוק T25פישר סיינטיפיק08-772-45פרוטוקול שלב 3.3.
טריפסיןלונזהCC-5012שלב 5.2.
תמיסת נטרול טריפסיןפרוטוקול לונזהCC-5002שלב 5.2.
סרום בקר עוברי (FBS), מעוקר בחום ב-65 מעלות; C למשך 30 דקותSigma-AldrichF2442שלב 5.5.
דימתיל סולפוקסיד Hybri-Max™, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים להיברידומה, ≥ 99.7%פרוטוקול Sigma-AldrichD2650שלב 5.5.
וירוס פוליציסטוני*למשל פרוטוקול MilliporeSCR511שלב 6.4. 
מופיע מקור מסחרי של וקטור תכנות מחדש. אנו משתמשים באופן שגרתי בפלסמיד 4 ב-1 שדווח על ידי Voelkel et al (PMID: 20385817) כדי ליצור VSV-G-פסאודוטיפ תכנות מחדש של וירוס לנטי בתוך הבית. ניתן להשיג פלסמיד זה על ידי יצירת קשר 
פוליברן,סנטה קרוז ביוטכנולוגיה,SC-134220פרוטוקול שלב 6.4.
CF1 MEFs מוקרןGlobalStem GSC-6301Gשלב 6.4.
מדיית hESCראה מתכון הכלול בפרוטוקולשלב 6.11.
SB431542Stemgent04-0010שלב 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006שלב 6.11.
תיאזובין פרוטוקול Stemgent04-0017שלב 6.11.
BD Biosciences354277מוסמך hESCשלב 6.13.
צלחת קורנינג, 6 בארותפישר סיינטיפיק08-772-1Bפרוטוקול שלב 6.13.
פרוטוקול mTeSR1StemCell5850שלב 6.13.
בקבוק פילטר חד פעמי 250 מ"ל (0.22 ומיקרו; m)פישרSCGP-U02-RE 
פרוטוקולStemCell7923שלב 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033פרוטוקול שלב 7.3.
מרים תאיםפישר סיינטיפיק08-100-240פרוטוקול שלב 7.4.
hESC Media**פרוטוקול שלב 6.11.
יש לערבב רכיבים ולאחר מכן לעקר את המסנן. ניתן לשמור את המדיה בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד שבועיים. בעת חימום מדיה, אל תשאיר ב-37 מעלות; C ארוך מ-15 דקות
DMEM-F12 50/50 מדיהInvitrogen  11330-032ריכוז סופי
סרום חלופי KO (KO-SR)Invitrogen10828-0280.2
200 מ"מ L-גלוטמיןInvitrogen25030-0811 מ"מ
55 מ"מ ß-מרקפטואתנולInvitrogen21985-0230.1 מ"מ
100x חומצות אמינו לא חיוניותInvitrogen11140-0501x
2 µ גר'/מ"ל גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ננוגרם/מ"ל
פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול , פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול פרוטוקול Matrigel

מקורות

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

hESCMEF
טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.