מאמר שיטה

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 במרץ 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטוסטימולציה היא דרך לא פולשנית לשלוט באירועים ביולוגיים ברזולוציה מרחבית וזמנית מצוינת. רצויות שיטות חדשות לוויסות פוטו של חלבונים אנדוגניים המתבטאים בסביבתם הטבעית. כאן, אנו מציגים גישה לשליטה אופטית בתפקוד של חלבון עצבי ישירות בתאי עצב באמצעות חומצת אמינו לא טבעית מקודדת גנטית (Uaa). על ידי שימוש בזוג tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase אורתוגונלי כדי לדכא את קודון הענבר, Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) תגובתי לאור משולב באופן ספציפי בנקבוביות של חלבון עצבי Kir2.1, תעלת אשלגן מתקנת פנימה. ה-Cmn המגושם חוסם פיזית את נקבוביות הערוץ, מה שהופך את Kir2.1 ללא מוליך. תאורת אור ממירה באופן מיידי את Cmn לחומצת אמינו טבעית קטנה יותר Cys, ומפעילה את פונקציית ערוץ Kir2.1. אנו מבטאים את תעלותהאשלגן (PIRK) הניתנות להשראת תעלות אשלגן (PIRK) בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות, ומדגימים כי הפעלת האור של PIRK מפסיקה את הירי העצבי עקב זרימת זרם K+ דרך ערוצי Kir2.1 המופעלים. באמצעות אלקטרופורציה ברחם, אנו מבטאים PIRK גם בניאו-קורטקס העכבר העוברי in vivo, ומראים את הפעלת האור של PIRK בנוירונים ניאו-קורטיקליים. קידוד גנטי של Uaa אינו מטיל מגבלות על סוג חלבון המטרה או המיקום התאי, ומשפחה של Uaas פוטו-ריאקטיביים זמינה לווסת שאריות חומצות אמינו טבעיות שונות. לפיכך, לטכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן כללי על חלבונים עצביים רבים כדי להשיג ויסות אופטי של תהליכים שונים במוח. הפרוטוקול הנוכחי מציג הליך נגיש לשילוב UAA מורכב בתאי עצב במבחנה וב-vivo כדי להשיג בקרת פוטו של פעילות החלבון העצבי ברמה המולקולרית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעומת גירוי חשמלי קונבנציונלי, photostimulation מציעה רזולוציה של זמן ומרחב גדול עם הפרעה מינימאלית למערכת הפיזיולוגית של דגימות. מאז ההפגנה של שימוש בלייזר כדי לעורר נוירונים ב -1971 1, בדרכים יצירתיות רבות הומצאו אקסוגני לשלוט הפעילות העצבית עם אור. שחרור אופטי של אגוניסטים photocaged כבר זמן רב בשימוש ללמוד תגובה פיזיולוגית של הרשת העצבית הליגנדים 2,3,4. טכניקה זו הגבילה סגולית עקב דיפוזיה של אגוניסטים בכלוב. סגולי גנטי מושגת ectopically ידי ערוצי opsin רגיש לאור בעת ומשאבות 5,6,7, וזה יושם בהצלחה לווסת רשתות נוירונים שנבחרו אורגניזמים מודל מגוונים. עם זאת, זה יהיה קשה ליישם את השיטה לשלוט אופטי שונים חלבונים עצביים אחרים, מאז השתלת photoresponsiveness מן החלבונים opsin לחלבונים אחרים would דורש הנדסה אינטנסיבית שעשויות לשנות את התכונות הטבעיות של החלבון נחקר. מבחינת כימית קשירה ליגנד רגיש אקסוגניים לחלבון הוכיח דרך נוספת לשלוט על הפונקציונליות של חלבוני ערוץ 8,9,10. ליגנד מוצג או ממדפי אתר הקישור של החלבון דרך photoisomerization של מחצית azobenzene. כימית קשירה מגבילה את היישום בעיקר לצד תאיים של חלבונים בממברנה, למעט הצד התאי וחלבונים תאיים.

Photoresponsive Uaas, לאחר שולבו חלבונים, לספק אסטרטגיה כללית לתמרן חלבונים עם אור. ב המאמצים המוקדמים, tRNAs acylated כימית עם Uaas photocaged היו microinjected לתוך ביציות Xenopus לשלב את Uaas לתוך קולטנים הממברנה תעלות יונים 11, אשר קידמו את ההבנה של יחסי מבנה-תפקידם 12,13,14.גישת microinjection זה מתמצה בעיקר ביציות גדולות. התאגדות גנטית של UAA עוקפת את acylation ו microinjection מאתגר מבחינה הטכנית tRNA באמצעות זוג מאונך tRNA / synthetase, אשר משלב את UAA באמצעות תרגום חלבון אנדוגני בתאי חי 15,16,17,18. UAA התאגדות לחלבונים עצביים הודגמה הנוירונים עיקריים ותאי גזע עצביים 19,20. לאחרונה, photoresponsive UAA כבר שולב גנטי לתוך חלבון עצבי במוח יונקי in vivo בפעם הראשונה 21. התקדמות אלה מאפשרים ללמוד חלבונים עצביים עם Uaas בסביבת הסלולר מולדתם.

כלפי פנים Kir2.1 ערוץ אשלגן לתיקון הוא מיישר חזק שעובר K + זרמים יותר בקלות לתוך מאשר מחוץ לתא, והוא חיוני בוויסות תהליכים פיזיולוגיים כולל רגישות התא, הטון של כלי הדם, קצב הלב, מחדשזרימת מלח סופית ואינסולין לשחרר 22. התבטאות יתר של Kir2.1 hyperpolarizes פוטנציאל הממברנה של הנוירון היעד, אשר הופך להיות פחות 23,24 להתרגש. כדי לשלוט Kir2.1 אופטית בתאים המקוריים שלו, קאנג et al. מאוגד גנטי תמונת מגיבי UAA לתוך Kir2.1 לידי הביטוי בתאי יונקים, נוירונים מוח עכבר עוברי 21. דופק קצר של אור הצליח להמיר את UAA לתוך חומצה אמינית טבעית Cys, ובכך הפעלת חלבון Kir2.1 היעד. כאשר אשלגן צילום מושרה זה לתיקון כלפי פנים (PIRK) חלבון ערוץ התבטא הנוירונים עיקריים בהיפוקמפוס עכברוש, הוא הדחיק ירי עצבי בתגובת הפעלת אור. בנוסף, ערוץ PIRK התבטא הניאוקורטקס העכבר העוברי, וזרם האור מופעל PIRK ב נוירונים בקליפת המוח נמדד. היישום המוצלח של טכנולוגית UAA in vivo במוח היונקים פותח את הדלת כדי לשלוט אופטי חלבונים עצבייםבסביבה האם שלהם, אשר תאפשר לנתיחה אופטית של תהליכים ומנגנונים עצביים ברמה המולקולרית.

בפרוטוקול זה אנו מתארים הליכי התאגדות גנטית של Uaas לתוך הנוירונים עיקריים בתרבות במוח העכבר העוברי in vivo. Photoresponsive UAA CMN ו Kir2.1 משמש כדי להמחיש את התהליך. שיטות להעריך התאגדות UAA מוצלחת שליטה אופטית של פעילות חלבון עצבית מסופקות. פרוטוקול זה מספק מדריך ברור גנטי קידוד Uaas בנוירונים ובחי, וכדי אופטי ויסות תפקוד חלבון עצבי באמצעות UAA photoresponsive. אנו מצפים פרוטוקול זה כדי להקל על אימוץ הטכנולוגיה in vivo UAA עבור הנוירולוגיה מחקרים ביולוגיים optogenetic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים במחקר הנוכחי בוצעו באמצעות טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) אישרה פרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים בבית סאלק המכון למחקרים ביולוגיים, La Jolla, CA.

1. התאגדות UAA ב Kir2.1 וביטוי של PIRK הנובע מהן בתרבות העצבית העיקרית

  1. בניית DNA
    1. בחר אתר היעד של Kir2.1 עבור התאגדות UAA. לנצל ידע מוקדם ומידע על מבנה ותפקוד של Kir2.1, כך שהאתר נבחר עם UAA Incorporated photoresponsive מאפשר אפנון אופטי של פונקצית Kir2.1 21.
    2. לבנות גן Kir2.1 קידוד DNA רקומביננטי עם האתר הנבחר מוטציה אל קודון עצירה ענבר TAG. השתמש בטכניקות שיבוט תקן 25 לשבט ה- DNA Kir2.1-TAG לתוך פלסמיד ביטוי יונק.
    3. Clone tRNA / synthetase גנים ספציפיים עבור UAA ולשלב את UAA בתגובהקודון TAG להפסיק לתוך ביטוי יונקים אחר פלסמיד 21.
      הערה: התאגדות UAA אופטימלית, יזמים ושילובים שונים של קלטות גנים (עבור tRNA, synthetase, ו Kir2.1) יכולים להיבדק אצל פלסמידים שונים.
    4. השג DNAs פלסמיד באיכות גבוהה באמצעות miniprep או maxiprep ערכות מסחריות על פי פרוטוקול של היצרן. בסביבות 1.9 היחס 260/280 הוא אופטימלי עבור ה- DNA המטוהר. בעת הצורך, לבצע ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק טוהר של ה- DNA הכינו 25. DNAs פלסמיד supercoiled עם טוהר גבוה ביותר עבור transfection העצבית.
  2. הנוירונים העיקריים תרבות עכברוש בהיפוקמפוס
    1. זכוכית מקום coverslips (עיגולים, 12 מ"מ קוטר) ב 24 גם צלחות, coverslip אחד בכל טוב, ומעיל כל טוב עם 250 μl של 0.5 מ"ג / פולי-D- ליזין מ"ל (100 מ"מ חיץ borate: 1.24 גר 'בור חומצה tetraborate נתרן 1.90 גרם 400 מ"ל של deionized מזוקקים H 2 O או DDH 2 O ב- pH 8.5) במשך 10 שעות בטמפרטורת החדר, אטום. הכן סביב 10-12 מצופה coverslips לכל גור.
    2. ביום לנתיחה, לאסוף מוחות בילוד מ גורי חולדה לאחר הלידה (1-4 ביום הלידה) לאחר הרדמה אותם עם isoflurane, ואת עריפת. להרדים את הגורים בתא הרדמה המכיל isoflurane (2-4%). חכה עד שהם מאבדים את ההכרה אינם מגיבים לגירויים משושי כדי צובט של הכפות.
    3. באמצעות טכניקה סטנדרטית 26, לנתח hippocampi מהמוח חם (~ 37 ° C) מלוחים (10 HEPES מ"מ ו -20 מ"מ D- גלוקוז הוסיף תמיסת מלח מאוזן של האנק), ולאסוף hippocampi צינור חרוטי עם 4.5 מ"ל תמיסת מלח חמים .
    4. הוסף 500 μl של טריפסין 2.5% ל hippocampi (ריכוז טריפסין הסופי 0.25%), דגירה במשך 10 דקות באמבט מים ב 37 ° C.
    5. לשטוף ביסודיות את הרקמה עם מי מלח (3 x 10 מ"ל) ו triturate.
    6. לשחזר את הנוירונים ניתק 1 מ"ל wתקשורת צמיחת זרוע המכילה מינימום Essential הבינוני (MEM) בתוספת 5% עובריים שור סרום (FBS), 21.2 המ"מ D- גלוקוז, 2 מ"מ גלוטמין L, 2% B-27, ו מאריך סרום 0.1%.
      הערה: הוסף L- גלוטמין ו- B-27 ביום לנתיחה כדי להכין תקשורת צמיחה טריה.
    7. לספור את הנוירונים עם hemocytometer, צלחת אותם על coverslips ב 24 גם צלחות ב 1.0-1.5 x 10 5 תאים / גם צפיפות עם תקשורת צמיחת 500 μl מסוננת אחרי דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר.
    8. דגירת התרבות העצבית ב 35 מעלות צלזיוס 5% CO 2: חממת humidified אוויר 95% במשך 2-3 שבועות. לקבלת התוצאה הטובה ביותר, להימנע משיבוש התרבות ככל האפשר במהלך הדגירה.
  3. פוספט סידן (Ca-P) Transfection תרבות העצבית העיקרית
    1. הפוך פתרונות המניות ולאחסן ב 4 ° C: 0.5 M BES (N, N -bis [2 הידרוקסי אתיל] -2-aminoethanesulfonic חומצה) חיץ (10x); 150 מ"מ Na 2 4 HPO (100x); 2.8 M NaCl (10x); סטרילי DDH 2 O; 1 N NaOH סטרילי.
    2. ביום transfection, להפוך 2.5 פתרון M CaCl 2 טרי DDH 2 O ולסנן סטרילי עם 0.22 מיקרומטר הסינון. הפוך 2x טריים BES-בופר (BBS) מאגר המכיל 50 BES מ"מ, 1.5 מ"מ Na 2 4 HPO, ו -280 מ"מ NaCl ב- pH 7.00 (להתאים את ה- pH עם NaOH) ולסנן סטרילית עם 0.22 מיקרומטר הסינון.
      הערה: לחשב את כמות פתרון CaCl 2 חיץ BBS תלוי במספר coverslips להיות transfected. גם להסתכל על 1.3.4.
    3. החלף את המדיה צמיחת התרבות עם 500 תקשורת צמיחת transfection הטריה μl מחומם מראש. (מדיה Transfection יכול להתבצע עם MEM בתוספת 21.2 מ"מ D- גלוקוז).
      הערה: אל תמחק את המדיה הישנה.
    4. לחשב את הסכום של DDH 2 O ולהכין להוסיף כדי להפוך את הפתרון transfection (33 μl לכל coverslip) המכיל 1.65 μl CaCl 2, 0.7 מיקרוגרם DNA, ו -16.5 &# 181; l 2x BBS.
    5. הכן את הפתרון transfection מיד לפני הוספתו התרבות. כדי להכין, הראשון לשלב CaCl 2 ו DDH 2 O תוך להסעיר את הצינור לאט. המשך התססה ולאט לאט להוסיף DNA לתוך התמיסה. לבסוף, להוסיף טיפה חכמה חיץ 2x BBS בעוד התססה.
    6. מיד להוסיף 30 μl של הפתרון transfection לכל coverslip של תרבות העצבית.
    7. רוק מנת התרבות כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון ואת לדגור על 35 מעלות צלזיוס CO 5% 2: 95% חממת humidified אוויר במשך 45 דקות -1 שעה. לאחר נוירונים מודגרת עם הפתרון transfection, יפה מאוד משקעים Ca-P היה ליצור שכבת כיסוי נוירונים.
    8. החלף את המדיה transfection עם 500 μl חיץ כביסה מחומם מראש (135 mM NaCl, 20 HEPES מ"מ, 4 KCl מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 1 mM Na 2 4 HPO, 10 גלוקוז מ"מ ב- pH 7.3, סטרילי מסונן עם 0.22 מיקרומטר מסנן) ו לדגור על 356; C ב 5% CO 2: 95% החממה humidified אוויר במשך 15-20 דקות. משקעי Ca-P ייעלמו לאחר השלב לשטוף.
    9. חלף למאגר הכביסה עם 500 μl תקשורת צמיחה טריה. שוב, להחליף את תקשורת הצמיחה עם המדיה המקורית נשמרה.
    10. מוסיף את UAA CMN (טרום המעורב 50 μl תקשורת צמיחה חמה) לתרבות להגיע 1 מ"מ ריכוז סופי.
    11. דגירת תרבות transfected ב 35 מעלות צלזיוס 5% CO 2: חממת humidified אוויר 95% עבור 12-48 שעות לפני מבחנים.
  4. הקלטת תא כולו עם הפעלת אור
    1. הכינו פתרונות נוספים / תאיים. הפתרון תאיים מכיל 135 גלוקונאט אשלגן מ"מ, 10 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ EGTA, 2.56 ATP מ"מ K 2, ו -0.3 מ"מ Li 2 GTP ב- pH 7.4. פתרון הקלטה תאיים מכיל 150 מ"מ NaCl, 3 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 0.5 מ"מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ"מ, 10 מ"מ HEPES ב- pH 7.4.
    2. הגדרת אסדת אלקטרופיזיולוגיה עבור ההידוק תיקון כל תא: מיקרוסקופ מצויד 4X ו 20X מטרות, התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), ולסנן mCitrine (עירור: 495/10 ננומטר, פליטת: 525/25 ננומטר); מניפולטור; מגבר תיקון- clamp; digitizer; רכישת נתונים ותוכנת ניתוח.
      1. התקן אור דיודה (LED) עם פליטה של ​​385 ננומטר על ידי מיקרוסקופ על האסדה כדי להעביר את אור המוקד מ 1 סנטימטר במרחק בזווית של 45 מעלות. בדוק את הכוח של ה- LED עם מד כוח האור.
    3. משוך טפטפות תיקון מ אלקטרודות זכוכית באמצעות חולץ micropipette מסחרי יש 3-6 התנגדות פיפטה MΩ. בצע הוראה של היצרן כדי להגדיר את חולץ micropipette.
      1. כדי לבדוק התנגדות פיפטה, ראשון למלא את פיפטה עם הפתרון התאי ולמקם אותו על בעל אלקטרודה. טובל את פיפטה בצלחת 35 מ"מ תרבות מלאה הפתרון התאי, הניחה על המיקרוסקופ platform. לטבול אלקטרודה קרקע לתוך הצלחת להשלים מעגל.
      2. הפעל את המגבר / digitizer ולהתחיל תוכנת רכישת נתונים. צג התנגדות פיפטה עם פרוטוקול בדיקה הממברנה.
    4. להוציא coverslip של תרבות נוירון מן החממה ולשטוף פעם בפתרון התאי. באמצעות ואקום גריז, החזק את coverslip באמצע צלחת תרבות 35 מ"מ מלא הפתרון התאי הטרי.
    5. מניחים את coverslip / צלחת על פלטפורמת מיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה.
    6. תוך שימוש בטכניקות הידוק תיקון הסטנדרטיות, תיקון נוירון עם mCitrine קרינה 27. פעילות עצבית שיא באמצעות מהדק נוכחי שיטה (אני מהדק). ראשית, להתאים את מתח המנוחה סביב -72 mV ידי הזרקת זרם קטן. לאחר מכן, להזריק נוכחי צעד (10-200 PA) כדי לגרום ירי מתמשך (5-15 הרץ) של פוטנציאל פעולה.
    7. באופן ידני, או באמצעות תוכנת רכישת נתונים, פלאש דופק (חטאדופק GLE של 100 msec -1 משך שניות) של אור LED אל נוירון בעת ההקלטה, ולראות אם פוטנציאל פעולה מושפע.
    8. הוסף 0.5 מ"מ BaCl 2 לאמבטיה ולאמת אם פוטנציאל פעולה הם התאוששו.

2. התאגדות UAA ב Kir2.1 והביטוי של PIRK הנובע ממנו המוח העוברי עכבר in vivo

  1. בניית DNA
    1. לעצב את פלסמיד דנ"א דומה כמו בשלב 1.1. עבור ביטוי in vivo, להשתמש אמרגן חזק כגון CAG (אמרגן ביתא יקטין עוף עם משפר CMV).
    2. לטהר DNA עם ערכה מסחרית רעלן פנימי ללא maxiprep פי הפרוטוקול של היצרן. בצע מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו אתנול המשקעים 25 לרכישת DNA באיכות גבוהה מאוד (משומר 2-5 מיקרוגרם / μl).
  2. ברחם Electroporation אל העכבר העוברי הניאוקורטקס
    הערה: techni הבסיסיque עבור ברחם electroporation תואר בעבר 28.
    1. להרדים עכבר בהריון בעיתוי גרוע היום 14.5 עובריים (E14.5) עם pentobarbital נתרן (זריקה intraperitoneal, 50 מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף) או isoflurane (שאיפה, 2-4%). צג עומק ההרדמה על ידי בדיקת איבוד הכרה ולא תגובה לגירויים משושי כדי צובט של הכפות.
    2. לעשות חתך קטן על קו אמצע הבטן. בעדינות לחשוף את קרני הרחם עם מלקחיים וקצות האצבעות.
    3. להזריק כ 1 פתרון ה- DNA μl (2-5 מיקרוגרם / μl של כל פלסמיד, תלוי מבנה) לתוך החדר לרוחב של כל להמלטה עם טפטפת זכוכית מוחדרת דרך דופן הרחם. ברוב המקרים, על 60-80% של עוברים הכולל מוזרקים.
    4. Electroporate את העוברים עם electroporator (33-35 V, 50 משך msec, 950 מרווח msec, 4-8 פולסים).
    5. מחזירים את קרני הרחם אל חלל הבטן בעדינות עם עבורפטריות לבנות וקצות האצבעות. לתפור את קיר השרירים ולאחר מכן את העור עם תפר כירורגי כדי לאפשר את העוברים להמשך הפיתוח.
  3. UAA Microinjection
    1. לעשות חתך קטן על קו אמצע הבטן שוב E16.5, ובעדינות לחשוף את קרן הרחם עם מלקחיים וקצות אצבעות.
    2. להזריק כ 2-5 CMN-עלא μl (500 מ"מ) לצד electroporated או בשני צידי החדר לרוחב עם טפטפת זכוכית מוחדרת דרך דופן הרחם. כדי להגדיל את הזמינות הביולוגית CMN, השתמש dipeptide CMN-עלא (CMN-אלאנין) כדי לספק CMN in vivo 21.
    3. שוב, להחזיר את קרני הרחם אל חלל הבטן בעדינות עם מלקחיים וקצות האצבעות. לתפור את קיר השרירים ולאחר מכן את העור עם תפר כירורגי כדי לאפשר את העוברים להמשך הפיתוח.
  4. השג חריפת מוח פרוס
    1. הפוך 1 מלאכותי הנוזל השדרתי L (ACSF) המכיל 119 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 1.3 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ CaCl , 1 מ"מ לאא 2 4 PO, 26.2 מ"מ NaHCO 3, ו -11 מ"מ גלוקוז ב- pH 7.3.
    2. קח 200 ACSF מ"ל ו-הקפאה מהירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות. הבועה שאר ACSF עם 5% CO 2: 95% O 2 גז בטמפרטורת החדר.
    3. הכן לעקר מכשור לכירורגיה למסוק מוחות מן העוברים. כמו כן להכין דלי קרח.
    4. הפוך ~ 100 מ"ל 4% פתרון agarose נמוך נקודת התכה בבקבוק על ידי חימום במיקרוגל. להתקרר פתרון במשך כ 5 דקות לפני שהוא מתחיל לגבש.
    5. להרדים את hr עכבר 12-24 לאחר הזרקת CMN-עלא על ידי יתר 2 CO. ודא חתכים גדולים באזור הבטן, לנתח את העוברים Electroporated / microinjected מן הרחם עם מספריים מלקחיים בסדר.
    6. המוח קציר מן העוברים עם מספריים מלקחיים בסדר.
    7. מניחים כל המוח על צלחת תרבות 10 ס"מ דגש על דלי קרח. מחלקים לשתי המיספרות באמצעות סכין חד, ומקום כלבחצי כדור על הצלחת עם מטוס midsagittal נוגע בתחתית של המנה. במהירות ויוצקים מעל הפתרון agarose על המוח (סביב 500 μl לכל מוחי).
    8. באמצעות סכין חד, כיכר לחתוך את agarose סביב מוח לבצע לחסום agarose מוטבע במוח.
    9. באמצעות דבק רקמות, דבק לאורך משטח המטוס midsagittal של לחסום agarose על הר עבור vibratome. ממלאים את החדר vibratome עם ACSF מראש צונן וחותכים 200 מיקרומטר פרוסות המוח sagittal.
    10. דגירה פרוסות חריפה ב ACSF בתוספת -inositol מיו 3 מ"מ, חומצה אסקורבית 0.4 מ"מ, ו פירובט נתרן 2 מ"מ ב 33 מעלות צלזיוס במשך 42 דקות תוך מבעבע עם 5% CO 2: גז O 2 95%.
    11. אחרי 42 דקות, לכבות את החימום ולהמשיך דגירה הפרוסה בטמפ 'החדר עם מבעבעים. התחל הקלטת תיקון כל תא לפחות 15 דקות לאחר כיבוי התנור.
  5. הקלטת תא כולו עם הפעלת אור
    1. הכן את intracפתרון ellular המכיל גלוקונאט אשלגן 130 מ"מ, 4 מ"מ MgCl 2, 5 HEPES מ"מ, 1.1 מ"מ EGTA, 3.4 מ"מ Na 2 ATP, קריאטין פוספט נתרן 10 מ"מ, 0.1 מ"מ Na 3 GTP ב- pH 7.3 מותאם עם KOH.
    2. משוך טפטפות תיקון מ אלקטרודות זכוכית באמצעות חולץ micropipette מסחרי יש 3-6 התנגדות פיפטה MΩ.
    3. הגדרת אסדת אלקטרופיזיולוגיה הפרוסה עבור הידוק תיקון כל תא ו Superfuse לתא ההקלטה עם ACSF ב 2 מיליליטר / שיעור דקות עם משאבת זלוף. כוונו את הטמפרטורה בתא עד סביב 33 מעלות צלזיוס.
      הערה: אסדת אלקטרופיזיולוגיה הפרוסה מצויד בתא זלוף, טבילה אובייקטיבית מי בקר טמפרטורה. כמו כן, מסנן GFP (עירור: 480/30 ננומטר, פליטת: 535/40 ננומטר) ו mCherry מסנן (עירור: 580/20 ננומטר פליטה: 675/130 ננומטר) נדרשים.
      1. להתקין LED עם פליטת 385 ננומטר על ידי מיקרוסקופ על האסדה כדי להעביר את אור המוקד מ 1 סנטימטר מהמקום בו 45 °זָוִית. בדוק את הכוח של ה- LED עם מד כוח האור.
    4. בזהירות להרים פרוסה המוח עם טפטפת זכוכית מקום בתא זלוף. החזק את הפרוסה עם נבל.
    5. תיקון נוירון עם הקרינה mCherry / GFP מאזור neocortical 27. שיא הפעילות PIRK באמצעות מהדק מתח (V-מהדק) שיטה. ראשית, להחזיק את פוטנציאל הממברנה ב -60 mV. לאחר מכן, זרמי שיא פוטנציאלים הממברנה שליליים קבועים (-100 mV) או רמפות מתח (-100 mV ל 40 mV). באופן ספציפי, לפקח זרמים פנימה ספציפיים Kir2.1 ב -100 mV.
    6. באופן ידני, או באמצעות תוכנת רכישת נתונים, פלאש דופק (דופק יחיד של משך שניות 100 msec -1) של הנורית אל נוירון בעת ההקלטה, ולראות אם חלבוני PIRK מופעלים. לאחר PIRK מופעלת, זרמים פנימה ב -100 mV יגדילו באופן משמעותי.
    7. הוסף 0.5 מ"מ BaCl 2 לאמבטיה ולאמת אם PIRK הוא מומת שוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי גנטי לשלב UAA לתוך חלבון בנוירונים, הצעד החשוב הראשון הוא לעצב גן מתאים בונה למסור ולהביע גנים ביעילות בנוירונים. ישנם שלושה מרכיבים גנטיים עבור התאגדות UAA: (1) גן המטרה עם קודון עצירה ענבר TAG הציג באתר הנבחר עבור התאגדות UAA (2) tRNA מאונך להכיר קודון עצירה TAG מוטציה, ו (3) aminoacyl מאונך -tRNA synthetase לחייב את UAA על tRNA המאונך. כל רכיב צריך להיות מונע על ידי האמרגן המתאים. קלטות גנים שלוש אלה יכולים להיכלל פלסמיד אחד או מופרדות בכמה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג צילום אפנון יעיל, השלב הראשוני החשוב הוא להחליט היכן לשלב את UAA photoresponsive ב חלבון המטרה. מידע מבני ותפקודי של חלבון המטרה מאוד עוזר להנחות את הבחירה של אתרי מועמדים. במקביל, לעניין תקנת אור היה לקבוע איזה אתר הוא מתאים ביותר. לאחר בחירת אתרי מועמדים, אנו ממליצים לבדוק באתרים בשורות תא יונקים כגון הכליה העוברית האנושי (HEK) תאים לתרבות ומניפולציה קלות, לפני שתמשיך הנוירונים עיקריים in vivo. כדי לזהות אתר עבור photoactivation Kir2.1 מספר אתרים לאורך הנקבובי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר S. Szobota על הדיון המועיל על תרביית תאי עצב וטרנספקציה של Ca-P. L.W. מודה על תמיכתם של מענק החדשנות של סאלק, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (RN1-00577-1) והמכונים הלאומיים לבריאות (1DP2OD004744).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משקפי כיסוי, עיגולים, 12 מ"מ, עובי 0.13-0.17 מ"מCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D-(+)-תמיסת גלוקוזSigma-AldrichG8769
כלי מדע עדין מעוקל של מרית איריס10092-12
סכין חיתוך - קצהזוויתי עדיןFine Science Tool10056-12
GlutaMAX-I תוסףתזונה Life Technologies35050-061
MITO+ Serum ExtenderBD Biosciences355006
Falcon 40 ומיקרו; m מסננת תאיםקורנינג מדעי החיים352340
BES (N,N-Bis (2-הידרוקסיאתיל)-2-חומצה אמינואתנסולפונית, N, N-ביס(2-הידרוקסיאתיל)טאורין)Sigma-AldrichB6420
מקור אור LED – LED שחור 385Prizmatix בע"מ
אגרוז, נקודת התכה נמוכה, דירוג אנליטיPromegaV2111

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Kir2 1PIRK

מאמרים קשורים